Raksts
Metilēnzilā reducēšanās tests pienam: princips un ierobežojumi
Studente paceļ divas mēģenes ar pienu. Vienā piens stundas laikā kļuva balts. Otrā tas palika zils piecas stundas. Viņa norāda uz zilo mēģeni un saka, ka šo pienu ir droši dzert.
Šis secinājums atklāj kļūdainu izpratni. Piena tests ar metilēnzilo nenosaka drošumu. Tas parāda, cik ātri mikroorganismu populācija konkrētajā mēģenē pazemina redokspotenciālu noteiktos apstākļos. Lēns rezultāts nozīmē zemu kopējo metabolisko aktivitāti paraugā. Tas neko nepasaka par to, kādi organismi ir klātesoši, vai starp tiem ir patogēns un vai piens ir pareizi pasterizēts.
Šī atšķirība ir svarīga, jo tests izskatās pārliecinošs. Zilā krāsa izzūd. Pulkstenis dod skaitli. Skaitļi mudina izdarīt pārāk plašus secinājumus. Šajā rakstā saglabāta lietderīgā interpretācija un norādīts, kā izvairīties no nedrošās.
Ko reducēšanās patiesībā mēra
Metilēnzilais oksidētā stāvoklī ir zils un, reducējoties līdz leikometilēnzilajam, kļūst gandrīz bezkrāsains. Svaigs piens satur izšķīdušu skābekli, kas uztur krāsvielu zilu. Baktērijas, kas veic elpošanu un fermentāciju, patērē šo skābekli un izdala reducējošus savienojumus. Kad redokspotenciāls pietiekami pazeminās, krāsviela pieņem elektronus un zaudē krāsu. Gvelfas Universitātes piena mikrobioloģijas mācību materiālā aprakstīta tā pati secība: vispirms tiek patērēts skābeklis, pēc tam baktēriju metabolisma laikā veidojas reducējošas vielas.
Klasiskā pētījumā žurnālā Journal of Dairy Science tas aprakstīts kā divu posmu process: mikroflora vispirms izsmeļ skābekli, tad piena sastāvdaļas strauji reducē krāsvielu. Tāpēc metilēnzilā reducēšanās tests pienam vislabāk saprotams kā kopējās metaboliskās aktivitātes funkcionāls tests, nevis šūnu skaitītājs. Metilēnzilā redoksīpašības izskaidro šīs pārejas ķīmisko pamatu.
Skābeklis maina gala stāvokli pretējā virzienā. Reducētā leikoforma, nonākot saskarē ar gaisu, atkārtoti oksidējas un atkal kļūst zila. Tāpēc kratīšana, pārliešana, platas mēģenes un liela gaisa telpa virs parauga aizkavē rezultātu. Pie saskares virsmas ar gaisu bieži saglabājas plāns zils gredzens arī pēc tam, kad pārējais šķidrums mēģenē ir zaudējis krāsu. Standarta procedūrās šo gredzenu pieļauj, nevis gaida tā izzušanu.
Organismu veids rada vēl vienu izkropļojumu. Koliformās baktērijas un daudzi pienskābes mikroorganismi krāsvielu reducē ātri. Daudzi psihrotrofie un termodurie mikroorganismi to reducē lēni vai gandrīz nemaz. Divi piena paraugi ar vienādu koloniju skaitu uz plates var zaudēt zilo krāsu ar vairāku stundu starpību. Šis fakts vien jau izslēdz iespēju pārrēķināt laiku koloniju skaitā.
Kontrolēta laboratorijas procedūra
Ārpus laboratorijas un mācību grāmatās aprakstītās versijas atšķiras detaļās, tāpēc rezultāts ir derīgs tikai tās metodes ietvaros, ar kuru tas iegūts. Parasta pārtikas laboratorijas procedūra ir šāda:
- Ievāc svaigpienu, pēc iespējas samazinot aerāciju, un nekavējoties to atdzesē. Pirms parauga ņemšanas samaisa, saudzīgi apgriežot trauku.
- Sterilā mēģenē iepilda 10 mL piena un 1 mL krāsvielas darba šķīduma. Viena plaši izmantota darba koncentrācija ir 0.005 procenti krāsvielas, un piena un krāsvielas šķīduma attiecība ir 10 pret 1.
- Mēģeni aizkorķē, divreiz saudzīgi apgriež un dažu minūšu laikā ievieto ūdens vannā. Parastā inkubācijas temperatūra ir 35 līdz 38 grādi pēc Celsija atkarībā no konkrētā standarta. Pieraksta, kurš standarts tiek ievērots.
- Inkubācijas laikā mēģenes sargā no gaismas, jo gaisma paātrina reducēšanos.
- Rezultātu nolasa pēc 30 minūtēm un pēc tam noteiktos intervālos. Beigu punkts ir brīdis, kad mēģenes saturs atbilst vārīta piena references paraugam vai sasniedz procedūrā noteikto krāsas zudumu.
- Ja metode to paredz, vizuālai kontrolei saglabā mēģeni ar to pašu pienu bez krāsvielas pievienošanas.
FAO piena testēšanas rokasgrāmatā sniegta skaidri aprakstīta šīs secības versija izmantošanai ārpus laboratorijas: 10 mL piena un 1 mL krāsvielas šķīduma, aizkorķēšana, saudzīga apgriešana, inkubācija aptuveni 37 līdz 38 grādu temperatūrā un rezultāta nolasīšana ik pēc 30 minūtēm. Kontroles mēģenēs izmanto vārītu pienu, lai iznīcinātu dabisko reducējošo sistēmu un nodrošinātu atskaites punktu krāsas salīdzināšanai.
Iepriekš redzamā shēma nosaka kontrolēto apstākļu robežas. Vienādi tilpumi, viena un tā pati krāsviela, vienāda temperatūra, vienāda maisīšana, vienāda aizsardzība pret gaismu un vienāds beigu punkta noteikšanas kritērijs. Mainot kaut vienu no tiem, mainās arī izmērītais laiks. Tāpēc mājas apstākļos veikti testi ar patvaļīgi izvēlētu krāsvielas koncentrāciju nav salīdzināmi ar laboratorijas kvalitātes kategorijām.
Ko norāda reducēšanās laiks
Ilgāks laiks nozīmē zemāku kopējo aktivitāti norādītajos apstākļos. Īsāks laiks nozīmē augstāku kopējo aktivitāti. Piena nozares mācību tabulās šiem laikiem piešķir aptuvenas kvalitātes kategorijas, piemēram, vienā no BIS atvasinātā shēmā 5 vai vairāk stundas nozīmē ļoti labu kvalitāti, bet mazāk par 30 minūtēm — sliktu.
Galvenā atziņa ir vērtējumu atšķirība. 5 stundu rezultātam nav universālas kvalitātes kategorijas. Tas attiecas uz procedūru, kurā šis rezultāts definēts. Tāpēc pamatots rezultāta ziņošanas formāts ir šāds:
MBRT ir X stundas pēc norādītās metodes, kas atbilst šīs metodes kvalitātes kategorijai.
Tas nekad nav MBRT ir X koloniju veidojošās vienības uz mL. No Standard Methods atvasinātajās vadlīnijās norādīts, ka krāsvielas reducēšanās rezultātus nedrīkst ziņot kā baktēriju skaitu. Arī vienkāršās krāsošanas procedūra ar metilēnzilo atbild uz citu jautājumu, jo tā mikroskopā parāda šūnu formu, nevis kopējo aktivitāti mēģenē.
Interpretācijas un ierobežojumu tabula
Šī tabula ir rakstam izveidotais uzziņu materiāls. Lasiet visu rindu kopumā. Neviena atsevišķa šūna nav interpretējama atrauti no pārējām.
| Novērojums vai apgalvojums | Ko tas norāda | Ko tas nevar pierādīt | Galvenie ietekmējošie faktori |
|---|---|---|---|
| Strauja zilās krāsas izzušana, mazāk nekā 2 stundās vienā svaigpiena vērtēšanas shēmā | Augsta reducējošā aktivitāte, kas atbilst lielam mikroorganismu daudzumam vai sliktai uzglabāšanas kvalitātei | Sugas, precīzu skaitu, toksīnu klātbūtni vai pasterizācijas kļūmi | Uzglabāšana siltumā, mikroflora ar lielu koliformo baktēriju īpatsvaru, gaisma, mazs krāsvielas daudzums |
| Vidējs laiks, 2 līdz 4 stundas | Mērena aktivitāte; kvalitātes kategorija nosakāma tikai konkrētās shēmas ietvaros | Drošumu vai lēni reducējošu mikroorganismu neesamību | Augsta inkubācijas temperatūra, aerācijas atšķirības, tauku atdalīšanās |
| Lēna reducēšanās, 5 vai vairāk stundas | Zema kopējā aktivitāte attiecīgajā shēmā | Patogēnu neesamību, pasterizāciju vai ķīmisko drošumu | Antibiotiku atliekas, konservanti, papildu izšķīdušais skābeklis, liels krāsvielas daudzums |
| Pie virsmas saglabājas zils gredzens, kamēr pārējais šķidrums zaudē krāsu | Atkārtota oksidēšanās saskares virsmā ar gaisu, normāls efekts pie virsmas | Neizdevušos testu vai nepilnīgu reakciju | Plata mēģene, vaļīgs aizbāznis, atkārtota atvēršana pārbaudei |
| Balts saturs mēģenē pēc karsēta piena inkubācijas | Izmainīta reducējošā sistēma un izdzīvojušo mikroorganismu aktivitāte | To, ka karsēšana bija līdzvērtīga validētai pasterizācijai | Karstuma radīti bojājumi, atjaunošanās inkubācijas laikā, vēlāks piesārņojums |
| Jebkura atsevišķa MBRT vērtība, kas norādīta bez metodes | Testa apstākļi nav zināmi | Jebkādu kvalitātes kategoriju vai skaitu | Nav norādīts krāsvielas sastāvs, attiecība, temperatūra, maisīšana un beigu punkta noteikšanas kritērijs |
Uz augšanu balstītas pārbaudes, piemēram, baktēriju kultivēšana barotnēs, joprojām ir veids, kā noteikt mikroorganismu skaitu un tos izolēt. Reducēšanās mēģene ļauj veikt sākotnējo pārbaudi. Plate ļauj identificēt un saskaitīt.
Ko tests nevar pierādīt par drošumu
Lēns rezultāts nevar pierādīt patogēnu neesamību. Patogēns, kura daudzums ir klīniski nozīmīgs, var dot tikai nelielu ieguldījumu kopējā skābekļa patēriņā. Patogēnu noteikšanai izmanto konkrētiem organismiem paredzētas metodes, un pašreizējā Standard Methods izdevumā tā aplūkota kā atsevišķa joma, nevis vispārējā kvalitātes sākotnējā pārbaude.
Tests nevar pārbaudīt pasterizāciju. Termiskās apstrādes pārbaudei saskaņā ar Codex piena produktu higiēnas vadlīnijām izmanto sārmainās fosfatāzes testu vai citu validētu metodi. Balts vai zils saturs mēģenē neko nepasaka par partijas apstrādes laiku un temperatūru.
Tests nevar apliecināt pārtikas drošumu. Drošums ir atkarīgs no patogēniem, iepriekš izveidojušiem toksīniem, zāļu atliekām, ķīmiskiem piesārņotājiem, aukstuma ķēdes vēstures un piesārņojuma pēc parauga ņemšanas. Codex piena produktu drošumu aplūko kā kontroles pasākumu ķēdi, nevis vienas sākotnējās pārbaudes rezultātu.
Pārtikas laboratorijas apstākļi nav testēšana mājās
Piena laboratorijā testu izmanto piena sākotnējai pārbaudei pieņemšanas laikā, piegādātāju salīdzināšanai laika gaitā vai redoksmikrobioloģijas mācīšanai uzraudzībā. Paraugi ir izsekojami. Reaģenti ir standartizēti. Temperatūra tiek reģistrēta. Atkritumus nodod laboratorijas atkritumu apsaimniekošanai.
Testēšanai mājās nekā no tā nav. Virtuvē tilpumus mēra aptuveni. Tiešsaistē pārdoto krāsvielu koncentrācijas ievērojami atšķiras. Inkubācija bieži notiek siltā telpā, nevis kalibrētā ūdens vannā. Krāsas maiņa joprojām notiek, tāpēc rezultāts šķiet uzticams, lai gan trūkst visu kontroles pasākumu, kas tam piešķīra nozīmi.
Vēl lielāks risks ir rīcība pēc testa. Zils saturs mēģenē mājas apstākļos mudina dzert svaigpienu, ko laboratorija joprojām nosūtītu koloniju skaita noteikšanai uz platēm, patogēnu pārbaudēm un atliekvielu pārbaudēm. Piena tests ar metilēnzilo tika izstrādāts svaigpiena kvalitātes vērtēšanai pieņemšanas laikā, nevis piena atzīšanai par derīgu patēriņam. Ātrākajai sākotnējai pārbaudei ar rezazurīnu ir tāds pats ierobežojums: krāsas rezultāts ir iegūstams ātrāk, bet atbildes par patogēniem joprojām nav.
Īss noteikums darbam laboratorijā
Standartizējiet krāsvielu, attiecību, temperatūru, maisīšanu, apgaismojumu un beigu punktu. Ziņojiet laiku kopā ar metodes nosaukumu un kvalitātes kategoriju. Interpretējiet minūtes, ņemot vērā uzglabāšanas vēsturi, mikrofloras veidu, atliekvielas un parauga ņemšanas kvalitāti. Īss laiks norāda uz aktivitāti, kuru ir vērts izpētīt. Ilgs laiks nekad neapliecina drošumu.