Kas izstrādāja violeto asins krāsojumu? Metilēnzilais, Malahovskis, Romanovskis un Gīmza

Eozīns ir sarkans. Metilēnzilais ir zils. Sajauciet abus, uzklājiet maisījumu izžāvētai asins uztriepei, un dažas uztriepes daļas iekrāsosies violetas.

Ne visas. Labi sagatavotā preparātā balto asins šūnu kodoli kļūst sarkanvioleti, un malārijas parazīta iekšienē hromatīns iekrāsojas tādā pašā krāsā, bet apkārtējās sarkanās asins šūnas paliek rozā un citoplazma — pelēkzila. Tieši violetā krāsa ļauj atšķirt šūnu veidus.

Nevienā pudelē nav violetas krāsvielas. Šī krāsa parādās tikai tad, kad uz priekšmetstikliņa noteikts metilēnzilā sadalīšanās produkts sastopas ar eozīnu, un 1880. un 1890. gados neviens nezināja, ka šāds produkts pastāv, kur nu vēl — kas tas ir. Cilvēki, kuri centās iegūt šo krāsu, strādāja vienatnē ar netīrām krāsvielām, bez uzticama veida, kā noskaidrot, kas atrodas pudelē pēc diviem plauktā pavadītiem mēnešiem.

Tāpēc uz virsrakstā uzdoto jautājumu ir vairāk nekā viena pamatota atbilde, un tāpēc atbilde 2011. gadā mainījās.

Novērojamais rezultāts mainījās līdz ar maisījumu

Šo krāsojumu neizgudroja vienā reizē. Tas veidojās pakāpeniski. Katra maisījuma izmaiņa deva tieši vienu jaunu saskatāmu informācijas elementu, un šo elementu secība ir skaidrākais veids, kā izprast vēsturi.

Svarīga ir pēdējā ailē redzamā likumsakarība. Katrs uzlabojums paplašināja krāsu diapazonu, un katrs paplašinājums padarīja redzamu vēl vienu struktūru. Violetā krāsa nav metodes dekoratīvs papildinājums; tā ir atšķirība starp iespēju saskatīt parazīta klātbūtni un iespēju saskatīt, no kā tas sastāv. Tas, kā pati krāsviela no BASF krāsvielu rūpnīcas nonāca medicīnā, ir plašāks vēstures stāsts ar saviem dokumentiem. Visa iepriekš redzamā secība ar katra ieraksta avotu ir apkopota izstrādē iesaistīto pētnieku hronoloģijā ar saitēm uz avotiem.

Attēls: tie paši seši maisījumi, attēlojot to, kas atradās traukā un kas no tā iznāca. Apļos redzamas krāsvielas; blokos zem tiem — krāsas, ko šīs krāsvielas varēja radīt asins uztriepē. Pirms 1890. gada sarkanvioleta bloka nav nevienā maisījumā, un pēc tam tas ir visos.

Cilvēks, kurš boraku izmantoja apzināti

Ernsts Malahovskis bija ārsts Breslavā, tagadējā Vroclavā. Viņš visu profesionālo mūžu strādāja privātpraksē un nelielā klīnikā, ko vadīja kopā ar kolēģi, bet laboratorijas darbu veica savā brīvajā laikā. Viņš dzimis Stšelno 1857. gada 12. martā, studējis medicīnu Breslavas Universitātē un no 1882. līdz 1887. gadam strādājis par asistentu internajā medicīnā Visu Svēto slimnīcā, kas tolaik bija otra lielākā slimnīca Vācijā.

Viņš sāka 1888. gadā ar Henčinska un Plēna dubultkrāsojumu. Kādā 1889. gadā sagatavotā preparātā viņš pamanīja, ka plazmodija kodola hromatīns iekrāsojas citādi nekā citoplazma, bet pēc tam atklāja, ka nespēj šo rezultātu atkārtot. Viņš mēģināja paskābināt metilēnzilo, un tas rezultātu pasliktināja. Viņš mēģināja padarīt to sārmainu ar boraku, un tas darbojās katru reizi. Viņš publiski demonstrēja metodi 1890. gada 15. jūnijā un 1891. gada augustā publicēja pilnīgāku aprakstu, tostarp norādījumu par boraka lietošanu. Viņš atzīmēja, ka krāsošana ilga divdesmit četras stundas un rezultāti bija viegli reproducējami.

Divdesmit četras stundas diagnostikas laboratorijā ir ilgs laiks, un viņa publikācijā parazīta kodola violetsarkanajai krāsai nebija pievērsta īpaša uzmanība. Lai kāds būtu iemesls, neviens nepievērsās apzinātai metilēnzilā padarīšanai sārmainam, līdz Nohts to atkal izdarīja 1898. gadā. Malahovskis par asins krāsošanu vairs nekad nerakstīja.

Iemesls, kāpēc vēl nesen par viņu bija zināms tik maz, ir saistīts ar arhīviem, nevis noslēpumu. Medicīnas literatūrā no viņa dzīves palika gandrīz nekādas pēdas, un tas, kas saglabājās, nonāca līdz mums pa vienu ceļu. Viņa meita Marija 1939. gadā devās no Vācijas uz Londonu, dienēja britu armijā un apmetās Kanādā, bet viņas ģimenes dokumentu krājums nonāca Leo Beka institūtā Ņujorkā. Viņas brālis Leo gāja bojā Pirmajā pasaules karā. Viņas māsu Evu 1942. gada aprīlī deportēja no Breslavas uz Izbicas tranzītnometni, un viņa neatgriezās. Viņas māte Hedviga 1942. gada 22. aprīlī izdarīja pašnāvību, nevis gaidīja tādu pašu deportāciju. Malahovskis bija miris 1934. gadā, pirms tas viss notika.

Ģimenes vēsture, kas beidzas šādi, ir ģimenes vēsture, uz kuru pārstāj atsaukties. Abas publikācijas, kas atjaunoja Malahovska vietu šā krāsojuma izstrādes vēsturē un iznāca 2011. gadā, tapa, izmantojot arhīvu dokumentus Poznaņā un Vroclavā un Marijas dokumentus Ņujorkā.

Sapelējusi pudele un veiksmīgs krievu pētnieks

Dmitrijs Romanovskis studēja medicīnu Sanktpēterburgas Kara medicīnas akadēmijā un lielāko daļu sava profesionālā mūža pētīja malāriju. 1890. gadā viņš publicēja metodi, kas aprakstā bija gandrīz identiska Henčinska metodei: nepārveidots metilēnzilais un eozīns, tikai nedaudz vairāk eozīna.

1891. gada septembrī viņš publicēja metodi, kas padarīja viņa vārdu pazīstamu, un būtiskā detaļa bija paslēpta norādījumos. Labākos rezultātus viņš ieguva ar krājumā esošo metilēnzilā šķīdumu — metilēnzilā pamatšķīdumu, kas bija stāvējis ilgāk nekā divus mēnešus un uz kura bija izaudzis pelējums. Pelējums un stāvēšanas laiks bija izraisījuši daļēju krāsvielas demetilēšanos. Romanovskis to nezināja un nevarēja kontrolēt, un citi pētnieki, kuri izmēģināja viņa metodi, violeto krāsu iegūt nespēja. Viņa disertācija Sanktpēterburgā bija iesniegta 1891. gada jūnijā, tāpēc ierastajā vēstures izklāstā par atklājuma gadu uzskata 1891. gadu.

Malahovska demonstrācija bija notikusi 1890. gada jūnijā, vairāk nekā gadu agrāk, un viņa metode deva rezultātu apzināti.

Kāpēc nosaukumā nonāca nepareizā cilvēka vārds

Argumentus par labu Malahovskim apkopoja Kristīne Kraftsa, Ernsts Hempelmans un Barbara Oleksina, balstoties uz četriem apsvērumiem. Publiskās demonstrācijas datums: 1890. gada jūnijs pret 1891. gada septembri. Vārds apzināti pret vārdu nejauši. Fakts, ka Malahovskis publicēja savu metodi ar visu boraka lietošanu, bet Romanovska metode bija atkarīga no nekontrolēta mainīgā. Un novērojums, ka plazmodija kodola apraksts kopā ar violeto krāsu, kas to ļāva saskatīt, faktiski uz septiņiem gadiem pazuda no literatūras, jo neviens nespēja reproducēt nejaušo variantu.

Savu secinājumu viņi formulē tieši. Biogrāfiskajā publikācijā viņi šo nopelnu piedēvēšanu sauc par „izsmieklu” un citē Ralfu Liliju, kurš 1978. gadā rakstīja, ka „varbūt mums šo krāsojumu saimi vajadzētu dēvēt par Malahovska krāsojumiem”.

Šis apgalvojums tiek apstrīdēts, kā tas parasti notiek ar pretenzijām uz atklājuma pirmtiesībām, un strīda būtību ir vērts izskaidrot, nevis izlemt. Diskusijā par pirmtiesībām jāpasaka, kas tieši bija atklājums. Ja atklājums ir violetā krāsa, Malahovskim ir agrākā dokumentētā demonstrācija. Ja atklājums ir publicētā metode, abi to publicēja 1891. gadā, un nosaukumā nonāca Romanovska vārds. Ja atklājums ir izskaidrojums, uz to nevar pretendēt neviens no abiem, jo neviens nezināja, ka nogatavināšanās ir demetilēšanās, un neviens nevarēja pateikt, kāpēc krāsa vispār parādās. Tieši šo pēdējo aspektu populārie izklāsti izlaiž. Aktīvā sastāvdaļa bija piemaisījums, ko neviens nebija identificējis, un pirmais cilvēks, kurš apzināti ieguva šo krāsu, to izdarīja ar reproducējamu empīrisku recepti, nevis izprotot, ko šī recepte dara.

Abas 2011. gada publikācijas ir pilnīgākais publicētais argumentu izklāsts par labu Malahovskim, un abas ir brīvi lasāmas PubMed: plašais pārskats — PMID 21235291, biogrāfiskā publikācija — PMID 21660627. Pārskata PubMed ierakstā ir norādīts arī komentārs par to, kas tajā pašā žurnālā publicēts vēlāk tajā pašā gadā, 86(5):366. Tas pamatoti atgādina, ka argumenti tika apstrīdēti publicētajā literatūrā uzreiz pēc to parādīšanās.

Šis strīds nav domstarpības par ķīmiju. Visi iesaistītie ir vienisprātis par to, kas ir violetā krāsa un kuras sastāvdaļas to rada. Domstarpības ir par to, kurš pie tās nonāca pirmais, un vai nejaušību, ko neviens nevarēja atkārtot, vispār var uzskatīt par nonākšanu pie rezultāta.

Ko deva vēlākie pētnieki

Ja Malahovskis violeto krāsu ieguva pirmais, kāpēc krāsojums nes Romanovska, Raita un Gīmzas vārdus?

Tāpēc, ka krāsošanas maisījums, kas vienreiz nostrādā izgudrotāja rokās, vēl nav reaģents. Vēlākais darbs pārvērta kaprīzu maisījumu par kaut ko tādu, ko laborants citā valstī varētu izmantot parastā otrdienā.

Nohts pie rezultāta nonāca spriešanas ceļā. Nespējot iegūt uzticamu rezultātu ar vienkāršu neitrālu krāsvielu, viņš secināja, ka violetajai krāsai jārodas no kaut kā tāda metilēnzilajā, kas nav metilēnzilais, un sāka to meklēt. Unna jau bija pamanījis, ka novecojuši metilēnzilā šķīdumi iekrāso tuklo šūnu granulas sarkanas, un izvirzīja pieņēmumu, ka krāsvielas nogatavināšanās laikā veidojas jauna viela. Berntsens 1885. gadā bija parādījis, ka sārmaini apstākļi atšķeļ no metilēnzilā metilgrupas un ka šie produkti ir tas, ko tagad saucam par azūriem. Nohts ekstrahēja aktīvo frakciju ar hloroformu un varēja to nosaukt tikai par sarkano no metilēnzilā; Mihaēliss 1901. gadā to nosauca par azūru I. Dženners atrisināja praktiskās sagatavošanas problēmu. Metilēnzilā un eozīna nogulšņu atkārtota izšķīdināšana absolūtā metanolā deva vienu stabilu šķīdumu, kas krāsošanas laikā fiksēja uztriepi un ļāva atteikties no termiskās fiksācijas. Leišmans un Reuters apvienoja polihromētu krāsvielu ar spirta šķīdinātāju un ieguva gan stabilitāti, gan violeto krāsu. Raits aizstāja divpadsmit stundu inkubāciju 65 °C temperatūrā un desmit dienu nostāvēšanos ar vienu stundu plūstošā tvaikā. Gīmza vispār pārstāja paļauties uz nejauši nogatavinātu šķīdumu: viņš izmantoja precīzi nomērītus zināmu krāsvielu daudzumus un metanolam pievienoja glicerīnu, lai produkts izturētu tropu karstumu. Viņš nekad nepublicēja, kā iegūst tīru metilēnazūru. Viņš to pārdeva doktora Grīblera laboratorijai Leipcigā, kas to tirgoja kā azūru I un apgalvoja, ka tikai tās variants ir īstais Gīmzas krāsojums.

Par šā azūra identitāti joprojām strīdas. Vieni uzskata, ka tas bija vienkārši polihromēts metilēnzilais, citi — ka tajā bija daudz Azure B. Atbildi deva karš. Kad vācu krāsvielas kļuva nepieejamas, Amerikas Savienoto Valstu Sabiedrības veselības dienesta komanda — Ralfs Lilijs kopā ar Morisu Ro un Eimiju Vilkoksu — atklāja, ka vislabāko krāsojumu dod trīs atdalītas sastāvdaļas: nepārveidots metilēnzilais, tā demetilētais sadalīšanās produkts Azure B un eozīns. Azure B aizstāja nepieejamo azūru I, un šīs trīs sastāvdaļas joprojām ir pamatā krāsojumam, ko mūsdienās izmanto malārijas diagnosticēšanai.

Tas, kā šīs trīs sastāvdaļas ķīmiski mijiedarbojas uz priekšmetstikliņa, ir atsevišķs jautājums un citas lapas tēma. Rakstā par krāsvielu lomu un Romanovska tipa krāsojumu ķīmiju aplūkots, ko dara Azure B un eozīns un kāpēc abi kopā rada krāsu, ko neviens no tiem nerada atsevišķi. Savukārt lapā par mikroskopiju un laboratorijas lietojumiem aplūkota praktiskā puse: ko parāda konkrēts preparāts un kā novērtēt, vai konkrēts produkts ir piemērots iecerētajai metodei.

Vēstures daļa, kas joprojām ir aktuāla

Viena šā stāsta detaļa nezaudēja patiesumu 1902. gadā. Aptuveni piecdesmit gadus pasaulē ierastā malārijas krāsojuma svarīgākā sastāvdaļa bija nenosaukts piemaisījums. Tas bija klāt nejauši, tā daudzums dažādās pudelēs atšķīrās, daļu šā laika tā identitāte bija komercnoslēpums, un par tā proporciju strīdējās līdz pat 1940. gadiem. Krāsojuma lietotāji nebija pavirši. Viņiem nebija iespējas zināt, kas atrodas pudelē.

Šīs pašas problēmas mūsdienu variants ir specifikācija, kas apraksta tikai daļu no materiāla. Atbilstība USP ir ceļš uz augstāko tirgū pieejamo tīrību, jo tas ir pilnīgs publicēts standarts, nevis viens atsevišķs mērījums: identitāte, tīrība, organiskie piemaisījumi, tostarp azūru krāsvielas, šķīdinātāju atliekas, elementu piemaisījumi, atlikums pēc karsēšanas, mikrobioloģiskās robežvērtības un baktēriju endotoksīni. Blupreme iegādājas metilēnzilo no farmaceitiskā ražotāja un publicē pilnu analīžu sertifikātu, lai katru šā saraksta punktu varētu pārbaudīt, nevis tikai pieņemt apgalvojumu. Sertifikāts, kurā norādīts smago metālu analīzes rezultāts un tas nosaukts par atbilstību USP, ir mūsdienu ekvivalents pudelei ar uzrakstu „nogatavināts metilēnzilais”: iespējams, labs reaģents, taču etiķete nepasaka, kas tajā atrodas.