Fandrefesana ny vokatry ny manga metilena eo amin'ny mitokondria: oksizena, ATP, ary potansialin'ny fonontselana

Aoka hatao hoe misy laboratoara manampy manga metilena amin'ny mitokondria manana fahasembanana amin'ny fiasan'ny taovam-pisefoana, ary mahita fa mitombo ny fanjifana oksizena. Ny fehezanteny toa ho azy indrindra hosoratana dia hoe namerina ny fiasan'ny mitokondria ilay loko. Mety ho diso anefa izany fehezanteny izany. Hevitra telo samy hafa ny fikorianan'ny oksizena, ny famokarana ATP, ary ny potansialin'ny fonontselana. Iray ny organely iasan'izy ireo, tahaka ny fitahirizana tahiry fiarovana, ny fampifanarahana, ary ny fizarana izay samy mampiasa lahatahiry iray ao amin'ny rahona: mifandray izy ireo, nefa samy fehezin'ny fitsipika hafa. Raha afangaro ny iray sy ny iray hafa dia diso ny fandikana ny vokatra, na dia marina ara-teknika aza ny fandrefesana rehetra.

Mampitombo ny mety hisian'izany fifangaroana izany ny manga metilena satria mandray anjara ao amin'ilay rafitra refesina izy. Mivezivezy ao anatin'ny tsingerin'ny redôksa izy, mandray elektrôna eo aloha ary manome azy eo aoriana ao amin'ny rojo; katiôna tia lipida izay miangona ao amin'ny mitokondria manana angovo izy; ary akora manga mahery loko izay mitroka sy mamoaka hazavana ao amin'ireo faritra spektraly ampiasain'ny sonda mahazatra ihany. Tsy mahavita mitondra izany rehetra izany ny fandrefesana tokana. Ny fomba azo itokisana, araka ny hita tamin'ireo fanadihadiana momba ny mitokondria natao tany Budapest, dia ny fandrefesana miaraka ny fikorianan'ny oksizena, ny tahan'ny famokarana ATP, ny potansialin'ny fonontselana, ary ny famoahana perôksida hidrôzenina, miaraka amin'ny fanaraha-maso manokana ho an'ilay loko isaky ny dingana.

Ny respirometria dia mandrefy ny fikorianan'ny oksizena, fa tsy ny angovo vokarina

Zavatra iray ihany no taterin'ny respirometria avo famahana, na amin'ny Oroboros Oxygraph izany na amin'ny mpandalina fikorianana ivelan'ny sela Seahorse: ny hafainganam-pandehan'ny reduksiônan'ny oksizena. Tsy tateriny ny isan'ny prôtôna nafindra isaky ny elektrôna, ny habetsahan'ny gradienina voatahiry, na ny hoe nampiasain'ny ATP synthase izany na tsia.

Zava-dehibe ny voambolana. Ao amin'ny mitokondria natokana, ny sobstrà tsy misy ADP dia manome fisefoana mifandray amin'ny fivoahan'ny prôtôna; ny sobstrà miaraka amin'ny ADP mahavoky dia manome ny fahafahan'ny fôsfôrilasiôna ôksidativa; ary ny fampitomboana tsikelikely ny akora manasaraka ny fifandraisan'ny fisefoana sy ny famokarana ATP dia manome ny fahafahana ambony indrindra mamindra elektrôna. Ao amin'ny sela tsy novaina kosa, ireo fandrefesana mitovy amin'izany amin'ny Seahorse dia ny fisefoana fototra, ny fisefoana mifandray amin'ny ATP izay mora voasakan'ny oligomycin, ny fivoahan'ny prôtôna, ny fisefoana ambony indrindra voafaritry ny FCCP, ary ny fanjifana oksizena tsy avy amin'ny mitokondria izay mahatohitra rotenone sy antimycin. Ny fiantsoana ny vokatra avy amin'ny Seahorse hoe State 3 sy State 4 dia manome azy fahamarinan-toetra tsy tohanan'ilay santionany voaomana, araka ny hazavain'ny rafitry ny Agilent Mito Stress Test.

Tapahin'ny manga metilena ilay fifandraisana toa mandeha ho azy eo amin'ny oksizena betsaka kokoa sy ny angovo betsaka kokoa. Tao amin'ny mitokondria natokana avy amin'ny atidohan'ny kisoa Ginea, ny loko 100 nM ka hatramin'ny 1 uM dia nampitombo ny fanjifana oksizena amin'ny toe-pialan-tsasatra, niaraka tamin'ny sobstrà glutamate sy malate, succinate, ary alpha-glycerophosphate. Nahatratra 64 isan-jato teo ho eo ny fitomboana tamin'ny alpha-glycerophosphate, nefa saika tsy niova ny fisefoana namporisihin'ny ADP tao amin'ny mitokondria salama, araka ny fanadihadiana momba ny mitokondria natokana avy amin'ny atidoha. Satria nitombo ny fisefoana mifandray amin'ny fivoahan'ny prôtôna nefa tsy niova ny fikorianana namporisihin'ny ADP, dia mihena ny tahan'ny fanaraha-maso ny fisefoana kajina. Tsy midika izany fihenana izany fa nanimba ny mitokondria ilay loko. Midika kosa izany fa nanampy tsingerin'ny redôksa mandany oksizena teo ambonin'ny fisefoana ara-dalàna ilay loko. Ny fitiliana fanjifana oksizena amin'ny manga metilena izay mitatitra ny fitomboana ihany dia nandrefy fihetsika simika tena nisy, saingy tsy nilaza na inona na inona momba ny fitahirizana angovo.

Hita amin'ny ambaratonga lehibe kokoa ihany koa izany elanelana izany amin'ireo fanandramana famerenana ny fiasana. Rehefa voasakana ny Kompleksa I, dia tafaverina ho telo heny teo ho eo ny fikorianan'ny oksizena, fa ny famokarana ATP kosa tafaverina ho 1.5 heny eo ho eo ihany. Oksizena betsaka kokoa no tonga teo amin'ny elektrôda. Kely kokoa tamin'izany no nampiasaina hamokarana ATP. Izay filazana fanatsarana ny fôsfôrilasiôna ôksidativa dia mila ny lafiny ATP amin'ny fandanjalanjana, ary tsara raha aseho ho tahan'ny ATP isaky ny oksizena izany, miaraka amin'ny fanazavana ny fomba namaritana ny mpizara.

Ny fitiliana ATP dia mandrefy ny tahan'ny famokarana, izay tsy azo soloina amin'ny habetsahan'ny ATP misy

Fanontaniana hafa no valian'ny fitiliana ATP: ohatrinona ny ATP vokarina isaky ny fe-potoana. Ny fandrefesana kinetika, na amin'ny fanaraha-maso mandritra ny minitra maro ny hazavana avoakan'ny luciferase avy amin'ny angamenavava, na amin'ny fitiliana enzimatika mampifandray hexokinase sy glucose-6-phosphate dehydrogenase izay vakina amin'ny 340 nm, dia manome taha. Ny fandrefesana tokana ny ATP manontolo amin'ny teboka farany kosa dia manome ny habetsahana misy, izay maneho ny famokarana nesorina ny fanjifana, ary tsy milaza firy momba ny fôsfôrilasiôna ôksidativa raha ampiasaina irery.

Nampiasa ilay fomba enzimatika mifandray ny vondrona tany Budapest, sady nanakana ny adenylate kinase. Hitan'izy ireo fa ny manga metilena 1 ka hatramin'ny 2 uM dia nampitombo ny famokarana ATP tamin'ny mitokondria nasiana rotenone sy tamin'ireo nasiana antimycin, tamin'ny fitomboana kely nefa manan-danja ara-statistika. Tena famerenana ny fiasana izany, saingy ampahany ihany. Nahazo valiny mitovy endrika tamin'ny maodely hafa ny fanadihadiana momba ny poizin'ny TEGDMA: ny mônômera nify TEGDMA 5 mM dia nampidina be ny fisefoana mifandray amin'ny Kompleksa I, avy amin'ny 286 teo ho eo ho 28 vondrom-pandrefesana fikorianana, ary ny loko 2 uM dia namerina izany ho 86 teo ho eo.

Misy fanaraha-maso roa tsy azo ialana rehefa mampiasa akora miloko mandray anjara amin'ny redôksa. Voalohany, ampiasao ny oligomycin mba hamaritana hoe ohatrinona amin'ny famokarana ATP refesina no miankina amin'ny ATP synthase. Faharoa, manaova fitsapana tsy misy sela hijerena ny famerenana amin'ny fandrefesana ny ATP nampiana: ATP fantatra habetsahana, miaraka amin'ny reagenta feno sy ireo fifantohan'ilay loko tena nampiasaina, ka farafahakeliny 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM, ary 2 uM. Mety hitroka ny hazavana avoaka ilay loko, hanakana ny anzima mpitatitra, na hanova ny simian'ny redôksa ao amin'ny reagenta. Ny torolalana ankapobeny momba ny fitiliana luciferase dia manoro fitsapana biôsimika fanampiny hamantarana io karazana fitsabahana io indrindra. Aza mihevitra fa tsy misy vokatra sandoka ny 1 uM satria mazàna mafy kokoa amin'ny fifantohana ambony kokoa ny famonoana ny fluoresansa.

Ny sondan'ny potansialin'ny fonontselana dia mandrefy ny fizaran'ny loko, fa tsy ny fikorianana

Ny Safranine O, TMRM sy TMRE, rhodamine 123, ary JC-1 dia samy katiôna afaka mamakivaky fonontselana. Miangona ao amin'ny matriksa manana vesatra elektrika miiba izy ireo araka ny fifandanjana elektrôsimika. Noho izany, ny fluoresansa ankapobeny dia maneho ankolaka ny potansialy amin'ny alalan'ny toerana misy ny sonda. Tsy misy amin'izy ireo mandrefy ATP na fikorianan'ny elektrôna.

Samy manana ny karazana santionany voaomana sahaza azy ny sonda tsirairay. Ny Safranine O dia sahaza ny mitokondria natokana sy ny sela natao ho azo idirana, matetika amin'ny fifantohana manodidina ny 2 uM, miaraka amin'ny fampientanana manodidina ny 495 nm sy famoahana hazavana manodidina ny 585 nm. Miasa amin'ny fomba misy famonoana fluoresansa izy, ka manova ny fluoresansa ankapobeny ny fidirany ao amin'ny mitokondria. Ny TMRM sy TMRE dia sahaza ny sela tsy novaina rehefa ampidirina amin'ny fifantohana nanomôlara ambany, amin'ny fomba tsy misy famonoana fluoresansa. Amin'izany, ny fahaverezan'ny pôlarizasiôna dia mamoaka ilay loko ary mampihena ny fluoresansan'ny mitokondria; raha betsaka kosa ny loko ampidirina dia mety hivadika ny fitodihan'ny famantarana noho ny famonoan'ilay loko ny fluoresansany manokana. Manome tahan'ny maitso amin'ny mena mora ampiasaina ny JC-1, saingy miankina amin'ny habetsahan'ny loko ampidirina sy ny habetsahan'ny mitokondria izany, ka tsy matanjaka tahaka ny TMRM voafehy tsara amin'ny asa fandrefesana habetsahana. Voafintina ao amin'ny lahatsoratra famerenana momba ny sondan'ny potansialin'ny fonontselan'ny mitokondria, izay ampiasaina betsaka, ireo tombony sy fetrany ireo.

Mitsabaka amin'ny fandrefesana ôptika ny manga metilena amin'ireo fifantohana ampiasaina mihitsy. Mifanindry amin'ny famoahana hazavana mena avy amin'ny sonda ny faritra fitrohana hazavana ao aminy, manodidina ny 600 ka hatramin'ny 665 nm. Noho izany, samy mety hitranga ny vokatry ny sivana anatiny, ny famonoana fluoresansa, ary ny fitrohana ny hazavana fampientanana. Katiôna faharoa tia lipida koa ilay loko, ary miova arakaraka ny potansialy refesina ny fizarany. Ny fiarovana dia ny fampiasana fandrefesana mifameno sy santionany banga: sonda irery, loko irery, sonda miaraka amin'ny fifantohan'ilay loko tsirairay, fanesorana tanteraka ny pôlarizasiôna amin'ny FCCP ho teboka fanondroana aotra, ary raha azo atao, sonda faharoa manana toetra ôptika hafa. Nametraka izany fomba izany ny fanadihadiana momba ny lalana misongona ny Kompleksa III, tamin'ny famerenana ny fandrefesana ny potansialin'ny fonontselana tamin'ny safranine O sy TMRM, taorian'ny fanakanana tamin'ny antimycin sy myxothiazol, ka nahazo famerenana ny fiasana nitovy endrika. Famantarana manoro lalana ny mpitatitra ôptika iray. Porofo kosa ny mpitatitra roa mahaleo tena.

Karazana santionany telo, fanontaniana telo samy hafa

Ny mitokondria natokana, ny sela natao ho azo idirana, ary ny sela tsy novaina dia tsy toe-javatra fanitsiana fahatsapana azo ifanakalozana amin'ny fitiliana iray. Fomba telo samy hafa izy ireo, samy manana ny fitsipika fiasany.

Ny mitokondria natokana dia mitahiry ny rojo fitaterana elektrôna, ny fonontselana anatiny, ary ny rafitra miasa ao amin'ny matriksa, sady manaisotra ny fonontselan'ny sela, ny sitôzôla, ary ny firafitry ny tambajotra. Izany fanesorana izany indrindra no tanjona: voafaritra mazava ny sobstrà, ny ADP, ny akora manakana, ary ny fifantohan'ny loko, ka azo faritana ny lalan'ny fihetsika. Ny tambin'izany dia ny fahaverezan'ny famatsiana sobstrà voajanahary, ny fampitana famantarana, ary ny filàna angovo.

Ny sela natao ho azo idirana dia mitazona ny mitokondria ao anatin'ny ampahany betsaka amin'ny firafitry ny sela, sady mamela ny sobstrà sy ADP avy any ivelany hiditra amin'ny fonontselan'ny sela nosokafana. Izy ireo no fitaovana sahaza hamantarana fahasembanana amin'ny lalan'ny sobstrà ao anatin'ny tontolon'ny sela. Ny fanaovana azy ho azo idirana tafahoatra dia manimba ny fonontselana ivelan'ny mitokondria, ary voasasa hiala ny fanaraha-maso avy amin'ny sitôzôla.

Ny sela tsy novaina dia mitahiry ny zava-drehetra: ny sakana ateraky ny fonontselan'ny sela, ny akora mampihena ao amin'ny sitôzôla, ny fitaterana sobstrà avy ao anatiny, ny tambajotran'ny mitokondria, ary ny filàna ATP. Izy ireo no akaiky indrindra ny toe-batana voajanahary ary lavitra indrindra amin'ny famaritana ny mekanisma, satria ny fidiran'ny loko, ny reduksiônany, ary ny fanagadrana azy ao amin'ny faritra samihafa dia samy mamaritra ny habetsahan'ny loko tena mahatratra ny mitokondria.

Nampiasa an-tsitrapo ireo ambaratonga telo ireo ny fanadihadiana TEGDMA: mitokondria natokana avy amin'ny atidoha mba handrefesana ny famerenan'ilay loko ny ôksidasiôna sy ny potansialy; sela fototra avy amin'ny pulpan'ny nify natao ho azo idirana, indrindra mba hamantarana fa eo amin'ny ôksidasiônan'ny sobstrà mifandray amin'ny Kompleksa I ilay fahasembanana; ary sela fototra tsy novaina mba hijerena ny vokatra ankapobeny ara-pisiôlôjia ateraky ny loko 2 uM eo amin'ny fanjifana oksizena voasakana. Ho an'ny mpamaky mampitaha fandrefesana mitokondria amin'ireo karazana santionany ireo, ny lahatsoratra fanazavana miaraka aminy momba ny fomba amindran'ny manga metilena elektrôna ao amin'ny rojo fisefoana dia manome ny fototra momba ireo lalana, ary ny torolalana famakiana fanadihadiana momba ny fisefoana amin'ny manga metilena dia manazava ny lojikan'ny habetsahana ampiasaina sy ny akora manakana.

Fanaraha-maso takin'ny loko mandray anjara amin'ny redôksa

Mila lisitra fanaraha-maso lava kokoa noho ny akora manakana mahazatra ny akora mivezivezy ao anatin'ny tsingerin'ny redôksa, satria mety hitovy amin'ny fizotran-javatra biôlôjika ny fihetsika simikan'ilay loko irery.

Ho an'ny respirometria, ampiasao efitra misy vahaolana tampôna irery hanaraha-maso ny fiovan'ny famantarana tsikelikely; efitra misy tampôna sy loko nefa tsy misy akora biôlôjika; loko miaraka amin'izay akora mampihena ivelan'ny sela misy ao amin'ny fitiliana; ary rotenone sy antimycin amin'ny farany mba hamaritana ny fanjifana oksizena tsy avy amin'ny mitokondria ao amin'ny sela tsy novaina. Mariho fa miverina mandalo ôksidasiôna ny loko efa nandalo reduksiôna, amin'ny famindrana elektrôna amin'ny oksizena mba hamorona perôksida hidrôzenina. Noho izany, ny santionany banga misy loko irery nefa tsy misy mpanome elektrôna dia manombana ambany loatra ny fanjifana oksizena tsy misy sela izay miseho rehefa misy NADH na NADPH azo ampiasaina.

Ho an'ny perôksida hidrôzenina, aleo mampiasa Amplex UltraRed efa voakalibra miaraka amin'ny peroxidase avy amin'ny horseradish, fa tsy loko DCFDA tsy mifantina. Hamarino amin'ny catalase, ary andramo ny fiankinany amin'ny hazavana, satria mampitombo ny fahatsapana amin'ny hazavana ilay loko. Hitan'ny fanadihadiana momba ny mitokondria avy amin'ny atidoha fa nitombo mihoatra ny efatra heny ny enta-perôksida tamin'ny loko 100 nM monja, sady nihena ny hafainganam-panesorana azy. Niforona mivantana avy amin'ny loko nandalo reduksiôna ilay perôksida, tsy nandalo akora mpanelanelana superoxide. Ny antsipiriany momba ny fifidianana sonda sy ny fanaraha-maso ny hazavana dia ao amin'ilay lahatsoratra miaraka aminy momba ny fandrefesana karazana oksizena mora mandray anjara amin'ny fihetsika simika amin'ny fanandramana mampiasa loko. Ny fanontaniana mivelatra kokoa momba ny fotoana iasan'ny perôksida ho famantarana na ho enta-mavesatra kosa dia dinihina miaraka amin'ny fifandanjan'ny redôksa ao amin'ny sela sy ny filazana momba ny antiôksidanta.

Ho an'ny filazana momba ny lalan'ny fihetsika, andramo ireo toerana roa fanakanan'ny Kompleksa III: antimycin A eo amin'ny toerana Qi sy myxothiazol eo amin'ny toerana Qo, ary koa teboka farany ao amin'ny Kompleksa IV amin'ny alalan'ny cyanide. Nisy fanadihadiana teo aloha tamin'ny atidohan'ny totozy nilaza fa namerina ny fisefoana voasakan'ny rotenone ilay loko, fa tsy ilay voasakan'ny antimycin. Ny fanadihadiana tatỳ aoriana tamin'ny karazana biby telo kosa dia nahita famerenana ampahany tamin'ireo akora manakana roa, ary porofo momba ny reduksiôna mivantana an'ny cytochrome c. Raiso ho mifanaraka amin'ny angona vaovao ilay lalana misongona, fa tsy ho zavatra efa voaporofo tanteraka, satria samy manova ny lalana hita ny fifantohan'ny loko, ny toerana iasan'ny akora manakana, ny toetry ny sobstrà, ary ny fizaran'ny loko.

Tabilao fifidianana fitiliana

Ampiasao ity tabilao ity hisafidianana ny fandrefesana araka ny fanontaniana, fa tsy ny mifanohitra amin'izany.

Ny filazana maharesy lahatra farafahakeliny dia mampiasa ireo fifantohan'ny loko mitovy, 100 nM, 300 nM, 1 uM, ary 2 uM, handrefesana ny fikorianan'ny oksizena amin'ny toe-javatra misy fivoahan'ny prôtôna, ADP, oligomycin, ary akora manasaraka ny fifandraisan'ny fisefoana sy ny famokarana ATP; ny tahan'ny famokarana ATP; ny potansialin'ny fonontselana, tsara raha amin'ny sonda roa; ary ny famoahana perôksida efa voakalibra, miaraka amin'ny catalase sy fanaraha-maso tsy misy sela. Tatero ilay andiana fandrefesana mifandray: fikorianan'ny oksizena sy tahan'ny ATP sy ATP isaky ny oksizena sy potansialy sy perôksida. Ny iray amin'ireo isa ireo raha mijoro irery dia fandrefesana mbola mitady heviny.