Metilēnzilais zebrzivju pētījumos: audzēšanas piedeva un eksperimentāls blakusfaktors

Ūdens, kurā audzē zebrzivju ikrus, bieži ir viegli zilgans, un gandrīz neviens nepieraksta, kāpēc. Krāsviela ir metilēnzilais, ko pievieno pret sēnītēm, un vairumā protokolu to uzskata par fona sastāvdaļu. Taču šeit fons nav pareizais jēdziens. Precīzāk būtu to saukt par neuzskaitītu eksperimentālu faktoru: vielu, kas ir eksperimentālajos traukos, bet nav kontrolēs, kas izmantotajās koncentrācijās ir farmakoloģiski aktīva un spēj mainīt tieši tos rādītājus, kurus eksperimentā mēra.

Šī atšķirība nosaka visu turpmāko izklāstu. Ikdienas pretsēnīšu pasākumi audzēšanā ir viens jautājums. Tas, vai piedeva ir neitrāla attiecībā pret jūsu testu, ir cits. Jaunākā literatūra par zebrzivīm uz pirmo jautājumu atbild nomierinoši, bet uz otro — satraucoši.

Ko vadlīnijas patiesībā nosaka

Vienota standarta nav, un tā ir daļa no problēmas. Kanādas Dzīvnieku aprūpes padomes vadlīnijas pieļauj 0.5 mg/L jeb 0.00005% ikru un kāpuru transportēšanas šķīdumā, lai mazinātu sēnīšu augšanu. Eiropas laboratorijas dzīvnieku aprūpes vadlīnijās aprakstīta embriju turēšana vidē, kas bieži satur tos pašus 0.00005%. Cold Spring Harbor E3 receptē kā sastāvdaļa norādīts divreiz lielāks daudzums — 1 mg/L jeb 0.0001%. Pretstatā tam ir uzkrītošs iztrūkums: OECD zivju embriju toksicitātes testa vadlīnijās paredzēts rekonstituēts atšķaidīšanas ūdens un testējamā ķīmiskā viela, bet ieteikuma izmantot metilēnzilo nav ne 2013. gada versijā, ne vēlākajā pārskatītajā izdevumā. Tātad viena laboratorija zebrzivju embrijus no pirmajām dzīves stundām audzē zilā ūdenī ar metilēnzilo, bet cita normatīvajām prasībām paredzēto embriju testu veic bezkrāsainā ūdenī, un abas savu vidi sauc par parastu. Ikviens, kurš salīdzina dažādu laboratoriju rezultātus vai apvieno vēsturiskos kontroles datus, pārņem šo neatbilstību.

Lai raksturotu koncentrācijas, 0.00005% ir aptuveni 1.56 mikromolāri, bet 0.0001% — aptuveni 3.13 mikromolāri. Tie ir mazi skaitļi, un ir vilinoši uzskatīt tos par pārāk maziem, lai tiem būtu nozīme. Turpmāk aplūkotajos pētījumos pārbaudīts tieši šis pieņēmums tieši šajās koncentrācijās.

Lasītāji, kuru pieredze saistīta ar akvāriju zivju turēšanu, nevis laboratoriju, ar šo pašu molekulu sastopas citā kontekstā, kas aplūkots metilēnzilā lietošanas ceļvedī akvārijiem. Ķīmija ir tā pati; apraksts par to, kā krāsviela pārnes elektronus šūnās, izskaidro, kāpēc redoksaktīvs savienojums atkal un atkal parādās vielmaiņas pētījumos. Turpmākais attiecas tieši uz metilēnzilo ūdenī, kurā audzē zebrzivju ikrus.

Vielmaiņa: ietekmes virziens mainās atkarībā no attīstības posma

Visinformatīvākajā pētījumā normāli attīstošās zebrzivis tika pakļautas vielas iedarbībai no pirmās dzīves dienas līdz 5 dienām pēc apaugļošanās, katrā posmā mērot oksidatīvo vielmaiņu, kā aprakstīts publicētajā ziņojumā par embriju vielmaiņas eksperimentiem. Rezultātu tendence jāizklāsta rūpīgi, jo tās virziens mainās.

1 dienu pēc apaugļošanās bazālais skābekļa patēriņš iedarbībai pakļautajos embrijos palielinājās abās audzēšanā izmantotajās koncentrācijās. 2 dienu vecumā kāpuru virsmas slānī mitohondriju membrānas potenciāls bija paaugstināts pie 0.00005%, 0.0001% un 0.0003% koncentrācijas. 4 līdz 5 dienu vecumā, pēc izšķilšanās, ietekmes virziens bija pretējs: oksidatīvais enerģijas patēriņš samazinājās neatkarīgi no tā, vai iedarbība bija nepārtraukta kopš apaugļošanās vai akūta tikai no 3. līdz 4. dienai. Vienlaikus gan 1., gan 4. dienā samazinājās mitohondriju elpošanas kompleksu apakšvienību transkriptu daudzums, kā arī ar steroīdu sintēzi un glikoneoģenēzi saistīto transkriptu daudzums.

Divi papildu novērojumi precizē ainu. Pie augstākās audzēšanā izmantotās koncentrācijas izšķilšanās notika nedaudz agrāk: 2 dienu vecumā iedarbībai pakļautie embriji bija priekšā, bet līdz 3. dienai kontroles grupa tos bija panākusi. Turklāt pati stresa ass, šķiet, saglabāja normālu darbību: kad 5 dienu veci kāpuri tika pakļauti virpuļošanas izraisītam stresam, kortizola līmenis visā ķermenī abās grupās pieauga kā parasti. Tātad šajos daudzumos krāsviela nav vispārēja attīstībai toksiska viela un nenomāc visas fizioloģiskās reakcijas. Tā maina enerģijas vielmaiņu atkarībā no attīstības posma — palielina to pirms izšķilšanās un samazina pēc tās.

Uzvedība: kāpēc divu pētījumu rezultāti atšķiras un kāpēc abi var būt pareizi

Literatūra par uzvedību šķiet pretrunīga, līdz līdzās salīdzina iedarbības shēmas. Vienā attīstības un uzvedības drošuma pētījumā embrijus aptuveni no 6 stundām pēc apaugļošanās pakļāva koncentrācijām līdz 10 mikromolāriem, šķīdumus katru dienu atjaunoja līdz 4. dienai, pēc tam 5. un 6. dienā kāpurus pārvietoja vidē bez krāsvielas un 6. dienā pārbaudīja kustību aktivitāti gaismas un tumsas testā. Rezultāts: nebija nozīmīgas ietekmes uz mirstību, izšķilšanos vai morfoloģiju un nebija iedarbības ietekmes uz kustību aktivitāti. Autori pamatoti ieteica 10 mikromolārus kā augšējo robežu viņu izmantotajos apstākļos.

Otra pētnieku grupa, kuras autoru sastāvs daļēji pārklājās ar vielmaiņas pētījuma autoriem, izmantoja iedarbības shēmu, kas atbilst faktiskajai audzēšanas praksei: krāsviela bija klātesoša, sākot no 2 līdz 3 stundām pēc apaugļošanās, vidi katru dienu daļēji atjaunoja, un uzvedību mērīja iedarbības laikā vai drīz pēc tās. Pie tām pašām ikdienā izmantotajām koncentrācijām kāpuriem 24 stundu testā novēroja samazinātu kustību aktivitāti; šo rezultātu varēja atkārtot dažādās līnijās un laboratorijās. Pētījums par uzvedības mērījumus ietekmējošiem blakusfaktoriem saistīja šo ietekmi ar serotonīnerģisko tonusu, kas atbilst krāsvielas zināmajai monoamīnoksidāzes inhibējošajai darbībai. Visuzskatāmākais bija tas, ka embriju vide ar metilēnzilo maskēja paredzamo kustību aktivitātes reakciju uz SSAI fluoksetīnu. Tāpēc skrīninga testā, ko veic zilā ūdenī, var nepamanīt zāļu ietekmi, kura bezkrāsainā ūdenī būtu redzama.

Īstas pretrunas nav. Vienā testā divas dienas pēc vielas izskalošanas savienojumam var nebūt nosakāmas atlikušās ietekmes, bet citā tas joprojām var būt aktīvs, kamēr ir klātesošs. Praktiskais secinājums ir tāds, ka rezultāts bez konstatētas ietekmes pamato augšējo koncentrācijas robežu, nevis apgalvojumu par neitralitāti, savukārt rezultāts ar konstatētu ietekmi raksturo būtisko risku: aktīvu iedarbību mērījumu laikā tieši tādos apstākļos, kādus izmanto vairums laboratoriju.

Redokskrāsviela redokstestā

Vēl viens slazds ir pelnījis atsevišķu rindkopu, jo tas izkropļo pašu mērīšanas līdzekli, nevis dzīvnieku. Alamar Blue enerģijas patēriņa tests pats balstās uz redoksķīmiju: rezazurīns tiek reducēts līdz fluorescējošam rezorufīnam. Arī metilēnzilais piedalās redoksreakcijās. Kontrolēs bez šūnām abas audzēšanā izmantotās koncentrācijas pēc 24 stundām nedaudz, bet statistiski nozīmīgi samazināja Alamar Blue fluorescenci. Eksperimentos ar dzīvniekiem iedarbībai pakļautie embriji pirms testa tika mazgāti vismaz trīs reizes vidē bez krāsvielas, un bioloģiskā ietekme izšķīlušos kāpuros pārsniedza bezšūnu kontrolēs konstatētos traucējumus. Tātad abi apgalvojumi ir patiesi: mazgātiem dzīvniekiem saglabājas reāla vielmaiņas ietekme, bet neizskalota krāsviela papildus rada tiešu ķīmisku artefaktu. Kontrolēm šīs divas ietekmes ir jānošķir, citādi neviens no skaitļiem nav jēgpilns. Vispārīgie ieteikumi par krāsvielās balstītu testu rezultātu interpretēšanu šeit ir īpaši būtiski.

Attīstības posmu laika skala

Šim rakstam sagatavots oriģināls materiāls. Ja nav norādīts citādi, koncentrācijas ir divas standarta audzēšanā izmantotās vērtības — 0.00005% un 0.0001%.

Jāatceras šāda tendence: vielmaiņas rādītāji sākumā palielinās, bet vēlāk samazinās, savukārt ietekme uz uzvedību ir novērojama iedarbības laikā un nav nosakāma pēc vielas izvadīšanas tajā vienā testā, kurā tas tika pārbaudīts.

Kontroļu plānošanas kontrolsaraksts

Otrs oriģinālais materiāls. Izmantojiet to, kad zebrzivju audzēšanas protokoli ar metilēnzilo kļūst par daļu no eksperimenta.

1. Norādiet krāsvielu kā reaģentu, nevis kā ūdeni. Norādiet koncentrāciju gan procentos, gan mikromolāros, iedarbības sākumu un beigas stundās vai dienās pēc apaugļošanās, vides atjaunošanas grafiku un izskalošanas periodu pirms katra mērījuma.
2. Pielāgojiet kontroles pētījuma jautājumam. Testējamās ķīmiskās vielas pētījumam vajadzīgas kontroles bez krāsvielas; audzēšanas prakses pētījumam vajadzīga grupa bez krāsvielas un grupa ar krāsvielu, reģistrējot pretsēnīšu iedarbības rezultātu, jo nevienā no minētajiem pētījumiem pretsēnīšu efektivitāte netika mērīta.
3. Pirms redokstestiem mazgājiet un pēc tam pārbaudiet. Noskalojiet vismaz trīs reizes vidē bez krāsvielas un paralēli veiciet bezšūnu kontroli ar krāsvielu un reaģentu, jo krāsviela tieši samazina Alamar Blue signālu.
4. Uzvedības un monoamīnu rādītājus uzskatiet par augsta riska rādītājiem. Kustību aktivitātes, izbīļa reakcijas, trauksmei līdzīgas uzvedības, antidepresantu un MAO inhibitoru pētījumos mērījumu laikā jāizvairās no krāsvielas vai jāpierāda tās neitralitāte attiecībā uz konkrēto rādītāju; vienas līdz divu dienu izskalošanas periods novērsa vienu ietekmi uz kustību aktivitāti, taču tas nav pierādīts citām eksperimentālajām shēmām.
5. Vielmaiņas un mitohondriju rādītājus uzskatiet par augsta riska rādītājiem visos attīstības posmos. Skābekļa patēriņš, enerģijas patēriņš, membrānas potenciāls un elpošanas ķēdes transkriptu daudzums mainās audzēšanā izmantotajās koncentrācijās, turklāt pirms un pēc izšķilšanās — pretējos virzienos.
6. Nepārnesiet pieņēmumu par neitralitāti no vienas eksperimentālās shēmas uz citu. Rezultāts bez konstatētas ietekmes pēc izskalošanas neattiecas uz nepārtrauktu iedarbību; rezultāts bez morfoloģiskas ietekmes neattiecas uz vielmaiņu vai mijiedarbību ar zālēm; vienā līnijā, temperatūrā vai testa ilgumā iegūts rezultāts neattiecas uz citiem apstākļiem.
7. Norādiet vadlīnijas, kurām sekojāt, un alternatīvu. Skaidri nosauciet CCAC, Eiropas vai Cold Spring Harbor koncentrācijas un atzīmējiet, ka OECD embriju testā krāsviela nav paredzēta, lai lasītājs varētu saprast jūsu dzīvnieku audzēšanas apstākļus.

Nekas no minētā nav arguments pret krāsvielas izmantošanu ikru dzīvotspējas saglabāšanai. Tas ir arguments pret to, ka audzēšanas izvēle nepārbaudīta nonāk datos. Zilā krāsa traukā ir molekula ar farmakoloģisku darbību, un visdrīzāk izkropļoti tiks tieši augstas caurlaidspējas vielmaiņas un neirouzvedības skrīninga testi, kuriem mūsdienās dod priekšroku jaunām zebrzivīm. Reģistrējiet šo vielu, kontrolējiet tās ietekmi, izskalojiet to pirms mērījumiem un pārbaudiet testu, kurā tā, iespējams, nemanāmi piedalās.