Heescht méi Sauerstoffverbrauch och méi ATP? Erkenntnesser aus Studie mat Methylenblo

En isoléiert Mitochondrium läit an enger Kummer mat Brennstoff, awer ouni ADP. Et verbraucht lues Sauerstoff. Gëtt ADP derbäigesat, klëmmt de Sauerstoffverbrauch ëm e Méifacht. Wann den ADP opgebraucht ass, geet de Sauerstoffverbrauch nees zeréck. De Brennstoff huet sech ni geännert. Nëmmen de Bedarf un ATP huet sech geännert.

Dës kleng Sequenz enthält de ganzen Ënnerscheed, ëm deen et an dësem Artikel geet. De Sauerstoffverbrauch moosst, wéi séier Elektronen duerch d'Atmungsketten op de Sauerstoff fléissen. D'ATP-Produktioun moosst, wéi vill vun deem Floss als notzbar Energie agefaange gëtt. Déi zwee hunn e gemeinsame Mëttelschrëtt: de Protonengradient iwwer déi bannenzeg Mitochondriemembran. Alles, wat ännert, wéi enk dëse Gradient un d'ATP-Synthes gekoppelt ass, kann déi zwee Endpunkten a verschidde Richtunge beweegen. Methylenblo ass hei e gutt Léierbeispill, well béid Effekter observéiert goufen: an e puer Preparatioune klëmmt de Sauerstoffverbrauch zesumme mam ATP, an aneren klëmmt de Sauerstoffverbrauch, wärend den ATP onverännert bleift oder fält.

Wien als éischt e méi breeden Iwwerbléck iwwer d'Elektroneweidergab wëllt, ka mat der Erklärung ufänken, wéi Methylenblo Elektronen duerch d'Atmungsketten transportéiert. Wien d'Begrëffer vun de fréie Sauerstoffexperimenter verstoe wëllt, ka liesen, wat déi éischt Respiratiounsmiessungen tatsächlech gewisen hunn.

Respiratioun, ATP an de Gradient tëschent hinnen

Elektrone vun NADH a FADH2 kommen iwwer d'Komplexer I an II an d'Ketten, passéieren duerch de Komplex III op de Cytochrom c an duerno duerch de Komplex IV op de Sauerstoff. D'Energie, déi un de Komplexer I, III an IV fräigesat gëtt, pompelt Protonen aus der Matrix an den Intermembranraum. Dës Trennung vu Ladung an Aciditéit ass déi protonemotoresch Kraaft, an hiren elektreschen Deel, d'Membranpotential, ass normalerweis den dominanten Deel.

D'ATP-Synthase léisst Protonen zeréck an d'Matrix fléissen a benotzt déi fräigesat Energie, fir ADP a Phosphat zu ATP ze verbannen. D'Sequenz ass also:

Sauerstoffverbrauch, duerno Protonepompelen, duerno Gradient, duerno ATP-Synthes.

De Problem ass, datt Protonen och iwwer aner Weeër zeréckkomme kënnen. All Réckfloss, deen d'ATP-Synthase ëmgeet, ass e Protonenleck. Dëse Leck zwéngt d'Ketten, déi selwecht Protonen nach eng Kéier erauszepompelen, fir d'Membranpotential stabil ze halen. Dobäi gëtt méi Sauerstoff verbraucht, ouni méi ATP ze produzéieren. E staarkt genuch Leck bedeit Entkopplung: de Sauerstoffverbrauch klëmmt, wärend den ATP onverännert bleift oder fält, an déi verluer Energie gëtt als Hëtzt ofginn.

Zoustand 3, Zoustand 4 an de respiratoresche Kontrollquotient

Déi klassesch Begrëffer dofir kommen aus der Fuerschung mat isoléierte Mitochondrien. Zoustand 3 ass d'Respiratioun a Präsenz vu Substrat an ADP: d'ATP-Synthase baut de Gradient of, d'Membranpotential fält, d'Ketten beschleunegt, fir en nees opzebauen, an de Sauerstoffverbrauch ass héich, well ATP produzéiert gëtt. Zoustand 4 ass d'Respiratioun, nodeems den ADP opgebraucht ass: d'ATP-Synthase leeft am Eidelgang, de Gradient klëmmt, dat héicht Membranpotential wierkt dem weidere Pompelen entgéint, an de Sauerstoffverbrauch fält op dat, wat néideg ass, fir de Leck auszegläichen.

De respiratoresche Kontrollquotient, Zoustand 3 gedeelt duerch Zoustand 4, weist also, wéi enk d'Preparatioun gekoppelt ass. En héije Quotient bedeit, datt ADP d'Respiratioun staark kontrolléiert. E falende Quotient bei engem klammenden Zoustand 4 bedeit, datt de Leck d'Iwwerhand kritt. Aus dëser Perspektiv ginn d'Resultater mat Methylenblo hei ënnendrënner verständlech.

E Gedankemodell soll een am Kapp behalen. En héicht Membranpotential bremst d'Ketten. Wann d'Potential ofgebaut gëtt, beschleunegt se. D'Ketten reagéiert drop, wéi schwéier d'Pompelen ginn ass, an net direkt drop, ob ATP produzéiert gëtt.

Wann d'Endpunkten zesumme variéieren

Dat kloerst Beispill vu Kopplung kënnt aus isoléierte Mitochondrien aus dem Gehir vu Mierschwéngercher mat blockéierten Atmungskomplexer. Bei 100 nanomolar bis 1 micromolar Methylenblo ass de Sauerstoffverbrauch am Rouzoustand mat Glutamat plus Malat, Succinat oder Glycerophosphat als Brennstoff geklommen, wärend d'Respiratioun, déi duerch ADP stimuléiert gouf, onverännert bliwwen ass. A Mitochondrien, bei deenen de Komplex I oder de Komplex III duerch e Gëft blockéiert war, huet de Faarfstoff d'ATP-Produktioun liicht erhéicht, d'Membranpotential erëmhiergestallt an d'Kalziumopnam verbessert. De virgeschloene Wee ass eng Ofkierzung: de Faarfstoff hëlt Elektrone virun der Blockad op a gëtt se un de Cytochrom c weider, sou datt de beschiedegte Komplex ëmgaange gëtt.

En zweete Fall vu Kopplung benotzt eng ganz aner ATP-Quell. An isoléierte Gehirmitochondrien mat gehemmter ATP-Synthase huet Methylenblo d'Respiratioun weiderhin op all getestem Substrat stimuléiert. Mee d'ATP-Synthes ass nëmme mat Alpha-Ketoglutarat a Glutamat geklommen, deenen zwee Substrater, déi Succinyl-CoA bilden. Well Oligomycin d'ATP-Synthase blockéiert huet, koum deen zousätzlechen ATP aus der Phosphoryléierung op Substratniveau duerch d'Succinyl-CoA-Ligase am Zitrounesaierzyklus, an net aus der oxidativer Phosphoryléierung. De Faarfstoff huet och d'Membranpotential erëmhiergestallt, wann de Komplex I an d'ATP-Synthase gläichzäiteg gehemmt waren. Hei sinn de Sauerstoffverbrauch an den ATP zesumme geklommen, awer nëmmen do, wou de Substrat den zweeten ATP-Wee erméiglecht huet. Mat Succinat oder Malat ass d'Respiratioun ouni zousätzlechen ATP geklommen. Dee selwechte Faarfstoff, déi selwecht Kummer, en anere Brennstoff, eng aner Äntwert.

Wann d'Endpunkten auserneeginn

D'Fäll, an deenen d'Endpunkten auserneeginn, sinn och publizéiert a genee esou léierräich. An enger Studie vun 1997 mat isoléierte Mitochondrien aus Ratteleweren huet Methylenblo d'Respiratioun am Zoustand 4 a staark gekoppelte Mitochondrien, déi Succinat verotemt hunn, beschleunegt. Doduerch ass de respiratoresche Kontrollquotient gefall. Den Effekt war vu 0.5 micromolar un ze gesinn a bei 5 micromolar staark ausgepräägt, enger Konzentratioun no bei de Plasmaniveauen no engem intravenéise Bolus vun 100 milligram. Bei 5 micromolar sinn d'Mitochondrien och ugeschwollen, obwuel d'Stéierung vun der Kopplung scho bei méi niddrege Konzentratiounen opgetruede war. Dat schwätzt dofir, datt de Leck virum strukturelle Schued koum, an net duerch dee Schued verursaacht gouf. An entkoppelte Mitochondrien huet de Faarfstoff d'Respiratioun op eng sättigbar, konzentratiounsofhängeg Manéier stimuléiert. De Sauerstoffverbrauch ass a béide Preparatioune geklommen. D'ATP-Synthes pro verbrauchtem Sauerstoff net. Dat ass Entkopplung wéi aus dem Léierbuch zesumme mat Elektronentransport, an deem selwechte Moleküll.

De markantsten Ënnerscheed kënnt aus der Netzhaut. Bei Mais mat AIF-Mangel a Photorezeptorzellen, déi mat Rotenon behandelt goufen, huet Methylenblo d'Déckt vun der Netzhaut, d'Photorezeptormarker an d'mitochondrial Struktur erhalen. Et huet och d'Verhältnis vun NADH zu NAD reduzéiert a Stressweeër ofgeschwächt, dorënner d'Äntwert op net gefalte Proteinen an d'Mitophagie. Dat ass geschitt, ouni den ATP-Defizit ze korrigéieren. Schutz ouni erëmhiergestallt Energie bedeit, datt de Virdeel iwwer d'Redoxbalance an d'mitochondrial Integritéit gelaf ass, an net iwwer zousätzlechen ATP. Wien d'Iwwerliewe vum Gewëss mat enger erëmhiergestallter Energieproduktioun gläichsetzt, géif dëst Experiment komplett falsch interpretéieren.

D'Aarbecht mat Gehirmitochondrien füügt dëser Bilanz och eng Käschtesäit bäi. Déi selwecht niddreg Konzentratiounen, déi d'Bioenergetik verbessert hunn, hunn och ënner all getestem Bedéngung d'Produktioun vu Waasserstoffperoxid erhéicht a säin Ofbau verlangsamt. Dat gouf mat engem kalibréierten Amplex-Assay gemooss, an net mat engem onspezifesche Faarfstoff. Méi ATP a méi Oxidant sinn zesummen opgetrueden.

Eng praktesch Checklëscht fir d'Liesen

Véier Froen ënnerscheeden e gekoppelt Resultat vun engem entkoppelten.

Éischtens: Wéi en Endpunkt gouf tatsächlech gemooss? De Sauerstoffverbrauch eleng ka keng Ausso iwwer ATP maachen. D'ATP-Synthes, d'Membranpotential an de respiratoresche Kontrollquotient liwweren all eenzel en Deel vun der Informatioun, deen d'Sauerstoffelektrod net erfaasse kann. De Guide fir d'Liese vu Fuerschungsaussoen iwwer Methylenblo erkläert dëse konsequenten Ëmgang mat Endpunkten am Detail.

Zweetens: Wéi e Substrat huet d'Mitochondrie versuergt? D'Resultat mat Succinyl-CoA weist, datt d'Wiel vum Brennstoff entscheede kann, ob zousätzlech Respiratioun iwwerhaapt zu zousätzlechem ATP féiere kann.

Drëttens: Wéi eng Konzentratioun gouf benotzt? Methylenblo am Beräich vun nanomolar bis niddrege micromolar Konzentratiounen huet a Gehirmitochondrie liicht bioenergetesch Verbesserunge mat enger zousätzlecher Oxidantelaascht bruecht; vun enger hallwer micromolar un huet et a Lewermitochondrien d'Kopplung ofgeschwächt; bei 5 micromolar koum Schwellung dobäi. D'Konzentratioun ass en Deel vum Mechanismus, an net nëmmen en Hannergronddetail.

Véiertens: A wéi engem Modell gouf d'Resultat erzielt? Isoléiert Mitochondrie maachen déi intern Verbindunge siichtbar, awer intakt Zellen a Gewëss bréngen Transport, Reduktioun zu der faarfloser Form a konkurréierend Elektronenakzeptoren dobäi. D'Aarbecht iwwer d'Doséierung am Laboratoire, dorënner wéi d'Konzentratioun an de Protokoll d'Effekter vu Methylenblo bestëmmen, ass d'Bréck tëschent de Wäerter aus der Kummer an all Ausso iwwer eng Persoun.

De Sauerstoffverbrauch weist den Elektronefloss. Den ATP weist, wéi vill vun deem Floss agefaange gouf. Methylenblo kann dat eent oder dat anert änneren, an d'Experimenter hei uewen weisen all véier Kombinatiounen, déi sech doraus erginn: béid klammen, d'Respiratioun klëmmt nëmmen do, wou de Substrat et erlaabt, d'Respiratioun klëmmt, wärend d'Kopplung ofhëlt, an d'Gewëss bleift erhalen, wärend den ATP onverännert bleift. D'Zuel op der Sauerstoffelektrod ass den Ufank vun der Interpretatioun, net hiren Enn.