Metilēnzilā kalibrēšanas līknes izveide: tukšie paraugi, diapazons un linearitāte

Divi analītiķi izmanto vienu metilēnzilā izejšķīduma pudeli, un katrs izveido kalibrēšanas līkni. Pirmais iegūst taisni, kas iet caur koordinātu sākumpunktu, un pārliecinoši mēra nezināmos paraugus. Otrais iegūst līkni, kas augšējā daļā izliecas, krustpunktu ar ordinātu asi, kas nav tuvu nullei, un paraugu rezultātus, kas mainās atkarībā no atšķaidījuma. Tā pati krāsviela, tas pats instruments, tas pats viļņa garums. Atšķirība nav prasmēs. Tā ir analīzes plānošanā: kas iekļauts tukšajā paraugā, kādas koncentrācijas izvēlētas un vai pārbaudītais diapazons palicis robežās, kur joprojām ir spēkā viens vienkāršs modelis.

Kalibrēšanas līkne ir vienošanās starp instrumenta signālu un koncentrāciju, kas ir derīga tikai apstākļos, kuros tā izveidota. Metilēnzilajam šai vienošanās ir zināms vājais punkts. Krāsviela ūdenī pašasociējas, tāpēc absorbējošā forma mainās līdz ar koncentrāciju. Līkne, kas izveidota diapazonā, kur notiek šī maiņa, nebūs taisna, un nekāda statistiska apstrāde to neizlabos. Šajā rakstā parādīts, kā plānot kalibrēšanu, lai taisnei būtu jēga: izvēlēties pareizo tukšo paraugu, saglabāt diapazonu monomēra dominēšanas apgabalā, izmantot patiesi neatkarīgus atkārtojumus un uztvert izliekumu kā informāciju, nevis troksni.

Sāciet ar tukšo paraugu, nevis standartšķīdumiem

Tukšais paraugs nosaka nulli, un metilēnzilā gadījumā tam jāsatur viss, izņemot krāsvielu. Tāda pati ūdens kvalitātes pakāpe, tāds pats buferšķīdums un pH, tie paši sāļi, tāda pati līdzšķīdinātāja daļa, tāda pati temperatūra. Kalibrēšanas šķīdumus pagatavojiet šajā identiskajā matricā. Iemesls ir ķīmisks, nevis birokrātisks. Sāls un šķīdinātājs maina līdzsvaru starp monomēru, dimēru un lielākiem agregātiem, tādējādi mainot spektru mērīšanas viļņa garumā. Tukšais paraugs, kas satur tikai ūdeni, nevar kompensēt matricas izraisītas izmaiņas ķīmisko formu sadalījumā. Metilēnzilā spektru globālajā analīzē ūdenī, kas pieejama arī atvērtās piekļuves publikācijā, nātrija hlorīda koncentrācija tika mainīta no 0 līdz 0.15 M tieši tāpēc, ka jonu spēks nobīda līdzsvaru, un, palielinoties sāls koncentrācijai, pieauga agregācija.

Viena praktiska sekas: nekad neveiciet kalibrēšanu dejonizētā ūdenī, ja pēc tam mērīsiet paraugus fosfātu buferšķīdumā vai notekūdeņu filtrātā. Ja nav pieejama matrica bez analīta, standartpiedevas metode pašā paraugā ir labāka par neatbilstošu ārējo kalibrēšanas līkni. Papildu norādījumi par uzticamu analīzi ūdens šķīdumos sniegti sadaļā par matricu un traucējumiem, bet krāsvielu kvantitatīvās analīzes vispārīgie principi aplūkoti analīzes plānošanas pārskatā.

Izvēlieties diapazonu, kurā dominē viena forma

Kvantitatīva noteikšana garo viļņu absorbcijas joslā ap 664 nm balstās uz pieņēmumu, ka lielākā daļa krāsvielas ir monomēra formā. Ūdenī bez piedevām šis pieņēmums ir spēkā tikai atšķaidītiem šķīdumiem, aptuveni zemu mikromolāru koncentrāciju apgabalā. Publicētie empīriskie slīpuma koeficienti ilustrē robežu: kalibrēšana koncentrācijās zem aptuveni 7 mikromolāriem 1 cm kivetēs dod slīpuma koeficientu ap 82,000 M-1 cm-1, bet, paplašinot kalibrēšanas diapazonu līdz aptuveni 37 mikromolāriem, tas samazinās līdz aptuveni 67,100, jo augstākās koncentrācijas standartšķīdumi jau satur ievērojamu dimēra daudzumu. Katram šeit minētajam koeficientam tā noteikšanas apstākļi norādīti metilēnzilā spektrālajā uzziņā, kas ir piemērotākā vieta skaitļu salīdzināšanai; šajā rakstā tie izmantoti tikai diapazona izvēlei.

No tā tieši izriet plānošanas noteikumi:

1. Saglabājiet augstākās koncentrācijas standartšķīdumu pietiekami atšķaidītu, lai spektra forma būtu stabila. Metodes izstrādes laikā katram koncentrācijas līmenim skenējiet visu redzamo diapazonu (aptuveni no 550 līdz 750 nm), nevis veiciet nolasījumu vienā viļņa garumā. Ja normalizēto spektru forma mainās līdz ar koncentrāciju, mainās ķīmiskie līdzsvari un diapazons ir pārāk plašs.
2. Sekojiet absorbcijas pie aptuveni 610 nm attiecībai pret absorbciju pie aptuveni 665 nm visos līmeņos. Attiecības pieaugums līdz ar koncentrāciju nozīmē, ka dimēra plecs pastiprinās un monomēra modelis vairs nav derīgs. Šis diagnostikas paņēmiens sīkāk izskaidrots agregācijas un koncentrācijas ietekmes ceļvedī.
3. Darbam ar zemām mikromolārām koncentrācijām izmantojiet 1 cm kiveti. Ja slīpuma koeficients ir ap 82,000, pie 5 mikromolāriem absorbcija ir ap 0.41, bet pie 10 mikromolāriem — aptuveni 0.82; abi lielumi ir piemēroti lielākajai daļai instrumentu.
4. Koncentrētiem izejšķīdumiem saīsiniet optisko ceļu, nevis pieļaujiet absorbciju ievērojami virs 1, taču atcerieties: īss optiskais ceļš atrisina fotometrijas problēmu, nevis ķīmijas problēmu. Agregācija ir atkarīga no koncentrācijas, nevis optiskā ceļa garuma, tāpēc koncentrētam izejšķīdumam joprojām nepieciešama atsevišķa pieeja, kas ņem vērā ķīmisko formu sadalījumu, nevis atšķaidīta monomēra kalibrēšanas līkne.

Globālā modeļa pielāgošana, uz kuru balstās liela daļa šo secinājumu, aptvēra 224 spektrus koncentrācijās no 1.1 mikromolāriem līdz 3.4 milimolāriem, un tetramēra signāls bija nosakāms jau zem 34 mikromolāriem. Šis atklājums liek būt piesardzīgiem: lineārais diapazons ir šaurāks, nekā varētu šķist, tāpēc pārbaudiet to, nevis paļaujieties uz pieņēmumu.

Līmeņi, atkārtojumi un secība

Līkne ar trim punktiem neko nepierāda. ICH Q2(R2) validācijas vadlīnijas linearitātes novērtēšanai paredz vismaz piecas koncentrācijas, bet seši līdz astoņi nenulles līmeņi dod pārliecinošāku darba kalibrēšanas līkni, īpaši augšējā daļā, kur sākas agregācija. Izvietojiet līmeņus tā, lai tie aptvertu paredzēto paraugu diapazonu, un izvēlieties tos blīvāk tur, kur izliekums ir visvairāk iespējams, nevis ērtības labad izmantojiet ģeometrisku progresiju.

Mēriet katru līmeni divos vai trijos atkārtojumos, katru šķīdumu pagatavojot neatkarīgi, nevis trīs reizes nolasot vienas kolbas saturu. Neatkarīgi atkārtojumi atklāj pagatavošanas kļūdu; atkārtoti vienas kolbas nolasījumi atklāj tikai instrumenta troksni. 2020. gada globālajā pētījumā katrs šķīdums tika mērīts trīs reizes, un tā joprojām ir pamatota noklusējuma izvēle. Nejaušiniet nolasījumu secību, lai dreifu, adsorbciju uz stikla vai temperatūras izmaiņas nevarētu sajaukt ar līknes izliekumu. Pētījumā ar kvarca kivetēm konstatēts, ka no 34 mikromolāra šķīduma 10 minūšu laikā adsorbējas aptuveni 3 procenti krāsvielas, tāpēc visā mērījumu sērijā saglabājiet vienādus saskares laikus, kiveti, tīrīšanas procedūru un darbību secību.

Ilustratīvs aprēķina piemērs (nav mērījumu dati)

Tālāk sniegtie skaitļi ir izdomāti, lai parādītu aprēķinus. Tie nav laboratorijas mērījumi, un tos nedrīkst citēt kā metilēnzilā datus. Svarīga ir ar tiem saistīto pārbaužu secība.

Pieņemsim, ka seši standartšķīdumi pagatavoti atbilstošā buferšķīdumā un mērīti pie 665 nm ar 1 cm optisko ceļu pret matricai atbilstošu tukšo paraugu:

Vidējās absorbcijas lineārā regresija pret koncentrāciju dod slīpuma koeficientu ap 0.0805 absorbcijas vienībām uz mikromolāru koncentrāciju un krustpunktu ar ordinātu asi dažu miliabsorbcijas vienību attālumā no nulles. Dalot slīpuma koeficientu ar optiskā ceļa garumu, iegūst šķietamo absorbcijas koeficientu: 0.0805 uz mikromolāru koncentrāciju atbilst aptuveni 80,500 M-1 cm-1, kas saskan ar monomēra dominētu intervālu ūdenī. Būtiskākais pārbaudēs nav R kvadrātā, kas abos gadījumos izskatīsies lieliski. Svarīgs ir krustpunkts tuvu nullei, nemainīga A610/A665 attiecība no S2 līdz S5 un atlikumi, kas izkliedēti bez tendences. Attiecības pieaugums pie S6 ir skaidrs signāls vai nu izslēgt šo līmeni, vai atzīmēt 7 mikromolārus kā šīs matricas un instrumenta kombinācijas provizorisko augšējo robežu.

Nezināmam paraugam, kura nolasījums identiskos apstākļos ir 0.245, koncentrāciju aprēķina tieši: dalot 0.245 ar 0.0805 uz mikromolāru koncentrāciju, iegūst aptuveni 3.0 mikromolārus, pirms piemērots parauga atšķaidījuma koeficients. Rezultātu norādiet kopā ar tā iegūšanas apstākļiem: viļņa garumu, optisko ceļu, tukšā parauga matricu, kalibrēšanas intervālu un datumu.

Aizpildāma kalibrēšanas darba lapa

Katras jaunas matricas gadījumā iekopējiet šo veidni laboratorijas pierakstos. Viena matrica, viena lapa, viena līkne.

Rinda par reaģenta formu ir pamatoti iekļauta. Tirdzniecībā pieejamais metilēnzilais var būt bezūdens sāls vai hidrāts, piemēram, trihidrāts, un nepareiza molmasa nemanāmi rada sistemātisku kļūdu visās nominālajās koncentrācijās. Izejmateriāla tīrības un specifikāciju pārbaudes aplūkotas kvalitātes un kvalitātes pakāpju ceļvedī.

Pārbaudiet ar neatkarīgu kontrolstandartšķīdumu

Kalibrēšanas līknei nekad nevajadzētu pārbaudīt pašai sevi. Pēc regresijas aprēķināšanas pagatavojiet vienu kontrolstandartšķīdumu no izejšķīduma, kam reaģents iesvērts atsevišķi, izvēloties koncentrāciju tuvu pieņemtā intervāla vidum, un mēriet to kā nezināmu paraugu. Sakritība dažu procentu robežās apstiprina pagatavošanas ķēdes pareizību; neatbilstība norāda uz izejšķīdumu vai atšķaidījumiem, nevis instrumentu. Atkārtojiet kontrolstandartšķīduma mērījumu katrai paraugu partijai. Ja tā rezultāts mainās, bet līkne paliek nemainīga, vispirms pārbaudiet darba šķīdumus vai kiveti, nevis paraugus. Šis viens ieradums atklāj lielāko daļu nemanāmo kļūdu: hidrāta molmasas izmantošanu bezūdens reaģentam, nekalibrētu mikropipeti, buferšķīdumu ar nepareizu jonu spēku. Pierakstiet kontrolstandartšķīduma atgūstamību darba lapā blakus slīpuma koeficientam, lai vēlāk būtu redzams, ka taisne ir pārbaudīta, nevis tikai novilkta.

Nelinearitātes interpretācija diagnostikai

Kad līkne izliecas, novirzes forma palīdz noteikt cēloni. Lejupvērsts izliekums pie augstas absorbcijas, ja spektra forma nemainās, norāda uz instrumentu; bieži parazītiskā gaisma rada pazeminātus nolasījumus pie augstas absorbcijas. Izliekums kopā ar pieaugošu plecu pie 610 nm norāda uz ķīmiju: dimērs un lielāki agregāti absorbē citādi nekā monomērs. Tukšais paraugs, ko neizdodas nonullēt, vai standartšķīdumi, kuru nolasījumi laika gaitā samazinās, norāda uz trauku: adsorbciju uz stikla vai kivetēm, īpaši tad, ja mērījumu sērijā saskares laiki atšķīrušies. Savukārt laba taisne caur punktiem, kas tomēr dod nepareizus paraugu rezultātus, norāda uz matricu: paraugi atšķiras no kalibrēšanas šķīdumiem, tāpēc izveidojiet līkni no jauna parauga matricā vai pārejiet uz standartpiedevas metodi. Katrā gadījumā attēlojiet atlikumus pret koncentrāciju. Nejauša izkliede atbalsta taisnes modeli; smaida vai apgriezta smaida forma to atspēko uzticamāk nekā jebkurš R kvadrātā slieksnis — to skaidri uzsver arī validācijas vadlīnijas.

Metilēnzilā analīzē šāda disciplīna atmaksājas. Tā monomēra absorbcijas josla ir intensīva, ķīmiskās īpašības ir labi izpētītas, un novirzes parādās spektrā, pirms tās sagroza skaitļus. Veidojiet līkni šaurā diapazonā, izmantojiet patiesi atbilstošu tukšo paraugu un neatkarīgus atkārtojumus, un ļaujiet spektru formai noteikt diapazonu. Iegūtā taisne ir īsa, taču katrs tās punkts ir patiess.

Šajā rakstā ilustratīvajos aprēķinos izmantoti izdomāti skaitļi, lai parādītu metodi. Izmērītie atsauces koeficienti ar pilnu informāciju par apstākļiem ir norādīti saistītajā spektrālajā uzziņā, un agregācijas pētījums, uz kuru tā balstās, ir indeksēts ar PMID 33251415.