Metilēnzilais DNS un RNS krāsošanai: izmantošana gelos un uz membrānām

Students veic elektroforēzi agarozes gelā, nokrāso to ar metilēnzilo un vietā, kur gaidīta spilgta josla, neredz neko. Pie blakus darba vietas pēcdoktorantūras pētnieks nokrāso Northern blota membrānu ar krāsvielu no tās pašas zilās pudeles un trīs minūtēs iegūst skaidras ribosomālās joslas. Students secina, ka gelu elektroforēze nav izdevusies. Taču tā nav neveiksme. Abi uzdevumi bija atšķirīgi, un viena un tā pati krāsviela tos risina ar atšķirīgu jutību, atšķirīgu fonu un atšķirīgiem turpmākās darba gaitas noteikumiem.

DNS un RNS krāsošanai ar metilēnzilo ir kopīga ķīmija, taču atšķirīgs mērķis. Gelā krāsviela parāda, cik daudz nukleīnskābes atrodas porainā matricā. Uz membrānas tā parāda, vai pārnese ir izdevusies un vai celiņos iepildīts vienāds parauga daudzums. Kad šī atšķirība ir skaidra, kļūst saprotami arī protokoli, noteikšanas robežas un saderības ierobežojumi.

Īsā atbilde

Metilēnzilais ir planāra katjonu krāsviela, kas nekovalenti un atgriezeniski saistās ar nukleīnskābēm, apvienojot elektrostatisko pievilkšanos fosfātgrupām, interkalāciju starp bāzu pāriem un saistīšanos mazajā rievā. Tieši atgriezeniskums ir būtisks. Joslas var nokrāsot, apskatīt redzamajā gaismā, dokumentēt un pēc tam atkrāsot vai attīrīt klonēšanai, hibridizācijai vai atkārtotai zondēšanai.

Divpavedienu DNS krāsošanai agarozes gelā ar metilēnzilo standarta ātrais protokols paredz 0.02 procentu masas/tilpuma šķīdumu ūdenī (200 mikrogramu uz mL), aptuveni 15 minūšu krāsošanu un aptuveni 15 minūšu atkrāsošanu ūdenī, pēc tam apskati uz baltās gaismas transiluminatora. Membrānām klasiskā Northern blota recepte paredz 0.02 līdz 0.04 procentu krāsvielas šķīdumu nātrija acetātā ar pH ap 5.2, dažu minūšu krāsošanu pēc pārneses un imobilizācijas, pēc tam skalošanu ūdenī un pilnīgu atkrāsošanu pirms hibridizācijas. Jutība ir pieticīga: labos apstākļos vienā gela joslā var noteikt desmitiem līdz simtiem nanogramu, savukārt piesardzīgākās vadlīnijās norādīti 0.5 līdz 1 mikrogramam. Tas ir par vairākām kārtām lielāks daudzums nekā etīdija bromīdam un SYBR krāsvielām. Membrānām nav lietderīgi norādīt vienu atsevišķa transkripta noteikšanas robežu, jo krāsojums galvenokārt parāda lielā daudzumā esošo ribosomālo RNS un kopējo uzklāto materiālu. Nevienā no šīm receptēm neaizstājiet laboratorijas krāsvielu ar mazumtirdzniecībā pieejamu uztura bagātinātāja šķīdumu. Validētās metodes paredz analītiskās tīrības krāsvielu, noteikta sastāva buferšķīdumus un, strādājot ar RNS, apstākļus bez RNāzēm.

Kā notiek saistīšanās un kur tā var maldināt

Praktiski noderīgajam modelim ir trīs daļas. Pirmkārt, pozitīvi lādēto gredzenu sistēmu pievelk negatīvi lādētais fosfātu karkass. Spektroskopiskos pētījumos konstatēts, ka zemā sāļu koncentrācijā dominē šī elektrostatiskā mijiedarbība, savukārt modelēšanā un molekulārajā dinamikā interkalācija un saistīšanās mazajā rievā saglabājas kā stabili divpavedienu DNS saistīšanās veidi, kā apkopots spektroskopiskā pētījumā par metilēnzilā saistīšanos ar DNS. Otrkārt, pastāv zināma priekšroka GC: modelēšana dod priekšroku CpG un GpC posmiem, un eksperimentos par metilēnzilā interkalācijas priekšrocībām novērota izteiktāka saistīšanās ar GC bagātiem dupleksiem, taču saistīšanās notiek arī ar AT dupleksiem. Ikdienas krāsošana nav secībai specifiska. Treškārt, vienpavediena DNS un RNS saistās galvenokārt ar elektrostatisko mijiedarbību un stekingu ar pieejamām bāzēm un dupleksu reģioniem, tāpēc krāsojuma intensitāte mainās atkarībā no garuma, secības un sekundārās struktūras.

No tā izriet divas sekas. Tā kā saistīšanās ir nekovalenta, krāsviela izskalojas. Poliakrilamīda joslas ātri izbalē, ja tās īpaši nefiksē, un tieši tāpēc, ka parastais krāsojums ir īslaicīgs, pastāv atsevišķs pastāvīgas fiksācijas variants, ko Soto un Draper aprakstījuši PAGE geliem. Tā kā krāsviela ir fotosensibilizators, ilgstoša, spilgta apgaismošana skābekļa klātbūtnē var oksidēt guanīnu nokrāsotajā DNS un galu galā radīt vienpavediena pārrāvumus; šis mehānisms detalizēti aprakstīts pētījumā par metilēnzilā sensibilizētu guanīna oksidāciju. Īsa apskate baltajā gaismā ļauj izvairīties no labi zināmajiem UV izraisītajiem bojājumiem klasiskajās etīdija bromīda darba gaitās, un preparatīvai DNS atgūšanai tā ir reāla priekšrocība. Redzamā gaisma ir saudzīgāka, nevis nekaitīga. Ja DNS paredzēts klonēt, apgaismojiet to īslaicīgi. Plašāku šī piesardzības ieteikuma fotoķīmisko pamatojumu skatiet rakstā par diviem metilēnzilā fotoķīmijas ceļiem. Par oksidēšanās–reducēšanās pāri un lādiņa stāvokļiem, kas izskaidro, kāpēc oksidētā forma saistās, bet reducētā ne, lasiet rakstā par metilēnzilā struktūras un īpašību ķīmiju.

Pirmais uzdevums: krāsošana gelos

Gela krāsošana atbild uz vienu jautājumu: vai šajā joslā ir pietiekami daudz nukleīnskābes, lai to saskatītu ar aci. Vislabāk raksturotais gadījums ir divpavedienu DNS agarozē. Flores un kolēģu sākotnējā gelu krāsošanas metode ar metilēnzilo validēja ātro 0.02 procentu protokolu 1 procenta agarozē un parādīja sekmīgu DNS atgūšanu un klonēšanu pēc krāsošanas. Tas pats piegādātāja protokols atrodams IBI Scientific metilēnzilā produkta lapā, kur līdzās norādīta 0.04 procentu recepte membrānām un ātrais variants geliem.

Praktiskā darba gaita:

1. Veiciet elektroforēzi gelā kā parasti. Krāsojiet pēc elektroforēzes, nevis tās laikā, ja vien modificētai metodei nav validēta pārnese vai izšķirtspēja.
2. Iegremdējiet gelu 0.02 procentu masas/tilpuma metilēnzilā šķīdumā destilētā ūdenī un viegli šūpojiet aptuveni 15 minūtes.
3. Atkrāsojiet, vairākas reizes nomainot ūdeni, kopumā aptuveni 15 minūtes, līdz matricas fons mazinās un joslas kļūst skaidri saskatāmas.
4. Nekavējoties nofotografējiet uz baltās gaismas transiluminatora.

Agaroze un poliakrilamīds uzvedas atšķirīgi. Agaroze aiztur krāsvielu matricā, tāpēc atkrāsošana ir lēnais posms. Plāni poliakrilamīda geli ātri nokrāsojas, taču arī ātri zaudē krāsvielu; tas palīdz preparatīvai joslu izgriešanai, bet apgrūtina ilgtermiņa dokumentēšanu. Sintētiskos oligonukleotīdus poliakrilamīdā var lokalizēt ar to pašu 0.02 procentu šķīdumu 20 līdz 30 minūtēs, atkārtoti skalojot ar ūdeni un ievērojot nostiprinātās Current Protocols tipa PAGE metodes. Aprakstīti arī ļoti atšķaidīti varianti ar aptuveni 0.0002 procentu koncentrāciju atšķaidītā TBE preparatīviem oligonukleotīdiem vairāku stundu laikā, taču to pierādījumu bāze ir vājāka.

Atšķirība starp DNS un RNS ir svarīga. Divpavedienu DNS nodrošina visizteiktāko strukturēto saistīšanos. RNS un vienpavediena DNS nokrāsojas, taču vājāk un mazāk paredzami. Strādājot ar formaldehīda agarozes RNS geliem, lielākā daļa laboratoriju izlaiž krāsošanu ar metilēnzilo gelā un vispirms pārnes RNS uz membrānu, pēc tam krāso tur. Šādi vājš signāls gelā tiek aizstāts ar skaidrāku signālu uz membrānas un parauga daudzuma dokumentāciju.

Otrais uzdevums: krāsošana uz membrānām

Membrānas krāsošana atbild uz citu jautājumu: vai pārnese ir izdevusies un vai celiņi ir salīdzināmi. Klasiskais lietojums ir Herrin un Schmidt atgriezeniskā Northern blota krāsošana: sākotnēji tā paredzēja 0.04 procentu krāsvielas šķīdumu 50 mM nātrija acetātā ar pH 5.0, krāsošanu 2 līdz 3 minūtes un skalošanu ar ūdeni; pirms hibridizācijas krāsvielu varēja noņemt ar atšķaidītu SDS SSPE šķīdumā.

Plaši izmantotais mūsdienu variants ir šāds:

1. Pārnesiet RNS vai denaturētu DNS uz neilona vai nitrocelulozes membrānu, pēc tam imobilizējiet ar UV šķērssaistīšanu vai karsēšanu, lai krāsošanas laikā paraugs netiktu zaudēts.
2. Neobligāti, bet bieži izmantots solis: samitriniet membrānu 5 procentu etiķskābē aptuveni 15 minūtes.
3. Krāsojiet 5 līdz 10 minūtes 0.02 līdz 0.04 procentu metilēnzilā šķīdumā 0.3 līdz 0.5 M nātrija acetātā ar pH ap 5.2.
4. Skalojiet un atkrāsojiet ūdenī 5 līdz 15 minūtes, dokumentējiet un pēc tam pirms hibridizācijas noņemiet atlikušo krāsvielu.

Northern blota darbos dominē pozitīvi lādēts neilons. Arī nitroceluloze ir piemērota tai pašai darba gaitai ar etiķskābi un acetātu. Attēlu izmanto, lai apstiprinātu pārnesi, salīdzinātu 28S un 18S joslas (vai 23S un 16S baktēriju RNS gadījumā), atzīmētu izmēra marķierus un standartus un saglabātu aptuvenu kopējās RNS normalizācijas dokumentāciju. Publicētās Northern blota metodēs parauga daudzuma pārbaudēm kvantificē nokrāsotās ribosomālās joslas, tostarp piena zinātnes pētījumā, kurā normalizācijai izmantoja ar metilēnzilo nokrāsotas ribosomālās joslas. Tādā pašā veidā var vizualizēt Southern blota membrānas, taču krāsviela ir daudz labāk nostiprinājusies kā Northern blota parauga daudzuma un pārneses pārbaudes līdzeklis. Turklāt Southern blotā DNS pirms pārneses tiek denaturēta, tāpēc gelu jutības rādītājus uz to nevar attiecināt.

Noteikšanas robežas un fons: kur metilēnzilais zaudē

Tālāk sniegtais salīdzinājums ir apzināti aptuvens. Krāsvielas veiktspēja ir atkarīga no gela koncentrācijas, joslas platuma, optikas un rūpīgas atkrāsošanas. Katru skaitli uztveriet kā lieluma kārtu, nevis specifikāciju.

Fona kontrole nosaka, vai pieticīgais signāls ir izmantojams. Brīvā krāsviela ir intensīvi iekrāsota, tāpēc kontrastu iegūst, noņemot nesaistīto krāsvielu, vienlaikus saglabājot saistīto. Koncentrētāks krāsošanas šķīdums reti palielina jutību. Tas galvenokārt pagarina atkrāsošanas laiku. Izmēģiniet atšķaidījumu sēriju ar konkrēto gelu, membrānu un kameru un izmantojiet tikai diapazonu, kurā integrētais blīvums saglabājas proporcionāls ievadītajam daudzumam. Metilēnzilais ļauj veikt puskvantitatīvu parauga daudzuma normalizāciju. Tā nav kvantitatīva analīze ar plašu dinamisko diapazonu, jo membrānas saistīšanas kapacitāte, pārneses efektivitāte, piesātinājums un atkrāsošana dažādos celiņos atšķiras.

Saderības ierobežojumi: kas saglabājas pēc krāsošanas

Klonēšana pēc krāsošanas ar metilēnzilo ir pierādīta. Flores un kolēģi izgrieza nokrāsotās agarozes joslas, atguva DNS, veica ligēšanu un transformāciju un ziņoja par labākiem klonēšanas rezultātiem nekā pēc etīdija bromīda krāsošanas un UV apgaismošanas. Ticamākais iemesls ir mazāki fotobojājumi, nevis pašas krāsvielas labvēlīga ietekme. Ierobežojiet baltās gaismas iedarbību un attīriet atgūto DNS ar parastu ekstrakcijas no gela attīrīšanas procedūru.

Pierādījumu par PĶR un sekvenēšanu ir mazāk. Atlikusī krāsviela saistās ar nukleīnskābēm, tāpēc pirms enzīmu darbības posmiem veiciet atkrāsošanu un attīrīšanu. Sagaidāms, ka pienācīgi attīrīta DNS no ar metilēnzilo krāsota gela būs izmantojama, taču dažādu polimerāžu un sekvenēšanas ķīmiju tolerance pret pārnestajiem krāsvielas atlikumiem nav labi kvantificēta. Nepieņemiet to kā pašsaprotamu.

Blota hibridizācija ir saderīga ar krāsošanu, ja stingri ievēro secību: pārnese, imobilizācija, krāsošana, dokumentēšana, atkrāsošana, hibridizācija. Šādu secību paredz Herrin un Schmidt metode. Krāsošana pirms pārneses vai atkrāsošanas izlaišana ir cita metode, kurai nepieciešama atsevišķa validācija. Pēc krāsvielas noņemšanas standarta zondes noņemšanu un atkārtotu zondēšanu veic kā parasti. Par šīs pašas krāsvielu saimes izmantošanu šūnu krāsošanā un to, kāpēc fiksētu uztriepju pieeju nevar pārnest uz dzīvu šūnu metodēm, lasiet mikroskopiskās krāsošanas atlantā.

Joslu izgriešana ir piemērota preparatīviem agarozes geliem un PAGE oligonukleotīdiem, kas lokalizēti ar metilēnzilo, ja vien neizmanto pastāvīgas fiksācijas variantu. Elektroelūcija pēc atkrāsošanas ir ķīmiski pamatota atgriezeniski saistošai krāsvielai, taču kontrolētu iznākuma datu tieši par metilēnzilo ir maz. Pēc eluēšanas veiciet atsāļošanu vai izgulsnēšanu.

Kļūmes, kas atkārtojas

Blāvas joslas gelā parasti nozīmē, ka kolorimetriskai krāsošanai masas ir par maz, īpaši īsiem vienpavediena vai RNS mērķiem. Iepildiet vairāk parauga, izmantojiet svaigu krāsošanas šķīdumu, pirms koncentrācijas palielināšanas pagariniet krāsošanas laiku un pārtrauciet atkrāsošanu agrāk. Vienmērīgi zils gels bez kontrasta parasti nozīmē pārmērīgu krāsošanu vai pārāk maz ūdens maiņu. PAGE joslu izbalēšana ir sagaidāma ķīmiska parādība, nevis neveiksmīga krāsošana. Fotografējiet ātri. Nevienmērīgs membrānas fons norāda uz krokām, burbuļiem, pirkstu nospiedumiem, nevienmērīgu šūpošanu vai nevienmērīgu pārnesi. Bez hibridizācijas kontroles neinterpretējiet to kā nevienādu parauga daudzumu. Izplūdis, vājš ribosomālo joslu raksts var liecināt par degradāciju, taču arī par nepilnīgu pārnesi, pārāk mazu kopējās RNS daudzumu (parasti vienā celiņā ir no dažiem līdz vairākiem desmitiem mikrogramu) vai pārmērīgu atkrāsošanu. Krāsviela parāda lielā daudzumā esošo ribosomālo RNS. Tā neparāda konkrētu transkriptu. Tas ir zondes uzdevums.

Drošība un apiešanās bez pārspīlētiem apgalvojumiem

Ar metilēnzilo ir vienkāršāk strādāt nekā ar etīdija bromīdu, taču tas nav nekaitīgs. Pašreizējā MilliporeSigma drošības datu lapā krāsviela klasificēta kā akūti toksiska norijot, 4. kategorija, kaitīga, ja norīta, un tā jāutilizē pa apstiprinātu atkritumu apsaimniekošanas ceļu saskaņā ar Sigma-Aldrich metilēnzilā drošības datu lapu. Etīdija bromīdam ir stingrāki brīdinājumi par genotoksicitāti, tostarp aizdomām par ietekmi uz dzimumšūnām tā Sigma-Aldrich etīdija bromīda drošības datu lapā, un tā gelus un šķīdumus parasti savāc atsevišķi kā bīstamos ķīmiskos atkritumus, kā norādīts Thermo Fisher nukleīnskābju krāsvielu ceļvedī. Abos gadījumos ievērojiet drošības datu lapu un iestādes noteikumus. Sauso krāsvielu glabājiet cieši noslēgtu un sausu, darba šķīdumu izmantojiet atkārtoti tikai tad, ja to atļauj protokols, nokrāsotās membrānas glabājiet sausas starp filtrpapīra loksnēm un gelus fotografējiet, pirms joslas izplūst difūzijas dēļ.

Atcerieties īso formulējumu darbam pie laboratorijas galda. Geli pārbauda saskatāmību baltajā gaismā, ja parauga daudzums ir liels. Membrānas pārbauda pārnesi un parauga daudzumu, pirms zonde veic jutīgo noteikšanu. Viena krāsviela kalpo abiem mērķiem — ar pieticīgu jutību, atgriezenisku saistīšanos un stingru darbību secību.