Manga metilena handokoana DNA sy RNA: fampiasana amin'ny gel sy membrana

Manao elektroforezy amin'ny gel agarose ny mpianatra iray, mandoko azy amin'ny manga metilena, nefa tsy mahita na inona na inona eo amin'ny toerana nantenainy hahitana tarika mazava. Eo amin'ny toeram-piasana manaraka, mandoko membrana Northern amin'ilay tavoahangy manga ihany ny mpikaroka efa nahazo doctorat, ka mahazo tarika ribosomika mazava ao anatin'ny 3 minitra. Mihevitra ilay mpianatra fa tsy nahomby ny gel. Tsy ny gel anefa no tsy nahomby. Samy hafa ireo asa roa ireo, ary ilay loko iray ihany dia mamaly azy ireo amin'ny fahatsapana samy hafa, loko ambadika samy hafa, ary fitsipika samy hafa ho an'ny dingana manaraka.

Mitovy simia ny fandokoana DNA sy ny fandokoana RNA amin'ny manga metilena, fa tsy mitovy tanjona. Ao anaty gel, asehon'ilay loko ny habetsahan'ny asidra nokleika ao anatin'ny rafitra misy mason-kely. Eo amin'ny membrana kosa, asehony raha nahomby ny famindrana sy raha nitovy ny habetsahan'ny santionany nampidirina tamin'ny lalana tsirairay. Rehefa mazava izany fahasamihafana izany, dia mora takarina ny fomba fiasa, ny fetran'ny fitiliana, ary ny fetran'ny fifanarahana.

Ny valiny fohy

Ny manga metilena dia loko kationika manana rafitra fisaka, izay mifatotra amin'ny asidra nokleika amin'ny fatorana tsy kovalenta sady azo averina. Mitambatra amin'izany ny fifanintonana elektrostatika amin'ny fosfata, ny fisosohana eo anelanelan'ny mpivady fototra, ary ny fifatorana ao amin'ny lavaka kely amin'ny heliksa. Io fahafahana mamerina ny fatorana io no zava-dehibe. Azo lokoina ny tarika, jerena amin'ny hazavana hita maso, raketina, ary avy eo esorina ny loko na diovina mba hampiasaina amin'ny klônazy, hibridizasiona, na fitiliana indray amin'ny sondy.

Ho an'ny fandokoana DNA misy kofehy roa amin'ny gel agarose amin'ny manga metilena, ny fangaro haingana mahazatra dia 0.02 percent w/v (200 micrograms isaky ny mL) ao anaty rano, miaraka amin'ny fandokoana mandritra ny 15 minitra eo ho eo sy fanesorana loko amin'ny rano mandritra ny 15 minitra eo ho eo, ary jerena amin'ny boaty hazavana fotsy. Ho an'ny membrana, ny fangaro Northern blot nentim-paharazana dia loko 0.02 hatramin'ny 0.04 percent ao anaty sodium acetate manakaiky ny pH 5.2, fandokoana mandritra ny minitra vitsivitsy aorian'ny famindrana sy famikirana, avy eo fanasana amin'ny rano sy fanesorana tanteraka ny loko alohan'ny hibridizasiona. Antonony ny fahatsapana: nanograms am-polony hatramin'ny an-jatony isaky ny tarika amin'ny gel rehefa tsara ny fepetra, ary ny torolalana mitandrina dia manondro 0.5 hatramin'ny 1 microgram. Ambony ambaratonga maro izany raha oharina amin'ny loko ethidium bromide sy SYBR. Amin'ny membrana, tsy misy fetra tokana mahasoa ho an'ny fitiliana transkripta iray, satria RNA ribosomika betsaka sy ny fitambaran'ny akora nampidirina no tena asehon'ilay loko. Aza mampiasa ranon-tsakafo fanampiny amidy eny an-tsena ho solon'ny loko amin'ireo fangaro ireo. Ny fomba voamarina dia mitaky loko manana kalitao ho an'ny famakafakana, ranoka mpandrindra voafaritra tsara, ary fikarakarana tsy misy RNase rehefa misy RNA.

Ny fomba fifatorana sy ny mety hamitahany

Misy ampahany telo ilay maodely mahasoa. Voalohany, voasinton'ny taolana fosfata misy fiampangana miiba ny rafitra peratra misy fiampangana miabo. Hitan'ny fikarohana spektroskopika fa io fifanintonana elektrostatika io no manjaka rehefa kely ny sira. Ny famolavolana maodely sy ny dinamika molekiolara kosa dia mampiseho fa ny fisosohana eo anelanelan'ny fototra sy ny fifatorana ao amin'ny lavaka kely dia fomba fifatorana marin-toerana amin'ny DNA misy kofehy roa, araka ny fintinina ao amin'ny fanadihadiana spektroskopika momba ny fifatoran'ny manga metilena amin'ny DNA. Faharoa, misy fironana hifamatotra kokoa amin'ny GC: manome tombony ny filaharana CpG sy GpC ny maodely, ary ny andrana dia mitatitra fifatorana kokoa amin'ny rafitra misy kofehy roa manankarena GC ao amin'ny fikarohana momba ny fironan'ny manga metilena amin'ny fisosohana eo anelanelan'ny fototra. Mifatotra aminy koa anefa ny rafitra misy kofehy roa AT. Tsy mifantina filaharana manokana ny fandokoana mahazatra. Fahatelo, ny DNA misy kofehy tokana sy ny RNA dia mifatotra indrindra amin'ny alalan'ny fifanintonana elektrostatika sy ny fifanongoana amin'ny fototra mora idirana ary ny faritra misy kofehy roa. Izany no mahatonga ny hamafin'ny fandokoana hiova arakaraka ny halavana, ny filaharana, ary ny rafitra faharoa.

Misy vokany roa izany. Satria tsy kovalenta ny fifatorana, dia miala amin'ny fanasana ny loko. Malazo haingana ny tarika amin'ny polyacrylamide raha tsy raiketina manokana. Misy fomba manokana famikirana maharitra indrindra satria vonjimaika ny fandokoana mahazatra, araka ny nofaritan'i Soto sy Draper ho an'ny gel PAGE. Satria mpampihetsika amin'ny hazavana ilay loko, dia mety hampisy oksidasiona amin'ny guanine ary amin'ny farany hanapaka kofehy ny fampiharihariana maharitra ny DNA voaloko amin'ny hazavana mahery rehefa misy oksizena. Voazava amin'ny antsipiriany izany ao amin'ny fikarohana momba ny oksidasionan'ny guanine ampirisihin'ny manga metilena amin'ny hazavana. Ny fijerena vetivety amin'ny hazavana fotsy dia misoroka ny fahasimbana fantatra tsara ateraky ny UV amin'ny fomba mahazatra mampiasa ethidium bromide, ary tena tombony izany rehefa hakana DNA hampiasaina indray. Malefaka kokoa ny hazavana hita maso, fa tsy midika hoe tsy manimba. Ataovy fohy ny fampiharihariana amin'ny hazavana raha hatao klônazy ny DNA. Ho an'ny simia vokatry ny hazavana izay manazava io fitandremana io, jereo ny lalana roa amin'ny simian'ny manga metilena vokatry ny hazavana. Ho an'ny mpivady redox sy ny toetry ny fiampangana izay manazava ny antony ifatoran'ny endrika voaoksida fa tsy ifatoran'ny endrika voaredioka, jereo ny simian'ny rafitra sy ny toetran'ny manga metilena.

Asa voalohany: fandokoana ao anaty gel

Fanontaniana iray no valian'ny fandokoana gel: ampy ve ny asidra nokleika ao amin'ity tarika ity mba ho hitan'ny maso? Ny DNA misy kofehy roa ao anaty agarose no tranga voadinika tsara indrindra. Ny fomba fandokoana gel tamin'ny manga metilena tany am-boalohany nataon'i Flores sy ny mpiara-miasa aminy dia nanamarina ny fomba haingana 0.02 percent tamin'ny agarose 1 percent, ary nampiseho fa nahomby ny fakana DNA sy ny klônazy taorian'izay. Hita ao amin'ny pejin'ny vokatra manga metilena an'ny IBI Scientific ihany koa io fomba avy amin'ny mpamatsy io, izay mampiseho mifanila ny fangaro 0.04 percent ho an'ny membrana sy ny fomba haingana ho an'ny gel.

Fomba fiasa azo ampiharina:

1. Ataovy toy ny mahazatra ny elektroforezy amin'ny gel. Lokoina aorian'ny elektroforezy, fa tsy mandritra izany, raha tsy efa voamarina ny famindrana na ny fahafahana manavaka tarika amin'ny fomba novaina.
2. Atsobohy ao anaty manga metilena 0.02 percent w/v amin'ny rano voadio amin'ny distilasiona, ary ahontsano moramora mandritra ny 15 minitra eo ho eo.
3. Esory ny loko amin'ny rano soloina imbetsaka, mandritra ny 15 minitra eo ho eo amin'ny fitambarany, mandra-pihenan'ny loko ambadika ao amin'ny gel ka hisongadina ny tarika.
4. Alaivo sary avy hatrany eo amin'ny fitaovana manazava amin'ny hazavana fotsy.

Tsy mitovy fitondran-tena ny agarose sy ny polyacrylamide. Mitahiry loko ao amin'ny rafiny ny agarose, ka ny fanesorana loko no dingana miadana. Mandray loko haingana ny gel polyacrylamide manify, nefa very loko haingana koa. Manamora ny fanapahana tarika hakana santionany izany, saingy manasarotra ny fitahirizana rakitra maharitra. Azo fantarina amin'ilay fangaro 0.02 percent ihany ao anatin'ny 20 hatramin'ny 30 minitra ny oligonokleotida sintetika ao anaty polyacrylamide, miaraka amin'ny fanasana amin'ny rano miverimberina, araka ny fomba PAGE efa voapetraka amin'ny endrika Current Protocols. Efa nisy tatitra momba ny fangaro tena malemy manakaiky ny 0.0002 percent ao anaty TBE voalevona, ampiasaina mandritra ny ora maromaro amin'ny oligonokleotida hakana santionany, saingy vitsy kokoa ny porofo manohana izany.

Zava-dehibe ny fanavahana DNA sy RNA. Ny DNA misy kofehy roa no manome fifatorana voarafitra matanjaka indrindra. Voaloko koa ny RNA sy ny DNA misy kofehy tokana, saingy malemy kokoa sy sarotra vinaniana kokoa. Ho an'ny gel RNA agarose misy formaldehyde, ny ankamaroan'ny laboratoara dia tsy mandoko manga ao anaty gel, fa mamindra ny RNA amin'ny membrana aloha, ary mandoko azy eo. Izany dia manolo famantarana malemy ao anaty gel amin'ny famantarana mazava kokoa eo amin'ny membrana, sady manome rakitra momba ny habetsahan'ny santionany nampidirina.

Asa faharoa: fandokoana eo amin'ny membrana

Fanontaniana hafa no valian'ny fandokoana membrana: nahomby ve ny famindrana, ary azo ampitahaina ve ny lalana tsirairay? Ny fampiasana nentim-paharazana dia ny fandokoana Northern blot azo esorina nataon'i Herrin sy Schmidt. Tany am-boalohany, loko 0.04 percent tao anaty sodium acetate 50 mM amin'ny pH 5.0 no nampiasaina nandritra ny 2 hatramin'ny 3 minitra, narahin'ny fanasana amin'ny rano. Azo nesorina tamin'ny SDS voalevona tao anaty SSPE ilay loko alohan'ny hibridizasiona.

Toy izao ny fomba maoderina fampiasa betsaka:

1. Afindrao amin'ny nylon na nitrocellulose ny RNA na ny DNA efa nosarahina kofehy, ary raiketo amin'ny fampifatorana amin'ny UV na fanafanana mba tsy ho very mandritra ny fandokoana ilay santionany.
2. Tsy voatery atao fa fahita: lenao amin'ny asidra asetika 5 percent ny membrana mandritra ny 15 minitra eo ho eo.
3. Lokoina mandritra ny 5 hatramin'ny 10 minitra ao anaty manga metilena 0.02 hatramin'ny 0.04 percent amin'ny sodium acetate 0.3 hatramin'ny 0.5 M manakaiky ny pH 5.2.
4. Sasao ary esory amin'ny rano ny loko mandritra ny 5 hatramin'ny 15 minitra, raketo ny vokatra, ary esory ny loko sisa tavela alohan'ny hibridizasiona.

Ny nylon misy fiampangana miabo no tena ampiasaina amin'ny asa Northern. Mety koa ny nitrocellulose amin'ilay fomba mampiasa asidra asetika sy acetate ihany. Ampiasaina ny sary hanamarinana ny famindrana, hampitahana ny tarika 28S sy 18S (na 23S sy 16S ho an'ny RNA bakteria), hanamarihana ny mari-pandrefesana sy ny santionany fenitra, ary hitahirizana rakitra eo ho eo ho an'ny fampitoviana araka ny RNA manontolo. Misy fomba Northern navoaka izay mandrefy ny tarika ribosomika voaloko hanamarinana ny habetsahan'ny santionany nampidirina, anisan'izany ny fikarohana momba ny ronono izay nampiasa tarika ribosomika voaloko tamin'ny manga metilena ho an'ny fampitoviana. Azo jerena amin'izany fomba izany koa ny membrana Southern, saingy efa miorina kokoa ny fampiasana ilay loko hanamarinana ny fampidirana santionany sy ny famindrana amin'ny Northern. Sady sarahina kofehy ny DNA amin'ny Southern alohan'ny famindrana, ka tsy azo ampiharina mivantana aminy ny tarehimarika momba ny fahatsapana amin'ny gel.

Fetran'ny fitiliana sy loko ambadika: izay maha-latsaka ny manga

Natao ho tombantombana ny fampitahana eto ambany. Miankina amin'ny tahan'ny gel, ny sakan'ny tarika, ny fitaovana optika, ary ny fitandremana amin'ny fanesorana loko ny fahombiazan'ny fandokoana. Raiso ho ambaratongan'ny habetsahana ny isa tsirairay, fa tsy ho fepetra ara-teknika raikitra.

Ny fifehezana ny loko ambadika no mamaritra raha azo ampiasaina ilay famantarana antonony. Mahery loko ny loko malalaka, ka ny fanesorana ny loko tsy mifatotra nefa tsy manala ny loko mifatotra no mampisongadina ny tarika. Mahalana no mampitombo fahatsapana ny fampitomboana ny fifantohan'ny loko. Ny fotoana fanesorana loko no tena ampitomboiny. Andramo ny andiana santionany misy fanalefahana misesy amin'ilay gel, membrana, ary fakantsary ampiasaina, ary ny elanelana izay mbola mifanaraka amin'ny habetsahana nampidirina ny hakitroky ny sary natambatra ihany no ampiasao. Azo ampiasaina amin'ny fampitoviana semi-quantitatif ny habetsahan'ny santionany nampidirina ny manga metilena. Tsy fomba fandrefesana quantitativa manana elanelana dinamika malalaka izy, satria miova isaky ny lalana ny fahafahan'ny membrana mitazona santionany, ny fahombiazan'ny famindrana, ny fahafenoan'ny fifatorana, ary ny fanesorana loko.

Fetran'ny fifanarahana: inona no mbola azo atao aorian'ny fandokoana

Efa voaporofo fa azo atao ny klônazy aorian'ny fandokoana manga. Nanapaka tarika agarose voaloko i Flores sy ny mpiara-miasa aminy, naka ny DNA, ary nanao fampifandraisana sy fampidirana azy tao anaty sela. Nitatitra izy ireo fa tsara kokoa ny klônazy noho ny taorian'ny fampiasana ethidium bromide miaraka amin'ny UV. Ny antony azo inoana dia ny fihenan'ny fahasimban'ny hazavana, fa tsy tombontsoa avy amin'ilay loko mihitsy. Ataovy fohy ny fampiharihariana amin'ny hazavana fotsy ary diovy amin'ny fomba mahazatra fanadiovana DNA nalaina avy amin'ny gel ny DNA azo.

Vitsy kokoa ny porofo momba ny PCR sy ny famakiana filaharana. Mifatotra amin'ny asidra nokleika ny loko sisa tavela, ka esory ny loko ary diovy ny santionany alohan'ny dingana mampiasa anzima. Antenaina fa mety ampiasaina ny DNA voadio tsara avy amin'ny gel manga, saingy tsy mbola voarefy tsara ny fandeferan'ny polymerase sy ny simia famakiana filaharana samy hafa amin'ny loko entin'ny santionany mivantana. Aza heverina ho azo antoka izany.

Mifanaraka amin'ny fandokoana ny hibridizasiona blot rehefa arahina hentitra ny filaharana: famindrana, famikirana, fandokoana, firaketana, fanesorana loko, hibridizasiona. Io filaharana io no fomba novolavolain'i Herrin sy Schmidt. Fomba hafa ny fandokoana alohan'ny famindrana na ny tsy fanesorana loko, ka mila fanamarinana manokana. Rehefa nesorina ny loko, dia azo atao toy ny mahazatra ny fanesorana sondy sy ny fitiliana indray amin'ny sondy. Ho an'ny fandokoana eo amin'ny haavon'ny sela amin'io fianakavian-doko io ihany, sy ny antony tsy azo ampiharana amin'ny sela velona ny fomba ampiasaina amin'ny sosona sela efa raikitra, jereo ny atlasy momba ny fandokoana amin'ny mikroskopy.

Azo atao ny manapaka tarika amin'ny agarose hakana santionany sy amin'ny oligonokleotida PAGE hita amin'ny loko manga, raha tsy ampiasaina ilay fomba famikirana maharitra. Azo inoana ara-tsimia fa mety ny fakana santionany amin'ny alalan'ny herinaratra aorian'ny fanesorana loko, satria azo averina ny fatorana. Vitsy anefa ny angona voafehy momba ny taham-pahazoana santionany manokana amin'ny manga metilena. Esory ny sira na ampandatsaho ho antsanga ny santionany aorian'ny famoahana azy.

Olana miverimberina

Matetika ny tarika malemy amin'ny gel no midika fa kely loatra ny habetsahan'ny akora ho an'ny fandokoana hita amin'ny loko, indrindra ho an'ny DNA fohy misy kofehy tokana na RNA. Ampitomboy ny santionany ampidirina, mampiasà loko vaovao, halavao aloha ny fotoana fandokoana alohan'ny hampitomboana ny fifantohana, ary atsaharo aloha kokoa ny fanesorana loko. Raha manga manontolo ny gel nefa tsy misongadina ny tarika, dia matetika fandokoana tafahoatra na fanoloana rano tsy ampy no antony. Vokatry ny simia andrasana ny fahalazoan'ny tarika PAGE, fa tsy fandokoana tsy nahomby. Alaivo sary haingana. Ny loko ambadika tsy mitovy amin'ny membrana dia manondro vala, bolongan-drivotra, dian-tanana, fihontsana tsy mitovy, na famindrana tsy mitovy amin'ny faritra tsirairay. Aza raisina ho porofon'ny habetsahan'ny santionany tsy mitovy izany raha tsy misy fanaraha-maso amin'ny hibridizasiona. Ny lamina ribosomika malemy sy miparitaka dia mety manondro fahasimban'ny RNA, nefa mety ho famindrana tsy feno koa, RNA manontolo kely loatra (matetika micrograms vitsivitsy hatramin'ny am-polony no ao amin'ny lalana iray), na fanesorana loko tafahoatra. RNA ribosomika betsaka no asehon'ilay loko. Tsy mampiseho transkripta manokana izy. Ny sondy no manao izany asa izany.

Fiarovana sy fikarakarana tsy misy filazana tafahoatra

Mora karakaraina kokoa noho ny ethidium bromide ny manga metilena, saingy tsy midika izany fa tsy mampidi-doza izy. Ny taratasy momba ny fiarovana an'ny MilliporeSigma amin'izao fotoana izao dia manasokajy ilay loko ho poizina mahery amin'ny fihinanana, Sokajy 4, manimba raha atelina. Tokony hariana amin'ny lalam-panariana fako ekena izy, araka ny SDS manga metilena an'ny Sigma-Aldrich. Misy fampitandremana mahery kokoa momba ny mety hanimba fototarazo ny ethidium bromide, anisan'izany ny ahiahy momba ny fiantraikany amin'ny sela fananahana ao amin'ny SDS ethidium bromide an'ny Sigma-Aldrich. Matetika atokana ho fako simika mampidi-doza ny gel sy ny ranoka misy azy, araka ny voamarika ao amin'ny torolalana Thermo Fisher momba ny loko ho an'ny asidra nokleika. Araho ny SDS sy ny fitsipiky ny toeram-piasana ho an'izy roa ireo. Tehirizo maina sy mihidy tsara ny loko maina, aza averina ampiasaina ny ranoka fandokoana raha tsy araka izay eken'ny fomba fiasa, tehirizo maina eo anelanelan'ny taratasy sivana ny membrana voaloko, ary alaivo sary ny gel alohan'ny hiparitahan'ny tarika.

Tsarovy ilay fehezanteny ho an'ny latabatra laboratoara. Ny gel dia mitsapa raha hita amin'ny hazavana fotsy ny santionany betsaka. Ny membrana dia mitsapa ny famindrana sy ny fampidirana santionany alohan'ny hanaovan'ny sondy ny asa mitaky fahatsapana ambony. Loko iray no ampiasaina amin'izy roa, miaraka amin'ny fahatsapana antonony, fifatorana azo averina, ary filaharan'ny dingana tsy maintsy arahina hentitra.