D'Absorptiounsspektrum an d'molar Absorptivitéit vu Methylenblo: eng Referenz mat uginnene Bedéngungen

E Spektrum vu Methylenblo gesäit einfach aus, bis ee probéiert, e Wäert doraus erëmzeverwenden. Ee Laboratoire mellt e molaren Extinktiounskoeffizient vun ongeféier 82,000. En anere mellt 67,000. En drëtte mellt iwwer 100,000. All dräi kënnen hir eege Miessunge korrekt beschreiwen, a kee vun hinnen ass eng universell Konstant fir de Faarfstoff.

D'Verwirrung entsteet, well zwee verschidde Konzepter vermëscht ginn. D'Absorbanz ass eng Miessung un enger bestëmmter Léisung an enger bestëmmter Küvett. D'molar Absorptivitéit, dacks als Epsilon geschriwwen, ass e Parameter an engem Modell vun där Léisung. Wann de Methylenblo säin Associatiounszoustand ännert, ännert sech de Modell, an domat och de Parameter. Et ass dofir sënnvoll, all Koeffizient als e Wäert mat uginnene Bedéngungen ze behandelen: Wellelängt, Léisungsmëttel, pH oder Puffer, Temperatur, Konzentratiounsberäich an optesch Weelängt gehéieren ëmmer bei d'Zuel.

D'Monomer-Band a verdënntem Waasser

An enger verdënnter wässerlecher Léisung läit déi dominant Band vum Methylenblo-Kation bei ongeféier 664 bis 665 nm; jee no Instrument a Kalibratioun gëtt heefeg e Beräich vu 664 bis 668 nm uginn. Déi Band ass déi richteg Wiel fir d'Quantifizéierung, wann d'Léisung esou verdënnt ass, datt de gréissten Deel vum Faarfstoff als Monomer virläit.

Dräi Literaturwäerter weisen, firwat d'Bedéngunge méi wichteg si wéi d'Zuel eleng. Fuerscher am Beräich vun den Tounmineraler, déi wässerlech Prouwen ënner ongeféier 7 micromolar an 1 cm Küvetten gehalen hunn, hunn en Epsilon vun ongeféier 82,000 M-1 cm-1 bei 665 nm gemellt. Dee Wäert ass aussergewéinlech gutt als empiresch Kalibratiounssteigung fir ganz verdënnte Waasserprouwen dokumentéiert. Eng méi spéit Primärkalibratioun an deioniséiertem Waasser, mat 2.34 bis 37.52 micromolar an enger optescher Weelängt vun 1 cm, huet ongeféier 67,100 M-1 cm-1 bei 665 nm fir de gesamte Faarfstoff erginn. Dat méi niddregt Resultat ass ze erwaarden an net widderspréchlech, well déi iewescht Hallschent vun deem Kalibratiounsberäich schonn e bedeitenden Undeel un Dimer enthält. En drëtte Wäert, ongeféier 73,460 M-1 cm-1 bei 664 nm, kënnt aus enger Aarbecht bei pH 6.86 an 293 K, déi dat observéiert Spektrum a Monomer- an Dimer-Undeeler zerleet huet, wéi an enger rezenter kritescher Iwwersiicht iwwer d'Photophysik vu Methylenblo zesummegefaasst. Déi Zuel ass eng duerch Dekonvolutioun bestëmmt Monomer-Komponent, net eng direkt Steigung vun der Absorbanz géintiwwer der gesamter Faarfstoffkonzentratioun.

Fir d'Praxis heescht dat: Wielt de Koeffizient, deem seng Bedéngunge mat Äre Prouwen iwwereneestëmmen, oder maacht Är eege Kalibratioun. Iwwerhuelt net einfach 82,000 fir eng Bestëmmung an engem Phosphatpuffer bei 30 micromolar an huelt un, datt d'Linearitéit nach ëmmer gëllt.

D'Schëller bei méi kuerzer Wellelängt ass eng Mëschung

Mat steigender Konzentratioun wiisst eng Schëller bei ongeféier 600 bis 615 nm relativ zum Maximum bei 664 nm. Modern Aarbechte setzen de Bäitrag vum Dimer vum H-Typ meeschtens bei ongeféier 605 bis 610 nm un. Déi global Spektralanalys vu Methylenblo a Waasser léist en Dimer-Maximum bei 607 nm an e Maximum vun engem méi héijen Aggregat bei 600 nm op, mat Monomer-Resonanzkomponente bei 664 an 650 nm. De Volltext ass iwwer den Open-Access-Atrag fir PMID 33251415 disponibel.

Déi Schëller soll net als reng Dimer-Absorbanz bezeechent ginn. Déi vibronesch Struktur vum Monomer dréit och am selwechte Beräich dozou bäi, sou datt déi gemoossen Héicht eng Iwwerlagerung ass. Eng global Modellupassung huet gewisen, datt e Modell mat Monomer an Dimer iwwer de gesamte Beräich vun 1.1 micromolar bis 3.4 millimolar net duergeet, wärend d'Zousetze vun engem Tetramer déi bescht Upassung erginn huet; en Tetramer-Signal war scho bei manner wéi 34 micromolar noweisbar. Déi ugepasste Komponentestäerkte ware grouss: ongeféier 107,800 M-1 cm-1 bei 664 nm fir d'Haaptkomponent vum Monomer, ongeféier 101,400 fir den Dimer bei 607 nm an ongeféier 138,500 fir den Tetramer bei 600 nm, an ongepuffertem deioniséiertem Waasser mat Natriumchlorid vun 0 bis 0.15 M an Temperature vun 282 bis 333 K. Dat si modellbaséiert opgeléisten Undeeler, déi dofir net amplaz vun enger empirescher Beer-Lambert-Steigung agesat däerfe ginn.

D'Stäerkt vun der Dimeriséierung gouf direkt quantifizéiert. Bei pH 6.86 an 293 K huet eng Studie eng Dimeriséierungskonstant vun ongeféier 3,900 M-1 bestëmmt. Déi Gréisstenuerdnung erkläert, firwat eng Aarbechtsléisung vu 5 micromolar sech bal linear verhält, eng Stammléisung vu 50 micromolar awer net. Eng nëtzlech Kontroll bei der Methodentwécklung ass d'Verhältnis vun der Absorbanz bei ongeféier 610 nm zu där bei ongeféier 665 nm. Wann dat Verhältnis mat der Konzentratioun klëmmt, beschreift den Epsilon bei 664 nm net méi eng eenzeg onverännert Spezies.

An engem Konzentratiounsintervall, dat vun engem Pair vu Spezies dominéiert gëtt, déi sech géigesäiteg ëmwandelen, kënnen d'Spektren e gemeinsamen isosbestesche Punkt hunn; a wässerleche Serien gouf en experimentell bei ongeféier 625 nm observéiert. E kloeren, fixe Punkt ass mat zwou dominante Spezies vereinbar. Wann de Punkt sech mat steigender Konzentratioun verréckelt oder verschwënnt, sollt Dir dat als Warnzeeche fir méi héich Aggregater oder verréckelt Gläichgewiichter behandelen, net als Instrumentefehler.

Léisungsmëttel, pH an Temperatur verréckelen d'Spektrum

Waasser begënschtegt d'Associatioun. D'Zousetze vun Dimethylsulfoxid ënnerdréckt d'Dimeriséierung, verréckelt d'Absorptiouns- an d'Fluoreszenzmaxima zu méi laange Wellelängten a vergréissert d'Fluoreszenzquantenausbeut ongeféier ëm de Faktor véier, laut der Léisungsmëttelstudie vu Methylenblo a Waasser- an DMSO-Mëschungen, déi als PMID 30933781 indexéiert ass. Déi Aarbecht behandelt wässerlech Spektren als e Monomer-Dimer-Gläichgewiicht mat Monomer-Absorbanz bei ongeféier 650 bis 670 nm an Dimer-Absorbanz bei ongeféier 580 bis 615 nm, a leet Dimeriséierungskonstanten aus de Spektren bei 293.15 K of.

Alkohole verréckele souwuel d'Positioun wéi och déi anscheinend Stäerkt, mee si verhënneren d'Aggregatioun net komplett. An engem Primärverglach bei 31.3 micromolar a Raumtemperatur, publizéiert an enger Léisungsmëttelstudie vu Methylenblo, louch de Maximum bei laanger Wellelängt bei 665 nm a Waasser, awer bei 655 nm a Methanol, mat anscheinende Wäerter fir déi ganz Léisung vun ongeféier 37,100 a Waasser an 60,800 a Methanol. Eng separat Validatioun an absoluttem Ethanol bei 298 K huet e Maximum bei 655 nm mat engem Epsilon vun ongeféier 68,000 erginn.

Gewéinlech pH-Ännerunge verréckelen d'Spektrum manner, wéi vill Protokoller unhuelen. Déi uewen zitéiert kritesch Iwwersiicht mellt, datt de Maximum vun ongeféier pH 2 bis pH 12 bei ongeféier 665 nm bliwwen ass, mat nëmme klenge Stäerktännerunge bis pH 11. D'Aart vum Puffer an d'Ionenstäerkt kënnen d'Resultater esou staark beaflosse wéi den nominale pH. Dokumentéiert dofir de wierklech benotzte Puffer an d'Salz, net nëmmen de Wäert um pH-Meter. Staark Seier oder staark Alkali ass e separate Fall, well de Faarfstoff eng cheemesch Verännerung amplaz vun enger reversibeler Associatioun duerchmaache kann. Temperatur a Salz verréckelen och d'Gläichgewiicht; dofir huet d'Waasserstudie vun 2020 déi zwee bewosst variéiert.

Esou moossen, datt de Wäert gülteg bleift

Quantitativ Aarbecht baséiert op der Beer-Lambert-Relatioun: D'Absorbanz ass gläich Epsilon mol Konzentratioun mol optesch Weelängt. Dobäi muss nogewise ginn, datt de linearen Intervall ënner Äre Bedéngungen tatsächlech gëllt.

Benotzt eng 1 cm Küvett fir Aarbechten am niddrege micromolar-Beräich. Mat engem Epsilon vun ongeféier 82,000 erginn 5 micromolar eng Absorbanz vun ongeféier 0.41 an 10 micromolar ongeféier 0.82. Fir eng op de Monomer ausgeriichte Miessung a rengem Waasser ass et méi sécher, bei ongeféier 5 bis 7 micromolar oder drënner ze bleiwen, wéi bis wäit an de Beräich vun e puer Zéng micromolar ze kalibréieren. Fir konzentréiert Stammléisunge sollt Dir déi optesch Weelängt verkierzen, amplaz eng Absorbanz däitlech iwwer 1 ze akzeptéieren.

Maacht d'Blindmiessung mat der identescher Matrix: déiselwecht Waasserqualitéit, dee selwechte Cosolvensundeel, dee selwechte Puffer an déiselwecht Salzer, awer ouni Faarfstoff. Preparéiert d'Kalibratiounsléisungen an där selwechter Matrix bei där selwechter Temperatur. Scannt wärend der Entwécklung de gesamte siichtbare Beräich, am beschten ongeféier 550 bis 750 nm, amplaz nëmmen eng eenzeg Wellelängt ze moossen. Verfollegt d'Form, net nëmmen d'Héicht. Wann eng seriell Verdënnung déi normaliséiert Form ännert, ass de System a cheemescher Hisiicht vun der Konzentratioun ofhängeg. E stabile Maximum an e stabilt Verhältnis vun der Absorbanz bei 610 zu där bei 665 nm si méi staark Beleeër fir en akzeptabele Beräich wéi en héije R-Quadrat-Wäert eleng.

Dokumentéiert d'Form vum Reagens. Kommerziellt Material kann waasserfräit Methylthioniniumchlorid oder en Hydrat wéi den Trihydrat sinn; déi molar Mass, déi fir d'Berechnung vun de Stammléisunge benotzt gëtt, muss dofir mam tatsächleche Fläscheninhalt iwwereneestëmmen. Dëse Schrëtt eleng erkläert en Deel vun den Ënnerscheeder tëscht nominale molare Konzentratiounen a verschiddene Laboratoiren. Déiselwecht Disziplin ass néideg, wann d'Resultater a quantitativ Analysberechnungen afléissen, wann d'Spektre Stabilitéitskontrolle vu Formuléierungen ënnerstëtzen a wann d'Veronrengegungsprofiller eng Iwwerpréiwung vun der Rengheet an de Spezifikatioune verlaangen.

Zesummefaassung mat uginnene Bedéngungen

Benotzt dës Tabell als Ausgangsvirlag fir e Laborprotokoll, net als Quell vun austauschbare Konstanten.

D'Fro no der Absorbanz-Wellelängt vu Methylenblo huet also eng kuerz Äntwert mat enger laanger Foussnotiz. Gitt de Maximum un, deen Dir gemooss hutt, an der Léisung, déi Dir gemooss hutt, bei der Konzentratioun, déi Dir gemooss hutt. Esou verhënnert Dir, datt ee Wäert fir eng verdënnt wässerlech Léisung bei ongeféier 664 nm zu enger falscher universeller Konstant gëtt.