Fandrefesana ny karazana oksizenina mora mihetsika amin'ny andrana mampiasa manga metilena

Misy laboratoara roa samy manao andrana izay antsoiny hoe andrana momba ny fiarovan'ny manga metilena amin'ny ôksidasiona. Ny iray mitatitra fa mampihena ny karazana oksizenina mora mihetsika ilay loko. Ny iray kosa mitatitra fa mamokatra azy ireo ilay loko. Samy mampiseho fiolahana mazava momba ny fiovan'ny valiny arakaraka ny fatra izy ireo. Samy manao tatitra amim-pahatsorana. Tsy hosoka na tsy fahaiza-manao no mahatonga ny fahasamihafana. Ny antony dia ny fandrefesan'ireo vondrona roa zavatra samy hafa, tao anatin'ny hazavana samy hafa, tamin'ny mpamantatra mamaly fanontaniana samy hafa, ary avy eo ny famaritany ireo valiny roa tamin'ny teny iray ihany: ROS.

Sarotra refesina araka ny tokony ho izy ny manga metilena satria mandray anjara amin'ilay fihetsika simika izay tokony hojerena amin'ny alalany izy. Ao anaty haizina, dia mampita elektrôna eo amin'ny mpanome sy ny mpandray izy, ary miverina amin'ny endriny voalohany, vonona hanomboka tsingerina indray. Rehefa tratran'ny hazavana izy dia lasa mpanentana fihetsika simika amin'ny alalan'ny hazavana, ka tonga amin'ny toetra triplet voaentana izay ahafahany mamindra angovo amin'ny oksizenina mba hamokarana oksizenina singlet, na mamindra elektrôna mba hamokarana radikaly sy peroksidan'ny hidrôzenina. Izay mpamantatra apetraka ao anatin'io rafitra io dia mety ho tratran'ny ôksidasiona, fampihenana simika, fanjavonan-doko, na fanafenana optika avy amin'ilay loko mihitsy. Noho izany, ny fanontaniana voalohany amin'ny fandrefesana ROS dia tsy hoe firy ny isa azo. Fa hoe inona marina no hitan'ilay fitsapana, ary inona no ataon'ilay loko amin'ilay fitsapana.

Amplex Red: fitsapana peroksidan'ny hidrôzenina voakalibra

Ny fampiarahana manga metilena sy Amplex Red no azo tohanana indrindra amin'ny porofo ao anatin'ireo fikarohana ireo, rehefa voaomana tsara. Voafaritra tsara ny fihetsika simika: mampiasa peroksidan'ny hidrôzenina ny perôksidazy avy amin'ny horseradish mba hanaovana ôksidasiona ny sobistrà Amplex ka hamokatra resorufin, vokatra mamoaka fluôresansy, amin'ny tahan'ny stôkiômetria eo ho eo amin'ny iray amin'ny iray. Lasa fluôresansy ao amin'ny fitaovana mpamantatra ny peroksida avy amin'ny santionany. Tsy misy karazana hafa ao amin'ny fianakaviana ROS mahazatra mampandeha mivantana io fihetsika io.

Ny kalibrasiona no tombony lehibe indrindra. Ny mpikaroka mitandrina dia mampiasa santionany fenitra misy peroksida fantatra fatra, ao amin'ny vahaolana mpandrindra pH iray ihany, miaraka amin'ny tahan'ny perôksidazy sy sobistrà iray ihany, ny faharetan'ny fampitomboana fihetsika iray ihany, ary ny fikirana optika iray ihany, dia mampitaha ny santionany amin'ilay fiolahana azo. Tao amin'ny fikarohana tamin'ny mitôkôndrian'ny atidoha nosarahina izay fototr'ity fomba ity, dia izany indrindra no nataon'ny mpanoratra: nampiana peroksida fantatra fatra tamin'ny faran'ny fitsapana tsirairay. Notaterina ho tahan'ny famokarana amin'ny picomoles isa-minitra isaky ny milligram proteinina ny isa, fa tsy amin'ny singa fluôresansy tsy misy fototra voafaritra. Izany no manova famirapiratana ho fandrefesana.

Misy antsipiriany telo amin'io fikarohana io mendrika halain-tahaka. Voalohany, nanamarina ny famantarana tamin'ny katalazy, izay mandrava peroksida, ny mpanoratra. Nitsahatra ny fiakaran'ny fluôresansy nateraky ny manga metilena rehefa nampiana katalazy, ka nanamarina fa peroksida no nahatonga ilay famantarana fa tsy vokatra optika sandoka. Faharoa, nosedrainy mivantana ny fiantraikan'ny hazavana tamin'ny fanakatonana misesisesy ny tara-pahazavana manentana, ka nahazo ny ampahavalon'ny fatran'ny hazavana mahazatra ny santionany, ary sivy isan-jato monja no nihena ilay famantarana. Maherin'ny sivifolo isan-jaton'ny peroksida notateriny no tsy niankina tamin'ny hazavana nampiasaina nandrefesana. Fahatelo, norefesiny misaraka tamin'ny elektrôda ny fanesorana peroksida, ka hitany fa sady nampitombo ny famokarana ilay loko no nampiadana ny fanesorana. Ny mpamantatra izay tsy mitatitra afa-tsy ny fluôresansy sisa tavela dia ho nampifangaro ireo vokatra roa ireo.

Mbola misy fomba mety hampivadika ny valin'ilay fitsapana, ary maromaro amin'ireo no ateraky ny manga metilena. Mitroka hazavana amin'ny faritra mena midadasika izay amoahan'ny resorufin hazavana ihany ilay loko, ka rehefa avo ny tahan'ilay loko dia mety hanafina ny famantarany manokana ny santionany noho ny vokatry ny sivana anatiny. Tokony hitovy amin'ny ao amin'ny santionany àry ny tahan'ilay loko ao amin'ny santionany fenitra. Mety hiharan'ny ôksidasiona vokatry ny hazavana samirery koa ny Amplex Red, ary ny resorufin vokariny dia mety hiditra amin'ny tsingerina redox entin'ny hazavana izay mamokatra superoksida sy peroksida. Tena zava-dehibe izany rehefa manazava akora mpanentana fihetsika simika amin'ny hazavana koa ilay andrana. Ny vahaolana azo ampiharina dia ny fanazavana aloha ny santionany misy manga metilena, ary avy eo ny fitsapana ampahany amin'ireo santionany amin'ny akora Amplex ao anaty haizina, fa tsy fanazavana miaraka ny loko sy ny mpamantatra. Farany, tsy mampihena fotsiny ny famantarana Amplex ny superoksida dismutazy: mety hampitombo azy ny famadihana superoksida ho peroksida. Tsy midika ho tsy fahombiazan'ny fitsapana ny fitomboan'ny fluôresansy amin'ny fanaraha-maso mampiasa SOD. Manondro izany fa karazana mialoha ny peroksida ao amin'ny fizotry ny fihetsika ny superoksida.

DCFDA: famantarana ôksidasiona tsy mifantina

Ny fampiarahana manga metilena sy DCFDA no loharanon'ny ankamaroan'ny fifanjevoana. Ny DCFH-DA dia akora mialoha izay ampidirina ao amin'ny sela. Esorin'ny esterazy ao anatin'ny sela ireo vondrona asetata ao aminy, ka tavela ny DCFH tsy mamoaka fluôresansy, ary ny ôksidasiona amin'ny DCFH no mamokatra DCF mamoaka fluôresansy. Lava ny lisitry ny akora afaka manao ôksidasiona azy: radikaly hydroxyl, akora mpanelanelana avy amin'ny perôksidazy sy heme, dioksidan'ny azota, asidra hypochlorous, ary radikaly avy amin'ny peroxynitrite. Tsy manao ôksidasiona azy mivantana amin'ny hafainganam-pandeha azo ampiasaina ny peroksidan'ny hidrôzenina irery; amin'ny ankapobeny, mila vy, proteinina misy heme, na fihetsika simika involving perôksidazy ny fluôresansy miankina amin'ny peroksida.

Ny tsikera tokony hotanisain'ny fizarana momba ny fomba rehetra dia avy amin'ny famakafakan'i Kalyanaraman sy ireo mpiara-miasa aminy ny DCFH ho mpamantatra, araka ny famintinana ao amin'ny fikarohana momba ny mitôkôndrian'ny atidoha izay nandà ny DCFDA noho io antony io. Nasehon'izy ireo fa miadana ny fihetsik'ilay loko, tsy voafaritra ny stôkiômetriany, tsy misy kalibrasiona manan-kery, ary mihetsika amin'ny akora tsy ROS koa izy. Manamafy izay refesiny koa ilay mpamantatra: ny ôksidasiona amin'ny DCFH amin'ny alalan'ny fanesorana elektrôna iray dia mamokatra radikaly DCF izay mihetsika amin'ny oksizenina mba hamokarana superoksida, ary io kosa dia mandalo dismutasiona ka manampy peroksida. Ny fandrefesana dia mamorona ampahany amin'ilay fihetsika simika tatateriny.

Tsy mahatonga ny DCFDA ho tsy ilaina izany rehetra izany. Midika kosa izany fa fitaovana fitsirihana voalohany izy, fa tsy fitaovana hamantarana akora. Ny fiakaran'ny fluôresansy DCF dia midika fa nitombo ny ôksidasionan'ilay mpamantatra miankina amin'ny akora mpanao ôksidasiona. Tsy midika izany fa nitombo ny peroksida, ary indrindra tsy midika fa nitombo ny ROS manontolo, satria tsy misy mpamantatra tokana mandrefy izany habetsahana izany. Ny fikarohana taloha momba ny manga metilena izay niantehitra tamin'ny ôksidasiona DCF tamin'ny taha mihoatra ny iray micromolar dia nitatitra vokatra mamporisika ôksidasiona, fa ny rafitra hafa tamin'io vanim-potoana io kosa nitatitra fiarovana amin'ny fahafatesan'ny sela ateraky ny peroksida. Mety samy ho marina ireo fandinihana roa ireo amin'ilay loko iray ihany ao anatin'ny toe-javatra redox samy hafa, ary ny valin'ny DCF irery dia tsy afaka milaza hoe iza amin'ireo akora mpanao ôksidasiona no nitondra ilay famantarana. Ny maha-zava-dehibe ilay fikarohana taloha momba ny mitôkôndrian'ny atidoha dia ny nanoloany io fitsirihana voalohany io tamin'ny fandrefesana peroksida voakalibra, ka nahitany mivantana ny fitomboan'ny peroksida: na loko zato nanomolar monja aza dia nampitombo imbetsaka ny famoahana peroksida tamin'ny sobistrà sy ny toe-pisefoana rehetra nosedraina.

Misy fandrika iray hafa manokana amin'ny manga metilena ny DCFDA. Tena mahery loko sady mandray anjara amin'ny redox ilay loko, ka afaka mampanjavona fluôresansy, mampihena ny hazavana avoaka, na manao ôksidasiona ny akora mpamantatra tsy miankina amin'ny ROS ao amin'ny sela. Tsy fanampiny azo ialana ny fitsapana fanaraha-maso tsy misy sela, misy loko sy mpamantatra ihany. Io no andrana milaza aminao raha mifandray mivantana amin'ny mpamantatra ilay loko.

Famandrihana spin sy fanjifana oksizenina: karazana akora sy tahan'ny fizotrany

Raha milaza ny mpamantatra mamoaka fluôresansy fa nisy zavatra azo anaovana ôksidasiona niseho, ny rezonansan'ny spin elektrônika miaraka amin'ny akora mpamandrika spin kosa dia manome vaovao akaiky kokoa ny hoe inona ilay zavatra. Ny fikarohana fototra momba ny fihetsika simikan'ny manga metilena eo ambanin'ny hazavana dia nampiasa ESR hamantarana ny radikaly askorbata avy amin'ny loko, askorbata ary hazavana, avy eo nampiseho ny fiforonan'ny peroksida tamin'ny andrana fanjifana oksizenina sy ny fiforonan'ny radikaly hydroxyl notafaingan'ny vy tamin'ny andrana famandrihana spin. Samy namaly fanontaniana tsy voavalin'ny hafa ireo teknika ireo: nanome ny karazan'ny radikaly ny ESR, nanome ny tahan'ny fizotran'ny fihetsika tsy miankina amin'ny mpamantatra mamoaka fluôresansy ny fanjifana oksizenina, ary ny fampiarahana azy ireo dia nampiseho fa samy niasa tao amin'ilay rafitra nohazavaina ny lalana mampiasa oksizenina singlet sy ny lalana mampiasa radikaly.

Mbola toy ny fampitandremana ihany io vokatra tamin'ny 1984 io. Rehefa nisy hazavana sy akora mpanena, dia namokatra peroksida ilay loko; ary rehefa nisy vy, dia namokatra radikaly hydroxyl ilay rafitra, izay karazana mora mihetsika indrindra amin'ireo. Nampifandraisin'ny mpanoratra tamin'ny askorbata ao amin'ny maso izany, ary nampisalasala azy ireo ny fampiasana azy amin'ny maso tsy amim-pitandremana. Tokony hanamarika ireo fepetra ny mpamaky ankehitriny: hazavana miaraka amin'ny akora mpanena sy vy. Raha esorina ny iray amin'ireo dia mihamalemy na levona ilay lalana.

Hafa kosa ny antony maha-zava-dehibe ny elektrôda oksizenina. Ny elektrôda karazana Clark dia mandrefy ny fanjifana oksizenina sisa tavela rehefa atambatra ny vokatra rehetra. Manamarina izany fa mandany oksizenina molekiolary ny fihetsika redox atosik'ilay loko, ary manome antsipiriany momba ny hafainganam-pandehan'ny fihetsika izay tsy azon'ny vokatra fluôresansy sandoka alaina tahaka. Tsy mamantatra ny vokatra anefa izy. Samy mandany oksizenina ny fiforonan'ny peroksida, superoksida, rano, ary ny fizotry ny fanjavonan'ny oksizenina singlet. Tsy feno ny tahan'ny fizotrany raha tsy fantatra ny karazana akora, toy ny tsy maha-feno ny fahafantarana ny karazana akora raha tsy fantatra ny tahan'ny fizotrany. Izany no antony ampiarahan'ny fikarohana matanjaka ny elektrôda amin'ny fitsapana peroksida voakalibra na amin'ny akora mpamandrika.

Antony ifanoheran'ny vokatra momba ny fiarovana amin'ny ôksidasiona

Rehefa ampitahaina ireo fandrefesana telo ireo, dia hita fa ny toa fifanoherana ao amin'ny fikarohana momba ny manga metilena dia avy amin'ny fahasamihafan'ny fomba sy zava-misy biôlôjika telo.

Voalohany, sady mpampita elektrôna no loharanon'ny peroksida ilay loko. Amin'ny fampiviliana elektrôna hiala amin'ny toerana anaovana fisefoana izay mety hanova oksizenina ho superoksida, dia afaka mampihena ROS iray izy; nefa ny endriny efa niharan'ny fampihenana simika kosa mampihena mivantana ny oksizenina ho peroksida, ka mampitombo ROS hafa. Ny laboratoara mandinika ny fihetsika redox ao amin'ny mitôkôndria sy ny anjara asan'ilay loko amin'ny fanomezana lalana hafa dia tokony hanantena valiny miankina amin'ny mpamantatra: mihena ny valin'ny mpamantatra mora mandray superoksida, nefa miakatra ny valin'ny fandrefesana peroksida ao amin'ilay kivety iray ihany.

Faharoa, amin'ny fatra ambany dia famantarana ny peroksida, fa tsy fahasimbana fotsiny. Ny fikarohana momba ny mitôkôndrian'ny atidohan'ny totozy izay nanaraka ilay fikarohana taloha dia nahita famokarana peroksida tamin'ny loko dimampolo nanomolar monja, tsy nisy fahasimban'ny ADN mitôkôndrialy tamin'ny taha ampiasaina amin'ny fitsaboana, ary nisy fiarovana amin'ny fahasimbana ateraky ny rotenone taorian'ny fikarakarana mialoha. Tamin'ny zato micromolar ihany, izay ambony lavitra noho ny elanelana ampiasaina amin'ny fitsaboana, no nanimban'ilay loko sombiny ADN voafantina; ary ny hazavana mena miaraka amin'ny loko roapolo micromolar dia namokatra oksizenina singlet izay nanimba ny sombiny rehetra nosedraina. Hôrmezy no mekanisma naroso: ny famokarana peroksida kely dia manetsika ny fiarovana amin'ny ôksidasiona mifandray amin'ny Nrf2 sy ny fiforonan'ny mitôkôndria. Noho izany, ny fandrefesana mampiseho fitomboan'ny ôksidasiona ao anatin'ny fotoana fohy dia mialoha vokatra manohitra ôksidasiona ao anatin'ny fotoana lava kokoa. Mety tsy hitovy ny valin'ny fitsapana vakina rehefa afaka adiny iray sy ny vakina rehefa afaka iray andro, satria niova ny biôlôjia teo anelanelany.

Fahatelo, ny hazavana no mamaritra na dia ny molekiola misy aza. Manala vondrona metila amin'ilay loko ny hazavana, ka manova azy ho Azure B sy vokatra mifandraika aminy; ary ampy hanentanana azy amin'ny hazavana ny jiron'ny mikrôskôpy eo ambonin'ny lovia iray. Andrana samy hafa ny andrana atao ao anaty haizina sy ireo atao eo ambanin'ny hazavana, ary tokony handray azy ireo ho toy izany ny fizarana momba ny fanaraha-maso ny hazavana sy ny fikarakarana ny loko ao amin'ny torolalana rehetra.

Fanaraha-maso faran'izay kely ilaina, sy fomba famakiana izay filazana rehetra

Ny fampitahana eto ambany no fitaovana fanovozan-kevitra fototra noforonina ho an'ity lahatsoratra ity. Alohan'ny hanaiky vokatra ROS momba ny manga metilena, jereo izay andalana notanterahin'ny mpanoratra sy izay nodiaviny.

Izao àry ny fitsipika azo ampiharina amin'ny famakiana. Ny Amplex miaraka amin'ny perôksidazy, voakalibra ary nohamarinina tamin'ny katalazy, dia porofo momba ny peroksida. Ny DCFDA dia porofo momba ny ôksidasiona tsy mifantina amin'ny mpamantatra, ary tsy mihoatra izany. Ny famandrihana spin miaraka amin'ny fanaraha-maso mampiasa akora misambotra radikaly dia porofo momba ny karazan'ny radikaly. Ny fanjifana oksizenina dia porofo momba ny tahan'ny fizotrany. Ny fehezanteny milaza mihoatra noho izay azon'ny fitsapana anohanana, na dia nosoratana tamim-patokisana aza, dia fehezanteny momba ny mpamantatra, fa tsy momba ilay loko. Ny adihevitra mifandraika amin'ny fiankinan'ny vokatra amin'ny fatra sy ny elanelana hôrmetika, ny fivezivezen'ny elektrôna ao amin'ny mitôkôndria, ny fanelingelenana fitsapana amin'ny santionany nolokoina, ary ny vokatra sandoka ateraky ny hazavana amin'ny mikrôskôpy dia manitatra ny tsirairay amin'ireo hevitra ireo. Mbola manan-kery avokoa ireo rehefa soloina ny fanovozan-kevitra vonjimaika natao ho solon-toerana.