E. coli un citu koloniju izskata interpretācija uz EMB agara

Students uz eozīna un metilēnzilā agara ar svītrojuma metodi uzsēj nezināmu paraugu, inkubē to pa nakti un nākamajā dienā ierauga plati ar tumšām kolonijām un zaļu spīdumu. Pieraksts laboratorijas žurnālā vēsta: «E. coli, apstiprināts.» Šis ieraksts apgalvo vairāk, nekā plate ļauj secināt. Plate parāda augšanas un fermentācijas fenotipu noteiktos apstākļos. Sugas identitāte ir atsevišķs apgalvojums, kam vajadzīgi atsevišķi pierādījumi.

Šajā ceļvedī EMB agara rezultāti aplūkoti kā interpretācijas uzdevums. Tajā skaidrots pamatprincips, izklāstīts ilustratīvs plašu atlants ar kontrolēm un norādīti gadījumi, kuros mācību grāmatās attēlotais izskats var maldināt.

Plates darbības pamatprincips

EMB agars ir gan selektīva, gan diferenciāla barotne. Krāsvielas eozīns Y un metilēnzilais nomāc daudzus grampozitīvus mikroorganismus, tāpēc barotne veicina gramnegatīvu mikroorganismu augšanu. Tās pašas krāsvielas darbojas arī kā indikatori: ja mikroorganisms fermentē pieejamo cukuru un lokāli rada pietiekami daudz skābes, kolonija intensīvi uzņem krāsvielu un kļūst tumši violeta līdz zilganmelna. Intensīvas skābes veidošanās gadījumā uz kolonijas virsmas var parādīties metāliski zaļa irizācija. ASM protokolā par eozīna un metilēnzilā agara platēm aprakstīta šī selekcijas un diferenciācijas kombinācija un sniegtas atsauces fotogrāfijas mācībām.

Pirms jebkura rezultāta interpretēšanas būtiska ir viena detaļa: pārbaudiet, kāds barotnes sastāva variants tiek izmantots. Vecākais Holt Harris Teague sastāvs satur laktozi un saharozi, savukārt Levine EMB satur tikai laktozi. Mikroorganisms, kas fermentē saharozi, bet ne laktozi, piemēram, daudzi Serratia marcescens izolāti, abos variantos var izskatīties atšķirīgi. Ražotāja dokumentācijā par EMB barotnēm šī sastāva atšķirība ir skaidri norādīta. Līdzās rezultātam laboratorijas žurnālā pierakstiet ražotāju un barotnes sastāva variantu.

Sagatavots, neuzsēts EMB agars parasti ir sarkanbrūns līdz sarkanīgi violets, dažkārt ar zaļganu nokrāsu vai smalkām nogulsnēm. Šī fona krāsa nav augšana. Katru rezultātu salīdziniet ar neuzsētu plati vai dokumentēto sākotnējo izskatu un novērtējiet primāro plati pēc aptuveni 18 līdz 24 stundu aerobas inkubācijas 35 līdz 37 C temperatūrā, ja vien mācību protokolā nav noteikts citādi. Ilgāka inkubācija var mainīt fermentācijas izpausmju izskatu.

Kā apskatīt plati

Izmantojiet divu veidu apgaismojumu. Vispirms apskatiet plati atstarotā vai slīpi krītošā gaismā un sasveriet to: metāliskais spīdums ir irizējošs un atkarībā no skata leņķa var parādīties vai izzust. Pēc tam apskatiet to caurejošā gaismā, lai novērtētu koloniju krāsu un tumšos centrus. Vērtējiet labi izolētas kolonijas, jo blīvs augums un blakus esošās kolonijas maina lokālo skābes uzkrāšanos un var vājināt vai pastiprināt krāsojumu. ASM attēlu kopā tas parādīts tieši: jauktā kultūrā E. coli var zaudēt sagaidāmo spīdumu, jo apkārtējie mikroorganismi maina vides skābumu.

Iekļaujiet kontroles vienmēr, kad uzdevums to ļauj. Bieži izmantots mācību komplekts ietver E. coli ATCC 25922 zilganmelnās krāsas un metāliskā spīduma fenotipam, nefermentētāju, piemēram, Salmonella Typhimurium ATCC 14028 vai Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, bezkrāsainajam fenotipam un grampozitīvu mikroorganismu, piemēram, Enterococcus faecalis vai Staphylococcus aureus, kā inhibīcijas kontroli, kā norādīts EMB barotņu standarta kvalitātes kontroles tabulās. Ja pozitīvajai kontrolei nav spīduma, vispirms apsveriet inkubācijas apstākļus, blīvu augumu vai barotnes sastāvu, nevis nezināmā parauga īpatnības.

Ilustratīvs plašu atlants

Tālāk redzamās plates ir ģenerētas ilustrācijas, nevis reālu kultūru fotogrāfijas. Tās parāda meklējamo raksturīgo izskatu, nevis kāda konkrēta celma precīzo nokrāsu. Salīdziniet tās ar ASM atsauces fotogrāfijām un reālām platēm mācību laboratorijā.

Plate 1: Escherichia coli uz EMB agara — intensīvs laktozes fermentētājs

E. coli uz EMB agara parasti ir tumši violeta līdz zilganmelna, bieži ar tumšu centru un metāliski zaļu spīdumu, ko rada intensīva skābes veidošanās. Spīdums ir labi zināmā pazīme, ko studenti meklē, taču uzskatiet to par papildu pierādījumu, nevis definējošu pazīmi. Spīduma intensitāte atšķiras atkarībā no celma, inkubācijas laika, koloniju blīvuma un skata leņķa. Spīduma trūkums neizslēdz E. coli, un tumša kolonija bez spīduma var norādīt uz vairākiem citiem fermentētājiem. Turpmākam darbam izvēlieties labi izolētu koloniju, nevis vērtējiet blīvi aizaugušu sektoru.

Plate 2: Klebsiella pneumoniae uz EMB agara — gļotains fermentētājs

Klebsiella pneumoniae uz EMB agara parasti veido lielas, spīdīgas, gļotainas kolonijas sārti violetos līdz brūngani violetos toņos, bieži ar tumšiem centriem, bet parasti bez izteikta metāliska spīduma. Līdzīga morfoloģija ir arī radniecīgiem fermentētājiem, piemēram, Enterobacter. Gļotainā konsistence un kolonijas izmērs ir daļa no novērtējuma: mazai, plakanai rozā kolonijai ir cita interpretatīvā nozīme nekā lielai, izliektai, gļotainai kolonijai. Tāpat kā E. coli gadījumā, plate norāda uz fermentācijas fenotipu, bet sugas noteikšanai vajadzīgs tālāk aprakstītais bioķīmiskais apstiprinājums.

Plate 3: Salmonella uz EMB agara un citi nefermentētāji — bezkrāsainas kolonijas

Salmonella uz EMB agara un radniecīgi laktozi nefermentējoši mikroorganismi, tostarp Shigella un daudzi Pseudomonas izolāti, parasti aug kā bezkrāsainas līdz caurspīdīgas vai gaiši dzintarkrāsas kolonijas. Daži barotnes sastāvi un apstākļi rada vāji sārtu nokrāsu, tāpēc gaiši rozā kolonija automātiski nenozīmē fermentētāju. EMB neļauj atšķirt Salmonella no Shigella vai citiem nefermentētājiem; šī atšķirība jānosaka turpmākajos testos. Ņemiet vērā arī to, ka ir dokumentēti laktozes pozitīvi Salmonella celmi ar E. coli līdzīgām metāliski spīdīgām kolonijām — vēl viens iemesls, kāpēc viena plate nevar sniegt galīgu atbildi.

Plate 4: Serratia marcescens un barotnes sastāva radītais slazds

Serratia marcescens ir veltīta atsevišķa sadaļa, jo studenti bieži sagaida sarkanas kolonijas un pēc tam kļūdaini interpretē plati. Lielākā daļa klīnisko izolātu nefermentē laktozi, tāpēc uz Levine EMB tie parasti izskatās bāli līdz vāji iekrāsoti. Tā kā daudzi izolāti fermentē saharozi, saharozi saturošs sastāvs var radīt tumšāku vai izteiktāk ar skābes veidošanos saistītu reakciju. Negaidiet arī klasisko sarkano prodigiozīna pigmentu 35 līdz 37 C temperatūrā; inkubatora temperatūrā pigmenta veidošanās nav uzticama pazīme. Ja protokolā minēts Serratia marcescens uz EMB agara, pārbaudiet, uz kādu barotnes sastāvu šis apgalvojums attiecas. Pārskatā par Serratia metabolismu apkopots šī slazda pamatā esošais laktozes negatīvais un mainīgais saharozes fermentācijas raksturs.

Plate 5: kontroles un inhibētie mikroorganismi

Grampozitīvi mikroorganismi, piemēram, Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus un Bacillus, uz EMB agara parasti tiek inhibēti vai to augšana tiek ievērojami nomākta, tomēr ne visiem celmiem inhibīcija ir pilnīga. Kontroļu komplekts ļauj pamatoti interpretēt rezultātu: E. coli kontrolei jāuzrāda laba augšana ar zilganmelnu krāsu un spīdumu, nefermentētāja kontrolei — bezkrāsaina augšana, bet inhibīcijas kontrolei — neliela augšana vai tās trūkums. Ja inhibīcijas kontrole aug labi, selektivitāte nav darbojusies un visi pārējie šīs partijas rezultāti ir apšaubāmi. Krāsošanas metodes atbild uz citu jautājumu nekā kultivēšanas barotnes; par preparātu krāsošanu laboratorijā skatiet metilēnzilā krāsošanas atlantu.

Salīdzinājums ar interpretācijas robežām

Maldinošo izskatu var apkopot trīs teikumos. Tumšs nenozīmē E. coli, jo Klebsiella, Enterobacter un citiem fermentētājiem veidojas tumši centri bez spīduma. Rozā nenozīmē Klebsiella, jo mēreni vai lēni fermentētāji un daži mikroorganismi, kurus parasti uzskata par nefermentētājiem, izskatās rozā vai gaiši violeti. Spīdums nenozīmē droši noteiktu E. coli, jo to var radīt arī citi intensīvi fermentētāji. Mācību protokols un tajā iekļautie jauktu kultūru attēli ilustrē katru no šiem kļūdainajiem secinājumiem.

Apstiprināšanas ierobežojumi

EMB agars parāda fenotipu, nevis sugu. Dažādiem mikroorganismiem var būt vienāds koloniju izskats, un viena mikroorganisma izskats var atšķirties no mācību grāmatā aprakstītā atkarībā no celma, vecuma, auguma blīvuma, barotnes sastāva un inkubācijas. Tāpēc mācību un klīniskajā darbā EMB morfoloģiju uzskata par pamatu provizoriskai identifikācijai.

Pamatota studenta darba secība ir šāda: aprakstiet izolēto koloniju (izmēru, krāsu, centru, spīdumu slīpā apgaismojumā, gļotainumu), pierakstiet barotnes sastāvu, inkubācijas laiku un temperatūru, kā arī kontroles; pēc tam pirms jebkura apstiprinoša testa pārsējiet labi izolētu koloniju, lai iegūtu tīrkultūru. Bieži izmantotie turpmākie izmeklējumi ietver Grama krāsošanu un IMViC reakcijas provizoriskai E. coli un koliformu identifikācijai, TSI vai KIA un mikroorganismam specifiskus bioķīmisko testu paneļus zarnu mikroorganismiem, kā arī seroloģisku, MALDI TOF vai citu validētu identifikāciju, ja uzdevums to prasa. Lai uzzinātu, kā EMB iederas starp selektīvajām un diferenciālajām zarnu mikroorganismu barotnēm, skatiet ievadus par zarnu mikroorganismu kultivēšanas barotnēm un turpmākajiem izmeklējumiem pēc Grama krāsošanas. Saistītajā jautājumā par to, ko zila preparāta krāsošana var un nevar pierādīt, metilēnzilā krāsošanas atlants tāpat skaidri nošķir novērojumu no secinājuma.

Pierakstiet novērojumu pirms secinājuma. «Tumši zilganmelnas kolonijas ar no skata leņķa atkarīgu zaļu spīdumu uz Levine EMB pēc 24 stundām; atbilst intensīvai laktozes fermentācijai» ir pamatots formulējums. «E. coli, apstiprināts» prasa apstiprināšanas posmu, ko plate viena pati nevar nodrošināt.