Metilēnzilais G6PD laboratoriskajos testos: kāda patiesībā ir krāsvielas loma

Students pēc inkubācijas vēro divas mēģenes. Vienā ir izveidojusies gaidītā krāsa. Otrā — ne. Students secina, ka otrajam pacientam ir glikozes-6-fosfātdehidrogenāzes deficīts. Šis secinājums var būt pareizs, taču spriedumā ir izlaists princips, kas nodrošina testa darbību. Mēģenē nekas tieši nemēra pašu enzīmu. Tajā mēra enzīma radīto produktu, izmantojot metilēnzilo kā starpnieku.

Kad šis netiešās noteikšanas princips ir skaidrs, procedūra, kontroles un garais kļūdaino rezultātu saraksts vairs nešķiet patvaļīgi.

Īsā atbilde

Metilēnzilais G6PD testēšanā ir redoksindikators. Enzīms G6PD veido NADPH, un no NADPH atkarīgas sistēmas reducē zilo metilēnzilo līdz tā bezkrāsainajai leikoformai vai izmanto to elektronu pārnesei. Normāla enzīma aktivitāte nodrošina efektīvu reducēšanu. Deficīta gadījumā reducēšana ir lēna vai nepilnīga. Tas arī ir viss signāls.

Divās vēsturiskās metodēs izmanto vienu un to pašu krāsvielu, taču atšķiras reakcijas galarezultāts. Nošķirot šīs metodes, lielākā daļa neskaidrību pazūd.

Divi testi, viena krāsviela, atšķirīgi galarezultāti

Pirmais ir tiešais metilēnzilā reducēšanas tests, ko aprakstīja Sass un kolēģi un vēlāk izvērtēja Gibbs. Šajā gadījumā vērtē pašas krāsvielas izmaiņas: oksidētais zilais metilēnzilais tiek reducēts līdz bezkrāsainam leikometilēnzilajam, un šo izmaiņu ātrums atspoguļo spēju veidot NADPH. Sākotnējais raksts par skrīningu ir indeksēts PubMed kā Sass un kolēģu publikācija (1966).

Otrais ir Brewer methemoglobīna reducēšanas tests. Nātrija nitrīts vispirms oksidē hemoglobīnu līdz brūnam methemoglobīnam. Pēc tam metilēnzilais darbojas kā elektronu pārneses starpnieks: reducētais metilēnzilais nodod reducējošos ekvivalentus methemoglobīnam, pārvēršot to atpakaļ par sarkanu hemoglobīnu. Tāpēc redzamais galarezultāts ir brūna vai sarkana krāsa, nevis zila vai bezkrāsaina. Sākotnējā metode tika publicēta Pasaules Veselības organizācijas biļetenā (Brewer un kolēģi, 1960).

No ķīmijas viedokļa nav precīzi saukt Brewer analīzi par krāsvielas atkrāsošanās testu. Krāsviela cikliski maina savu redoksstāvokli; krāsu maina hemoglobīns. Tālāk redzamā shēma attēlo abus reakciju ceļus.

Pamatreakcija

G6PD katalizē pentožu fosfātu ceļa pirmo oksidatīvo posmu:

Glikozes-6-fosfāts + NADP+ pārvēršas par 6-fosfoglukonolaktonu + NADPH + H+

Nobriedušie eritrocīti NADPH iegūšanā lielā mērā ir atkarīgi no šī ceļa, kā aprakstīts Luzzatto un kolēģu pārskatā žurnālā Blood (2020). NADPH uztur glutationu reducētā formā un aizsargā šūnu pret oksidatīviem bojājumiem. Metilēnzilais iesaistās šajā sistēmā kā elektronu akceptors. Pietiekama G6PD aktivitāte nodrošina pietiekamu NADPH daudzumu, kas savukārt nodrošina efektīvu reducēšanu. Zema G6PD aktivitāte pārtrauc šo ķēdi jau pirmajā posmā.

Uztveriet krāsvielu kā degvielas līmeņa rādītāju, nevis dzinēju. Tā sniedz informāciju par NADPH pieejamību. Jebkurš cits faktors, kas maina tā pieejamību vai testa rādījumu, var izmainīt rezultātu bez jebkādām izmaiņām gēnā.

Kā norit Brewer tipa procedūra

Reaģentu sastāvs gadu desmitu gaitā ir mainījies, tāpēc mācību aprakstu nedrīkst uztvert kā klīnisku protokolu. Katra laboratorija ievēro savu validēto standarta darbības procedūru. Ņemot vērā šo brīdinājumu, klasiskā procedūra mēģenēs norit šādi; variants ar trim mēģenēm un 3 stundu inkubāciju ir dokumentēts šajā publicētajā metodes pielietojumā:

1. Pacienta mēģene: pilnasinis kopā ar glikozi, nātrija nitrītu un metilēnzilo. Nitrīts veido methemoglobīnu, glikoze nodrošina eritrocītu vielmaiņu, un krāsviela nodrošina no NADPH atkarīgu elektronu pārnesi.
2. Oksidētā kontrole: asinis kopā ar nitrītu un glikozi, bet bez metilēnzilā. Tā parāda brūno methemoglobīna galarezultātu — deficītam raksturīgo ainu.
3. Hemoglobīna kontrole: asinis kopā ar ūdeni. Tā parāda sarkano hemoglobīna galarezultātu — normai raksturīgo ainu.
4. Inkubējiet visas mēģenes aptuveni 37 C temperatūrā, parasti 3 stundas, saudzīgi samaisot.
5. Atšķaidiet nelielu alikvotu no katras mēģenes destilētā ūdenī, lai lizētu šūnas un ļautu skaidri salīdzināt krāsas.
6. Salīdziniet pacienta mēģeni ar abām kontrolēm. Krāsas atgriešanās sarkanās krāsas virzienā norāda uz ievērojamu reducēšanas spēju. Brūnās krāsas saglabāšanās liecina par izteiktu deficītu.

Vienā vēsturiskā sastāva variantā izmantoja aptuveni 1 mL asiņu un reaģentus ar aptuvenām koncentrācijām: 180 mM nātrija nitrīta, 280 mM dekstrozes un 0.4 mM metilēnzilā. Uztveriet šos skaitļus kā piemēru no literatūras, nevis universālu specifikāciju.

Rezultāta nolasīšana

Kvalitatīvs skrīnings vislabāk atšķir aktivitātes līmeņus aptuveni 30 līdz 40 procentu robežās no normālās aktivitātes, kā aplūkots šajā Malaria Journal pārskatā par G6PD noteikšanas nepilnībām. Tādēļ normāls skrīninga rezultāts nozīmē, ka analīze nav konstatējusi smagu deficītu. Tas neapstiprina pilnīgi normālu aktivitāti.

Kāpēc skrīnings var maldināt

Retikulocitoze pēc hemolīzes ir klasisks kļūdaini normāla rezultāta cēlonis. Jaunos eritrocītos un retikulocītos ir vairāk G6PD nekā vecās šūnās. Akūtas hemolīzes epizodes laikā vecākās šūnas ar visizteiktāko deficītu jau var būt iznīcinātas, atstājot jaunu šūnu populāciju, kuras aktivitāte testā ir normāla. Šis pats bioloģiskais mehānisms maldina arī kvantitatīvās analīzes, ne tikai skrīningu ar krāsvielu.

Nesena asins pārliešana maskē deficītu, jo donora eritrocīti paraugā ienes savu enzīmu. Mayo Clinic Laboratories min asins pārliešanu starp neuzticamu enzīma noteikšanas rezultātu cēloņiem līdzās retikulocitozei un leikocītu interferencei.

Heterozigotas sievietes ir vissarežģītākais gadījums. Nejauša X hromosomas inaktivācija rada normālu eritrocītu un eritrocītu ar deficītu sajaukumu, un kopējā aktivitāte var būt jebkurā līmenī — no izteikta deficīta līdz šķietami normālai. Kvalitatīvs skrīnings bieži neatklāj starpposma fenotipus. PVO dokumentācijā par G6PD testēšanu šis ierobežojums ir detalizēti aplūkots.

Parauga vecums, uzglabāšanas temperatūra, vizuālā galarezultāta subjektivitāte, hematokrīts un reaģentu kvalitāte papildus šiem bioloģiskajiem faktoriem rada analītisko variāciju.

Skrīnings nav diagnoze

Skrīninga rezultāts, kas liecina par deficītu, ir starpposma vai neatbilst klīniskajai ainai, prasa kvantitatīvu G6PD enzīma aktivitātes noteikšanu. PVO par references metodi uzskata kvantitatīvu spektrofotometriju kontrolētā temperatūrā. Šajā analīzē eritrocītu hemolizātam pievieno glikozes-6-fosfātu un NADP+, un izveidotā NADPH daudzumam seko pēc absorbcijas pieauguma pie 340 nm. Izmaiņu ātrums ir proporcionāls enzīma aktivitātei, ko parasti izsaka aktivitātes vienībās uz gramu hemoglobīna. Pašreizējā klīnisko laboratoriju prakse ir apkopota Mayo testu kataloga ierakstā par G6PD aktivitāti.

Interpretācijā izmanto laboratorijas validēto references intervālu, ko bieži izsaka attiecībā pret normālo aktivitāti populācijā; deficītu parasti aplūko saistībā ar 30 procentu slieksni, bet starpposma aktivitāti — virs tā. PVO G6PD testu mērķproduktu profilos (2022) ir izklāstīts šis diagnostikas ietvars. Ja nesena hemolīze vai asins pārliešana padara fenotipa noteikšanu neuzticamu, testēšanu atkārto pēc tam, kad eritrocītu populācija atkal ir līdzsvarojusies; molekulārā testēšana var sniegt papildu informāciju, neaizstājot enzīma aktivitātes mērījumu.

Robeža, ko vērts saglabāt

Metilēnzilais šajās analīzēs ir ex vivo laboratorijas reaģents. Šis lietojums ir jānošķir no jautājuma par metilēnzilā ievadīšanas drošumu pacientam, kas aplūkots materiālā par metilēnzilā kontrindikācijām. Bioķīmija abus kontekstus saista, jo arī zāļu darbība ir atkarīga no NADPH atkarīgas reducēšanas, tomēr krāsviela mēģenē nav deva asinsritē. Lai izprastu, kā krāsviela darbojas kā krāsošanas līdzeklis citā kontekstā, skatiet metilēnzilā krāsošanas principus, bet par ķīmisko grupu, kurai tā pieder, — redokskrāsvielas laboratorijā.

Skrīnings pārbauda, vai reducēšanas spēja šķiet saglabāta. Apstiprinoša testēšana noskaidro, cik daudz enzīma patiesībā ir. Krāsviela labi palīdz atbildēt uz pirmo jautājumu, ja vien no tās negaida atbildi uz otro.