Rauga testi ar metilēnzilo: dzīvo šūnu skaitīšana un elpošanas laika mērīšana

Uz laboratorijas galda stāv divas mēģenes. Abas ir zilas. Vienā zilas šūnas mikroskopā nozīmē, ka raugs ir nedzīvs. Otrā pāreja no zilas uz bezkrāsainu nozīmē, ka raugs ir dzīvs un elpo. Tā pati krāsviela, pretēja rezultātu nozīme. Sajaucot šos divus testus, visi secinājumi kļūst pretēji.

Šai atšķirībai ir veltīts viss raksts. Metilēnzilais ir oksidēšanās–reducēšanās krāsviela: oksidētā formā tas ir zils, reducētā formā — bezkrāsains leikometilēnzilais. Dzīvotspējas noteikšanā šo ķīmisko īpašību izmanto īsā mikroskopiskā novērojumā. Elpošanas eksperimentā to izmanto, mērot reakcijas norisi visā šķīduma tilpumā. Katram testam vajadzīgs savs protokols, savas kontroles un sava kritiskā pieeja.

Dzīvotspējas noteikšana: īslaicīga iekrāsošana un tūlītēja novērtēšana

Alus darīšanā izmantotais protokols ir visvairāk standartizētais variants. Sagatavojiet 0.01% w/v metilēnzilo 2% nātrija citrāta šķīdumā, sajauciet to attiecībā 1:1 ar rauga suspensiju un novērtējiet maisījumu pēc īsa, noteikta laika intervāla. Publicētie intervāli ir no 1 līdz 2 minūtēm Brewing Science Institute rokasgrāmatā līdz aptuveni 5 minūtēm pētniecības protokolos, savukārt OIV vīna mikrobioloģijas metode nosaka, ka novērtēšana jāveic 10 minūšu laikā. Krāsvielas gala koncentrācija skaitīšanai paredzētajā maisījumā ir aptuveni 0.005%. Uzpildiet uzlaboto Neubauer skaitīšanas kameru un aptuveni 400x palielinājumā klasificējiet tumši zilās šūnas kā dzīvotnespējīgas, bet neiekrāsotās — kā dzīvotspējīgas. OIV metodē gaiši zilās šūnas uzskata par dzīvām, un tas jau norāda uz tālāk aplūkoto subjektivitātes problēmu.

Šūnu koncentrāciju aprēķina pēc kameras ģeometrijas. Saskaitot šūnas visā centrālajā kvadrātā ar malas garumu 1 mm, šūnu skaits vienā mL ir N reiz atšķaidījuma koeficients reiz 10^4, kur N ir šajā laukumā saskaitīto šūnu skaits, kā norādīts ASBC rauga metodēs. Dzīvotspējas aprēķins ir vienkāršāks: neiekrāsoto šūnu skaitu dala ar kopējo šūnu skaitu un reizina ar 100. Dzīvotspējas novērtēšanai saskaitiet aptuveni 400 šūnu, ievērojot FEMS alus darītavu salīdzinošo pētījumu un OIV praksi. Konsekventi izmantojiet vienu robežlīniju noteikumu, piemēram, ieskaitiet šūnas uz apakšējās un kreisās režģa līnijas, bet neieskaitiet tās, kas atrodas uz augšējās un labās līnijas.

Pirms skaitīšanas jānosaka, kā uzskaitīt pumpurus. Bieži izmantots princips ir skaitīt pumpuru kā atsevišķu šūnu, kad tas sasniedz aptuveni pusi no mātes šūnas izmēra, bet mazāku pumpuru skaitīt kopā ar mātes šūnu. Neatkarīgi no izvēlētā noteikuma piemērojiet to katrā kvadrātā un ierakstiet darba lapā, lai nākamais skaitītājs varētu to atkārtot.

Skaitīšanas darba lapa (izdrukājiet)

Šī darba lapa ir oriģināls materiāls, kas izveidots šim rakstam. Pārrakstiet to piezīmju kladē vai izdrukājiet vienu lapu katram paraugam.

Dzīvotspēja (%) = 100 x neiekrāsotas / (neiekrāsotas + tumši zilas). Kopējais šūnu skaits vienā mL = N x atšķaidījuma koeficients x 10^4, kur N iegūts noteiktajā kameras laukumā. Pierakstiet iekrāsošanas intervālu blakus rezultātam, jo dzīvotspējas skaitliskais rādītājs bez laika norādes nav reproducējams.

Kāpēc dzīvotspējas rādītāji mainās

Laiks ir pirmais traucējošais faktors, un tas var ietekmēt rezultātu abos virzienos. Metaboliski aktīvas šūnas reducē krāsvielu, tāpēc pārāk agrīnā novērtējumā dzīvas šūnas var novērot, pirms tās ir pabeigušas krāsvielas reducēšanu, un kļūdaini klasificēt kā nedzīvas. Taču ilgstoša iedarbība pati par sevi ir toksiska un rada patiesi bojātas zilas šūnas, izraisot maldinošu iekrāsojumu, kas norāda uz šūnu nāvi. Tāpēc laboratorijas mācību protokols nosaka, ka novērtēšana jāveic 5 minūšu laikā, kā dokumentēts Viskonsinas rauga mācību protokolā. Piesardzīgs formulējums ir šāds: novērtējums ar metilēnzilo ir atkarīgs no laika, tāpēc izvēlieties vienu īsu intervālu un saglabājiet to nemainīgu visiem vienas sērijas paraugiem.

Paraugiem ar zemu dzīvotspēju ir vēl viens sistemātiskas kļūdas avots. Standartizētā metode brīdina, ka metilēnzilais var pārvērtēt patieso dzīvotspēju, ja tā ir zemāka par aptuveni 80%, jo šūnas, kas vēl reducē krāsvielu, ne vienmēr saglabā spēju vairoties. Alus darīšanas literatūrā aprakstīta tā pati neuzticamība, ja dzīvotspēja ir būtiski samazinājusies. Uztveriet metilēnzilo kā līdzekli ātram, aptuvenam novērtējumam un svarīgus lēmumus zemas dzīvotspējas gadījumā, piemēram, par kultūras atkārtotu pievienošanu misai, apstipriniet ar koloniju skaitīšanu uz barotnes platēm vai papildu iekrāsošanu.

Trešais faktors ir parauga matricas ietekme. OIV metode darbojas aptuveni pie pH 4.6 un brīdina, ka stipri buferēti paraugi ar zemu pH traucē krāsvielas pareizu darbību, kā arī neiesaka testu, ja cukura koncentrācija pārsniedz 100 g/L, jo šūnas tad izskatās maldinoši gaiši zilas. Eksperimentālā iekrāsošanas pH salīdzinājumā konstatētas būtiskas jutības izmaiņas pārbaudītajā diapazonā, kas atbilst pētījumam par metilēnzilā metodes atkarību no pH. Atsevišķs kļūdu avots ir piemaisījumu daļiņas: iekrāsotas daļiņas netīrās misās atgādina nedzīvas šūnas un palielina atšķirības starp dažādu skaitītāju rezultātiem.

Šīs atšķirības ir kvantitatīvi novērtētas, nevis balstītas tikai atsevišķos novērojumos. Sešus mēnešus ilgā alus darītavas izmēģinājumā, par kuru ziņots FEMS rauga metožu salīdzinājumā, dublētos mērījumos ar metilēnzilo standartnovirze vidēji bija 6.1%, salīdzinot ar 0.2% oks onola plūsmas citometrijā, un divu skaitītāju rezultāti vienam un tam pašam paraugam atšķīrās pat par 13 procentpunktiem. 2023. gada kvantitatīvā dzīvotspējas metožu salīdzinājumā fluorescences mikroskopija un plūsmas citometrija bija ievērojami precīzākas, vienlaikus parādot, ka metodes rezultāti ir atkarīgi no sugas un matricas. Klasiskais Painting un Kirsop metodes apraksts (PMID 24430080) joprojām ir atskaites avots, savukārt plašāks rauga dzīvotspējas un vitalitātes testu pārskats (PMID 25154541) ierindo metilēnzilo starp papildinošiem, nevis izšķirošiem testiem. Tripānzilais šeit nav automātiski labāka izvēle: tas norāda uz membrānas integritātes zudumu, bet metilēnzilais — uz krāsvielas uzņemšanu un reducējošo aktivitāti, tāpēc stresa skartās šūnas ar abām krāsvielām var tikt klasificētas atšķirīgi.

Elpošanas eksperiments: izmēriet zilās krāsas izzušanas laiku

Otrajā testā mikroskopu vispār neizmanto. Raugu, glikozi un atšķaidītu metilēnzilo ievieto slēgtā mēģenē, un ar hronometru mēra, cik ilgā laikā zilā krāsa izzūd. Šūnu vielmaiņā rodas reducējošie ekvivalenti, kas pārvērš zilo krāsvielu tās bezkrāsainajā formā, savukārt izšķīdušais skābeklis to atkal oksidē. Kad šūnas ir samazinājušas skābekļa daudzumu, reducēšana kļūst dominējoša un mēģenes saturs atkrāsojas. Tāpēc galapunkts atspoguļo elpošanas, krāsvielas koncentrācijas un skābekļa pieejamības līdzsvaru, un rezultāts jānorāda kā metilēnzilā reducēšanas vai atkrāsošanās laiks, nevis kā tiešs molekulārā skābekļa patēriņa ātrums.

Izmantojiet daudz vairāk atšķaidītu krāsvielu nekā dzīvotspējas noteikšanā, lai mērījuma laiks būtu praktiski ērts. AQA A līmeņa obligāto praktisko darbu rokasgrāmata to labi standartizē: 1 g glikozes uz 100 mL ūdens, kas uzsildīts līdz aptuveni 30 C, 5 g sausā rauga, ko pievieno tieši pirms lietošanas, un krāsvielas darba šķīdums ar aptuveni 0.001% koncentrāciju, ko sagatavo, atšķaidot 0.1 mL 1% pamatšķīduma līdz 100 mL. Sajauciet 2 mL rauga un glikozes suspensijas ar 2 mL krāsvielas darba šķīduma, ļaujiet maisījumam sasniegt testa temperatūru, vienu reizi kratiet 10 sekundes, ieslēdziet hronometru un vairs nekratiet. Kratīšana atkārtoti ievada skābekli un atjauno zilo krāsu mēģenē; tas ir lielākais procedūras radītais artefakts. AQA norāda, ka sagatavotajam maisījumam parasti vajadzētu atkrāsoties aptuveni 5 minūšu laikā pie 35 C, un izmēģinājumu vidējie rezultāti ir 275 s pie 20 C, 128 s pie 35 C un 145 s pie 45 C. Tie ir viena eksperimenta piemēri, nevis universālas atskaites vērtības. Kvantitatīvo saistību starp reducēšanas ātrumu un metaboliski aktīvu raugu kontrolētos apstākļos apstiprina īpaši reducēšanas pētījumi, tostarp darbs ar indeksu PMID 25773544 un mehānisma pētījums žurnālā Yeast (2014).

Laika gaitas demonstrējums (oriģināls materiāls)

Tālāk redzamā tabula ir šim rakstam sagatavots oriģināls demonstrējums, izmantojot iepriekš aprakstīto AQA tipa eksperimenta shēmu: 2 mL rauga un glikozes maisījuma kopā ar 2 mL krāsvielas darba šķīduma, kura koncentrācija ir aptuveni 0.001%, viena 10 sekunžu kratīšana un pēc tam netraucēta inkubācija. Ieraksti ir rezultātu piemēri tādā formātā, kādā tos vajadzētu reģistrēt studentu grupai; ātruma indeksu definē kā 1, dalītu ar atkrāsošanās laiku sekundēs. Veiciet eksperimentu ar tādām pašām mēģenēm un aizstājiet šos ierakstus ar izmērītajām vērtībām.

Attēlojiet grafikā ātruma indeksu atkarībā no temperatūras mēģenēm A, B un C. Līkne kāpj un pēc tam izlīdzinās vai krītas, kas ir sagaidāmā enzīmu darbības tendence, nevis taisna līnija. Mēģenes D, E un F nav šīs līknes datu punkti. Tās ir kontroles, kas ļauj līkni interpretēt.

Kontroles, kas piešķir katram testam nozīmi

Katrā elpošanas eksperimentā vajadzīgi trīs papildu paraugi. Vārītam vai nonāvētam raugam kopā ar glikozi un krāsvielu jāpaliek zilam, apliecinot, ka ātra reducēšana ir atkarīga no dzīvu šūnu vielmaiņas. Dzīvs raugs kopā ar krāsvielu bez pievienotas glikozes ir substrāta kontrole, taču arī tajā sagaidāma lēna atkrāsošanās, jo raugs patērē endogēnās rezerves. Glikoze kopā ar krāsvielu bez rauga ir ķīmiskais tukšais paraugs; tas ir būtisks, jo sārmainos apstākļos glikoze var reducēt metilēnzilo arī bez šūnu klātbūtnes.

Dzīvotspējas noteikšanai vajadzīga cita veida kontrole: procedūras nemainīgums. Tas pats krāsvielas pamatšķīdums, tā pati sajaukšanas attiecība, tas pats iekrāsošanas intervāls, tas pats kameras laukums, tie paši pumpuru un robežlīniju noteikumi; ja iespējams, skaitīšanu veic, nezinot parauga identitāti. Ja divu skaitītāju rezultāti atšķiras par desmit procentpunktiem, darba lapa parasti atklāj iemeslu: atšķirīgs novērtēšanas laiks, atšķirīgs zilās krāsas slieksnis vai atšķirīgi pumpuru uzskaites noteikumi. Iekrāsotu šūnu sagatavošanas un apskates paņēmieni ir saistīti ar vienkāršās baktēriju iekrāsošanas metodēm, savukārt plašāks pārskats par to, ko krāsviela iezīmē dažādos paraugos, atrodams mikroskopiskās iekrāsošanas atlantā. Kvantitatīvas zilās krāsas intensitātes nolasīšanas fizikālo pamatojumu sniedz absorbcijas atsauce ar norādītiem apstākļiem: tā izskaidro, kāpēc katram koeficientam jāpievieno šķīdinātāja, pH un koncentrācijas nosacījumi.

Izvēlieties testu atbilstoši jautājumam. Cik šūnu pašlaik ir dzīvas — tas ir skaitīšanas jautājums, uz kuru atbild, izmantojot mikroskopu un darba lapu. Cik aktīvi šī kultūra elpo — tas ir kinētikas jautājums, uz kuru atbild ar hronometru un kontrolētām mēģenēm. Metilēnzilais der abiem, taču nekad vienā un tajā pašā mēģenē vienlaikus.