Metilēnzilais un ALS: kāpēc rezultāti dažādos eksperimentālajos modeļos atšķiras

Meklējot informāciju par metilēnzilo un ALS, var atrast divus apgalvojumus, kas šķiet savstarpēji pretrunīgi. Viens vēsta, ka zilā krāsviela aizsargāja neironus ALS modeļos. Otrs — ka ALS peļu modelī tā neko nemainīja. Abi apgalvojumi atsaucas uz reāliem zinātniskiem rakstiem, un abi raksti ir jāuztver nopietni. Pretruna izzūd, kad skaidri formulē katra eksperimenta pamatprincipu: modelis nosaka apgalvojuma robežas.

Rezultāts tārpā ir apgalvojums par tārpu. Rezultāts zivs kāpurā ir apgalvojums par zivs kāpuru. Neviens no tiem nav apgalvojums par pacientu, kamēr to neapstiprina slimības gaitas pētījums zīdītājā. Šajā rakstā abi visbiežāk citētie darbi ir salīdzināti līdzās, lai varētu saprast, kāpēc to atbildes atšķiras.

Abi eksperimenti vienā tabulā

Lasot turiet šo tabulu atvērtu. Tajā ietvertas visas būtiskās atšķirības starp pētījumiem.

Atšķiras ģenētika, sugas, vielas ievadīšanas ceļš, laiks un vērtētie iznākumi. Genotips ir tikai viena no piecām atšķirībām, tāpēc šie divi pētījumi nevar pierādīt, ka metilēnzilais selektīvi iedarbojas uz vienu ALS mehānismu. Tie pierāda ko šaurāku, bet joprojām noderīgu: izteikta funkciju atjaunošanās vienkāršos modeļos agrīnas, tiešas iedarbības apstākļos nepārcēlās uz hronisku slimības gaitu zīdītājā, vielu ievadot iekšķīgi.

Pozitīvais rezultāts: ko parādīja tārpu un zivju pētījums

2012. gada tārpu un zivju pētījumā tārpu motorajos neironos tika ekspresēts mutants cilvēka TDP-43 vai FUS, savukārt zivju embrijos tika injicēta mutanta cilvēka proteīna mRNS. Tie ir proteotoksicitātes modeļi. Tie dažu dienu laikā atveido mutanta proteīna toksisko ietekmi uz kustībām un neironu formu, nevis pilnu ALS gaitu pieaugušam cilvēkam vairāku gadu garumā.

Vielas ievadīšana sākās ļoti agri. Tārpi no izšķilšanās brīža auga uz agara, kas saturēja metilēnzilo. Zivju embriji nakti pavadīja vielas šķīdumā, sākot no 24 stundām pēc apaugļošanās, un to uzvedību pārbaudīja aptuveni divas dienas vēlāk. Starp vielu un neironu nebija tādas hematoencefāliskās barjeras kā zīdītājā, un vielas koncentrācija plazmā vai smadzenēs netika mērīta.

Šādos apstākļos ietekme bija izteikta un konsekventa. Gan 6, gan 60 μM samazināja ar vecumu saistīto paralīzi TDP-43 un FUS tārpos. Pieauguša organisma stadijas 12. dienā aptuveni 80 procenti TDP-43 tārpu, kas nebija saņēmuši vielu, bija paralizēti, salīdzinot ar aptuveni 10 procentiem tārpu, kuri vielu saņēma no izšķilšanās brīža. Sinaptiskās funkcijas tests norādīja tajā pašā virzienā: TDP-43 tārpi bija pārmērīgi jutīgi pret aldikarbu — vielu, ar kuru pārbauda neiromuskulāro pārvadi —, un metilēnzilais šo reakciju tuvināja normai. Deģenerējošu motoro neironu izaugumu skaits samazinājās, un visizteiktākā ietekme bija pie 60 μM. Zivīm ievērojami uzlabojās pieskāriena izraisītā peldēšana, un pie 30 vai 60 μM saīsinātie motorie aksoni izauga tuvāk normālajam garumam, lai gan atjaunošanās bija daļēja, nevis pilnīga.

Oksidatīvā stresa dati saskanēja ar antioksidatīvas iedarbības skaidrojumu. Tārpiem un zivīm ar mutācijām bija paaugstināti reaktīvo skābekļa formu rādītāji, kas pēc vielas ievadīšanas samazinājās, savukārt normāli tārpi, kas saņēma metilēnzilo, prooksidanta iedarbībā izdzīvoja daudz ilgāk nekā tārpi, kas vielu nesaņēma. Tomēr svarīgi ir divi ierobežojumi. Kopējais mutanto TDP-43 un FUS proteīnu daudzums nesamazinājās, un pētījumā proteīnu agregāti netika tieši kvantitatīvi noteikti, tāpēc tas parāda funkciju atjaunošanos, bet nepierāda agregātu izvadīšanu. Ikvienam, kurš seko tam, kā parasti tiek formulētas ar oksidēšanās–reducēšanās procesiem un mitohondrijiem saistītas hipotēzes, šis mehānisms jāuztver kā datos balstīts, bet vēl ne galīgi noskaidrots.

Visvairāk informācijas sniedza iedarbības sākuma laiks. Kad autori nogaidīja līdz pieauguša organisma stadijas 5. dienai, lai sāktu vielas ievadīšanu, paralīzes īpatsvars 12. dienā bija aptuveni 55 procenti, nevis aptuveni 10 procenti, kā tad, ja vielu sāka ievadīt no izšķilšanās brīža. Tā pati viela, tas pats tārps, tā pati mutācija, bet daudz mazāka ietekme. Agrīna profilaktiska iedarbība nodrošināja lielu daļu novērotā ieguvuma.

Nulles rezultāts: ko parādīja SOD1 peļu pētījums

2011. gada peļu pētījumā tika uzdots sarežģītāks jautājums stingrākā eksperimentālā sistēmā. Kongēnām SOD1 G93A pelēm slimība progresē no pakaļkāju trīces caur gaitas traucējumiem un apgriešanās refleksa zudumu līdz iepriekš noteiktam terminālam galapunktam. Vielas ievadīšana sākās pirms simptomu parādīšanās, 45. dienā, un turpinājās katru dienu, novērotājiem vērtējot neiroloģisko stāvokli skalā no 0 līdz 6. Tas ir visas slimības gaitas eksperiments, tāpēc tas ir tuvāks pacientam būtiskajiem jautājumiem nekā jebkura tārpu paralīzes līkne.

Galvenie rezultāti neuzrādīja nozīmīgu ietekmi. Kopumā simptomi kontroles grupā sākās 121. dienā, bet metilēnzilā grupā — 124. dienā; šī atšķirība nebija nozīmīga. Dzīvildze līdz beigu stadijai bija attiecīgi 167 un 170 dienas, un arī šī atšķirība nebija nozīmīga. Dažās sekundārās analīzēs rezultāti bija labvēlīgāki vielas saņēmējiem: mātītēm simptomu sākums aizkavējās par aptuveni 7 dienām, un dzīvnieki, kuri saņēma vielu, pavadīja nedaudz vairāk laika vieglākās stadijās un mazāk — smagās. Tā kā dzimumu apakšgrupas bija mazas un tika veikti daudzi stadiju salīdzinājumi, šie rezultāti drīzāk palīdz izvirzīt hipotēzes, nevis kalpo par pierādījumu. Netika veikta ne neironu skaitīšana, ne SOD1 agregācijas tests, ne oksidatīvo vai iekaisuma marķieru mērījumi, tāpēc pētījums arī nevar pateikt, vai viela sasniedza savus mērķus un neiedarbojās vai arī šajā devā mērķus vispār neiesaistīja. Tika pārbaudīta tikai viena deva.

Paši autori norādīja uz būtiskāko ierobežojumu, kas jāņem vērā abos virzienos. SOD1 G93A modelis ar lielu transgēna kopiju skaitu labi atveido toksiskā SOD1 izraisītu slimību, taču SOD1 izraisīta slimība veido tikai nelielu daļu no ģimenes ALS gadījumiem, un tās bioloģija atšķiras no vairuma sporādisko gadījumu. Viņi ieteica atkārtoti pārbaudīt kandidātvielas zīdītāju modeļos, kuru pamatā ir TDP-43. Kopš tā laika šis ieteikums ir kļuvis sarežģītāks, jo tārpu un zivju pētījuma autori norāda, ka arī atsevišķā metilēnzilā pētījumā TDP-43 peļu modelī neizdevās uzlabot motoros iznākumus. Tātad savienojums vienā TDP-43 sistēmā var uzrādīt izteiktu ietekmi, bet citā TDP-43 sistēmā — nekādu. Sistēma ir tikpat svarīga kā gēns.

Kāpēc uzlabojums tārpā vai zivī nevar pierādīt ieguvumu pacientiem

Uztveriet katru modeli kā atbildi uz atšķirīgu jautājumu.

Pirmkārt, atšķiras bioloģija. TDP-43 un FUS ir nukleīnskābes saistoši proteīni ar kopīgām ģenētiskām mijiedarbībām šajās vienkāršajās sistēmās, savukārt SOD1 toksicitāte izpaužas caur daļēji atšķirīgiem sākotnējiem mehānismiem. Viela, kas mazina viena veida proteotoksisko stresu, ne vienmēr mazinās otru, un panākumi pret pārmērīgu ekspresiju embrijā ne vienmēr paredz panākumus pret lēnu neirodeģenerāciju pieaugušā organismā ar iekaisumu, glijas iesaisti un visa organisma stāvokļa pasliktināšanos.

Otrkārt, atšķiras iedarbības apstākļi. Nepārtraukta iedarbība no apkārtējā šķīduma mikromolārās koncentrācijās nav tas pats, kas iekšķīga ievadīšana. Starp norītu devu un muguras smadzeņu motoro neironu atrodas uzsūkšanās zarnās, pirmā loka metabolisms, saistīšanās ar plazmas proteīniem, iekļūšana smadzenēs un klīrenss. Nevienā no pētījumiem netika mērīta vielas koncentrācija nervu sistēmā, tāpēc neviena pētījuma koncentrāciju nevar sasaistīt ar otrā pētījuma koncentrāciju.

Treškārt, atšķiras laiks. Ieguvumi tārpiem un zivīm lielā mērā bija atkarīgi no vielas ievadīšanas, pirms bija uzkrājušās patoloģiskas izmaiņas. Arī pelēm vielas ievadīšana sākās pirms simptomiem, kas ir pētījuma stiprā puse, tomēr cilvēkiem ārstēšana gandrīz vienmēr sāktos pēc simptomu parādīšanās — tātad vēl vēlāk. Profilaktiskas iedarbības signāls divu dienu embriju testā ir sākumpunkts pētniecībai, nevis klīniskas lietošanas modelis.

Ceturtkārt, atšķiras vērtētie iznākumi. Paralīze 12. dienā, jutība pret aldikarbu, aksona garums mikrometros un nopeldētais attālums ir fenotipi, kas tieši saistīti ar pētāmo procesu. Simptomu sākums un dzīvildze zīdītājā apkopo visu organismā notiekošo kompensējošo un sarežģījošo procesu ietekmi. Vielas bieži maina šādus tiešos rādītājus, nemainot dzīvildzi, un tieši tāpēc zīdītāju pētījumos izmanto laiku līdz noteiktam notikumam kā vērtējamo iznākumu.

Lasītāji, kuri vēlas pārbaudes sarakstu nākamajam skaļajam virsrakstam, var izmantot ieteikumus no raksta kā lasīt preklīniskos pētījumus: noskaidrojiet sugu, transgēnu, devu un ievadīšanas ceļu, vai tika mērīta vielas koncentrācija, kad ievadīšana sākās attiecībā pret patoloģisko izmaiņu attīstību, vai vērtētais iznākums bija īstermiņa fenotips vai slimības gaita un vai ietekme tika atkārtoti novērota otrā laboratorijā. Plašākais metilēnzilā pierādījumu kopums pētījumos ar cilvēkiem joprojām ir avots, kur pārbaudīt, vai kāds no šiem agrīnajiem signāliem ir pārtapis klīniskos datos.

Ko tas nozīmē pacientiem un viņu ģimenēm

No šiem rakstiem neizriet iedibināts metilēnzilā lietošanas protokols ALS gadījumā. Pozitīvais pētījums pamato turpmāku oksidatīvo un sinaptisko mehānismu izpēti TDP-43 un FUS bioloģijā. Nulles rezultāta pētījums runā pretī gaidām, ka ilgstoša iekšķīga ievadīšana šādos iedarbības apstākļos varētu mainīt SOD1 tipa slimības gaitu. Kopā tie raksturo rezultātu nekonsekvenci dažādos modeļos, nevis sniedz ārstēšanas ieteikumu.

Drošība jāvērtē tikpat piesardzīgi kā efektivitāte. ALS pētījumi pelēs neko nepasaka par drošām devām cilvēkiem, un metilēnzilais rada reālus riskus — hemolīzi G6PD deficīta gadījumā un serotonīna toksicitāti, ja to kombinē ar serotonīnerģiskām zālēm. Aizdomas par G6PD deficītu, pašreizēja antidepresantu lietošana un jebkādas plānotas izmaiņas medikamentu lietošanā ir jāapspriež ar ārstu; pirms rīkoties laboratorijas pētījumu virsrakstu iespaidā, jāpārskata arī vispārējie metilēnzilā drošības dati.

Galveno secinājumu var izteikt vienā teikumā. Agrīnas iedarbības apstākļos metilēnzilais izteikti atjaunoja funkcijas TDP-43 un FUS tārpu un zivju kāpuru fenotipos, bet hroniskā iekšķīgas ievadīšanas pētījumā ar SOD1 pelēm būtībā neradīja ieguvumu ne simptomu sākuma, ne dzīvildzes ziņā, tāpēc godīga interpretācija ir no modeļa atkarīgi pierādījumi, kas nepamato lietošanu pacientiem.