Metilēnzilais un iekaisuma signalizācija: inflamasomas, IL-6 un STAT3

Pieņemsim, ka trīs laboratorijas ziņo par viena un tā paša zilā savienojuma pretiekaisuma iedarbību. Viena konstatē mazāku IL-1beta izdalīšanos no makrofāgiem. Otra konstatē mazāku iNOS enzīma daudzumu tā paša veida šūnās. Trešā konstatē mazāk IL-6 asinīs un zemāku STAT3 aktivitāti smadzenēs. Rodas kārdinājums apvienot šos trīs rezultātus vienā apgalvojumā. Taču šāda apvienošana aizēno pašu atradni.

Katrs rezultāts attiecas uz atšķirīgu signalizācijas mehānismu ar savu ierosinātāju, kompleksa veidošanās posmu un mērāmo rādītāju. Metilēnzilais katru mehānismu ietekmē citā punktā. Tas, vai kāds no šiem procesiem uzlabo veselības iznākumu, ir atsevišķs jautājums, kas aplūkots mūsu pārskatā par metilēnzilo un iekaisumu. Šajā lapā pievēršamies signalizācijas ceļiem.

1. ceļš: inflamasomas kompleksa veidošanās un kaspāze-1

Inflamasoma ir olbaltumvielu karkass, kas pēc vajadzības veidojas mieloīdās šūnas iekšienē. Tās sastāvdaļas ir sensors, adapteris ASC un efektorenzīms kaspāze-1. Kad komplekss ir izveidojies, kaspāze-1 sašķeļ pro-IL-1beta un pro-IL-18, veidojot to sekretējamās formas, un var izraisīt piroptozi — iekaisīgu šūnu nāves formu. Sensors nosaka inflamasomas veidu: NLRP3 reaģē uz kristāliem un poras veidojošiem toksīniem, piemēram, nigericīnu un ATP, NLRC4 reaģē uz baktēriju flagelīnu, AIM2 reaģē uz citosolā esošu divpavedienu DNS, bet nekanoniskais ceļš reaģē uz intracelulāru lipopolisaharīdu.

Aktivācijai nepieciešami divi signāli. Pirmais signāls ir sagatavošana: Toll līdzīgā receptora ligands veicina no NF-kB atkarīgu NLRP3 un pro-IL-1beta transkripciju, nodrošinot nepieciešamo sastāvdaļu klātbūtni. Otrais signāls ir kompleksa veidošanās: otrs ierosinātājs izraisa ASC oligomerizāciju punktveida agregātos, kaspāzes-1 šķelšanu, veidojot tās p20 fragmentu, un nobriedušā IL-1beta p17 izdalīšanos. Ir zināms, ka mitohondriju reaktīvās skābekļa formas un kristālu uzņemšana veicina NLRP3 otro signālu.

2017. gada makrofāgu pētījumā par plaša spektra inflamasomu inhibēšanu metilēnzilo pārbaudīja abos signālu posmos. Ar lipopolisaharīdu sagatavotos peļu kaulu smadzeņu makrofāgos nigericīns, ATP un mononātrija urāta kristāli katrs izraisīja IL-1beta un kaspāzes-1 izdalīšanos, kā arī ASC punktveida agregātu veidošanos. Metilēnzilais 20 līdz 200 mikromolārā koncentrācijā visus trīs rādītājus samazināja no devas atkarīgā veidā, nenogalinot šūnas. Tāda pati aina bija vērojama, izmantojot flagelīnu un Salmonella NLRC4 aktivācijai, divpavedienu DNS un Listeria AIM2 aktivācijai, kā arī transfekcijas ceļā ievadītu lipopolisaharīdu vai dzīvas E. coli nekanoniskā ceļa aktivācijai. Savienojums viens pats neizraisīja izdalīšanos, un kontroles platēs netika novērota antibakteriāla iedarbība, tādēļ rezultāts attiecas uz saimniekorganisma atbildes reakciju.

Iepriekšējos ceļa posmos novērtēja trīs ietekmes punktus. Metilēnzilā klātbūtnē samazinājās rotenona izraisītā mitohondriju superoksīda veidošanās, un līdz ar to samazinājās arī rotenona izraisītā IL-1beta izdalīšanās. Samazinājās fluorescējošu lodīšu uzņemšana, kas atbilst samazinātai fagocitozei pirms kristālu atpazīšanas. Reportiera konstrukcija, ko kontrolēja NLRP3 promotors ar divām NF-kB saistīšanās vietām, metilēnzilā klātbūtnē uzrādīja zemāku aktivitāti, savukārt saīsināts promotors bez šīm vietām nereaģēja. Bezšūnu mēģenē metilēnzilais arī tieši samazināja rekombinantās cilvēka kaspāzes-1 aktivitāti. Pievienojot savienojumu tikai sagatavošanas vai tikai aktivācijas posmā, IL-1beta, IL-18 un kaspāzes-1 izdalīšanās joprojām samazinājās, tātad tiek ietekmēti abi posmi.

Pārbaudes ar pelēm atbilda šai selektivitātei. Letāla lipopolisaharīda deva nogalināja kontroles grupas dzīvniekus dažu stundu laikā, savukārt metilēnzilais uzlaboja izdzīvotību; IL-1beta līmenis vēderplēves dobuma šķidrumā samazinājās, bet IL-6 līmenis tajā pašā šķidrumā nemainījās. Listeria izraisīta peritonīta modelī IL-1beta līmenis vēderplēves dobuma šķidrumā samazinājās, bet kopējais šūnu skaits nemainījās. Cilvēka THP-1 monocīti visu četru inflamasomu veidu gadījumā reaģēja tāpat kā peļu makrofāgi. Inflamasomu pētījumu rezultāti izskaidro IL-1beta un IL-18 nobriešanu, nevis visu citokīnu izmaiņas. Tādēļ arī smadzeņu imūnšūnu forma eksperimentos ar mikrogliju un astrocītiem sniedz atbildi uz citu jautājumu nekā olbaltumvielu karkasa veidošanās.

2. ceļš: iNOS transkripcija caur NF-kB un STAT1 saistīšanos

Inducējamā slāpekļa monoksīda sintāze jeb iNOS miera stāvoklī ir sastopama ļoti mazā daudzumā, un tās transkripcija notiek pēc vajadzības. Lipopolisaharīds to veicina galvenokārt caur IkB-alpha noārdīšanos, kam seko NF-kB fosforilēšana un iekļūšana kodolā. Interferons-gamma to veicina galvenokārt caur STAT1 fosforilēšanu ar Janus kināzes starpniecību, kam seko STAT1 iekļūšana kodolā. Pēc tam katrs faktors saistās ar savu vietu iNOS promotorā. Enzīma aktivitāte un gēna indukcija ir atsevišķi kontroles punkti, un zāles var iedarboties uz vienu vai abiem.

2015. gada pētījumā par iNOS indukciju makrofāgos un pelēs ar endotoksēmiju iedarbība tika lokalizēta mRNS līmenī. RAW 264.7 šūnās un primārajos peļu makrofāgos metilēnzilais 1 mikromolārā koncentrācijā, pievienots 30 minūtes pirms lipopolisaharīda, interferona-gamma vai abu pievienošanas, samazināja iNOS olbaltumvielas un mRNS daudzumu 8 līdz 24 stundu periodā. Vienlaikus barotnē samazinājās nitrītu daudzums, bet šūnu dzīvotspēja nemazinājās. Pelēm, kurām ievadīja 25 mg uz kg lipopolisaharīda, viena 5 mg uz kg deva, kas ievadīta vienu stundu agrāk, samazināja iNOS olbaltumvielas un mRNS daudzumu plaušās, aknās un sirdī.

Īpaši svarīgi ir tas, kas nemainījās. IkB-alpha noārdīšanās, NF-kB fosforilēšana, STAT1 fosforilēšana un abu faktoru uzkrāšanās kodolā saglabājās neskarta. Traucējums radās vienu posmu vēlāk: kodolu ekstraktos pēc lipopolisaharīda iedarbības bija mazāka NF-kB saistīšanās ar tā DNS elementu, bet pēc interferona-gamma iedarbības — mazāka STAT1 saistīšanās. Hromatīna imūnprecipitācija apstiprināja, ka šūnās abi faktori mazāk saistījās ar iNOS promotoru. Samazinājās arī audzēja nekrozes faktora alfa daudzums; tā promotors arī izmanto NF-kB. Faktori bija aktivēti un nonāca kodolā, taču vāji saistījās ar savu mērķa DNS.

Ievērojiet atšķirību no 1. ceļa. Šeit runa ir par faktoru saistīšanos ar DNS, iesaistīts STAT1, nevis STAT3, un mērītie rādītāji ir mRNS, olbaltumviela un nitrīti, nevis ASC punktveida agregāti un kaspāzes-1 fragmenti. Mūsu metilēnzilā mērķu kartē dažādos šūnu modeļos šis transkripcijas līmenis ir nodalīts no tiešiem enzīmu un mitohondriju mērījumiem.

3. ceļš: IL-6 serumā un STAT3 aktivācija audos

IL-6 nodod signālu caur gp130 receptoru saimi uz Janus kināzes–STAT3 kaskādi. Fosforilētais STAT3 dimerizējas, nonāk kodolā un ierosina iekaisuma programmas, savukārt pats IL-6 ir NF-kB mērķis. Tādējādi abi veido atgriezeniskās saites cilpu, ko bieži sauc par IL-6–STAT3 asi. Standarta rādītāji ir IL-6 līmenis serumā ceļa sākuma posmā, fosforilētā un kopējā STAT3 attiecība un efektorenzīmi, piemēram, iNOS un COX2, turpmākajos posmos.

2023. gada pētījumā ar pelēm par IL-6 un STAT3 pēc lipopolisaharīda iedarbības šo asi novērtēja dažādos organisma nodalījumos. C57BL/6 līnijas peļu tēviņi trīs dienas katru dienu saņēma 1 mg uz kg lipopolisaharīda un 30 minūtes pēc katras devas — 5 vai 10 mg uz kg metilēnzilā. Trešajā dienā IL-6 līmenis serumā abās metilēnzilā grupās bija zemāks nekā grupā, kas saņēma tikai lipopolisaharīdu, savukārt lielākā daļa pārējo analizēto citokīnu ievadītās vielas ietekmē nemainījās. Fosforilētā un kopējā STAT3 attiecība bija zemāka smadzeņu garozā, hipokampā un auss ādā. Vienlaikus bija vājāks mikroglijas Iba-1 krāsojums, mazāks iNOS un COX2 daudzums un daļēji mazināts ķermeņa masas zudums.

Šeit jāņem vērā divas atrunas. Zemāks IL-6 līmenis serumā kopā ar mazāku STAT3 fosforilēšanu audos atbilst šīs ass modulācijai, taču neļauj noteikt primāro iedarbības punktu. Tādu pašu attiecību varētu radīt gan mazāks citokīna daudzums ceļa sākumā, gan vājāka receptoru signalizācija, gan mainīta fosfatāzes aktivitāte. Turklāt ķermeņa masa trīs dienu ilgas akūtas iedarbības laikā ir visa dzīvnieka līmeņa rādītājs, nevis simptomu vai remisijas novērtējums. Tas sniedz papildu kontekstu līdzās imūnblota rezultātam, taču nepārvērš signalizācijas rezultātu apgalvojumā par ārstēšanu. Atsevišķie mitohondriju oksidēšanās un reducēšanās procesi norisinās paralēli šeit aprakstītajiem citokīnu procesiem, un tos nevajadzētu apvienot.

Ceļu salīdzinājums: iedarbības punkti un mērītie rādītāji

Tabula palīdz izvairīties no trim nepamatotiem rezultātu pārnesumiem. Rezultāts par ASC punktveida agregātiem nepierāda rezultātu par STAT3. Rezultāts par STAT1 saistīšanos ar iNOS promotoru nepierāda rezultātu par STAT3, lai gan abas olbaltumvielas pieder STAT saimei. Rezultāts par IL-6 serumā nepierāda samazinātu inflamasomas kompleksa veidošanos: eksperimentā vēderplēves dobumā IL-1beta līmenis samazinājās, bet IL-6 līmenis nemainījās. Katrai rindai vajadzīgs savs ierosinātājs un mērāmais rādītājs. Tādēļ, lasot metilēnzilā pētījumus šūnās, dzīvniekos un klīniskajā vidē, katrs apgalvojums jāsasaista ar līmeni, kurā veikti mērījumi.

Nekas no tā nenosaka devas, drošumu vai ieguvumu cilvēkiem. Lipopolisaharīda modeļi ir kontrolēti ierosinātāji mehānisma pārbaudei, nevis hroniskas slimības atveidojumi. Vielas ievadīšana līdztekus ierosinātājam pārbauda inducētu izmaiņu novēršanu, nevis jau attīstītas slimības novēršanu. Nodaliet šo mehānismu aprakstu no pacientu iznākumiem un jebkuru apgalvojumu par veselību vērtējiet pēc pacientu pētījuma, kas to pamato.