Şîna metîlenê û otofajî: AMPK, mTOR û ceribandinên neuronî

Bifikirin ku hûn ceribandineke şaneyî dikin, şîna metîlenê lê zêde dikin û dibînin ku banda proteînekê bi navê LC3-II li ser blota we tarîtir dibe. Mi rov dixwaze ragihîne ku ev pêkhate «otofajiyê zêde dike» û derbas bibe. Ev şîrove hîn zû ye. Bandeke tarîtir a LC3-II dikare wateya wê be ku şane bêtir vesîkulên paqijkirinê çêdike, an jî vesîkul li hev dicivin ji ber ku gava rakirina wan hatiye astengkirin. Ev her du şîrove ber bi aliyên berevajî ve diçin, û di wêjeya zanistî ya neuronî ya li ser şîna metîlenê de mînakên delîlên her du cureyan hene. Ev gotar, test bi test, li tiştên ku bi rastî hatine pîvan dinêre.

Makrootofajî, forma ku li vir hatiye lêkolînkirin, pêvajoya şaneyê ya vezivrandina bi komê ye. Kîseke perdeyî bi navê fagofor li dora proteîn û organelên kevinbûyî mezin dibe, digire û dibe otofagozom, bi lizozomekê re dibe yek, û barê wê tê hilweşandin û ji bo bikaranîna ji nû ve tê berdan. Neuron bi vê pêvajoya asayî ve girêdayî ne, ji ber ku ew parçe nabin û nikarin bi parvebûnê rêjeya beşên zirardîtî kêm bikin. Dema vezivrandin radiweste, bermayî dicivin. Dema ew dimeşe, şane di bin stresê de madeyên bingehîn ên avakirinê vedigire.

Ceribandineke hîpokampal çi nîşan da

Lêkolîna sereke ya destpêkirinê şaneyên hîpokampal ên mişkan ên HT22 bi kar anî, ku bi bêparkirina ji serumê ji bo 24 saetan ketibûn bin stresê. Ev rewş faktorên mezinbûnê û sînyalên trofîk radike û hem apoptozê hem jî otofajiyê dest pê dike. Lêkolîneran ragihand ku şîna metîlenê mirina şaneyan bi awayekî girêdayî dozê kêm kir, û ev parastin bi nîşanên makrootofajiyê re pêk hat.

Rêza nîşankeran taybet bû. Boyaxa belavbûyî ya LC3B, ji nêzî 20 nM şîna metîlenê ve, li xalan li dora navokê ji nû ve belav bû; bersiva herî bihêz a LC3-I û LC3-II li nêzî 1 μM bû. Hem LC3B-I hem jî LC3B-II bi awayekî girêdayî doz û demê zêde bûn. Ya girîng ew e ku tîm ji bloteke statîk a LC3 gavêke pêş ve çû. Wan 10 μM klorokîn lê zêde kir, ku rakirina lizozomî asteng dike, û di şaneyên ku şîna metîlenê lê hatibû sepandin de LC3-II bilindtir û p62 stabîlkirî dîtin. Ev şêwe piştgirî dide pêvajoya hilweşandina girêdayî lizozomê, ne tenê lihevcivînekê. Wan herwiha nîşan da ku klorokîn bandora dij-apoptozî heta radeyekê berevajî kir; ev yek di vê modelê de parastinê bi rêya otofajî û lizozomê ve girê dide.

Encama sînyaldayînê ew beş e ku herî zêde bi xeletî tê vegotin. Sînyaldayîna AMPK, ku bi AMPK ya fosforîlekirî û armanca wê ya li xwarê, ACC ya fosforîlekirî, hat pîvan, di 12 û 24 saetan de bi awayekî girêdayî dozê zêde bû. Astengkerê AMPK, Compound C, ku di 4 saetên dawî de bi 20 μM hat sepandin, hem fosforîlekirina ACC hem jî çalakkirina LC3 kêm kir. Berevajî vê, di mTOR ya fosforîlekirî de tu tepeserkirineke ku bihata dîtin nehat dîtin. Ji ber vê yekê, di şaneyên hîpokampal ên bin stresê de encam destpêkirineke girêdayî AMPK bû, bi rêyekê ku xuya bû ji mTOR serbixwe ye. Heman şêwe di mişkên zindî de jî xuya bû; li wir sepandina şîna metîlenê nîşankerên makrootofajiyê di korteks û hîpokampê de zêde kir.

Destpêkirin ne herikîna temamkirî ye

Li vir cudahiya têgehan pir girîng e. Destpêkirin tê wê wateyê ku mekanîzmên li jor bêtir otofagozoman çêdikin. Herikîn tê wê wateyê ku bar tevahiya rêyê derbas dike: veqetandin, gihîştin, yekbûna bi lizozomê re, hilweşandin û vezivrandin. Her zêdebûneke LC3-II, heta ku testeke herikînê beşa mayî ya rêwîtiyê piştrast bike, tenê îdiayeke destpêkirinê ye.

Testa standard a herikînê LC3-II bi û bê astengkirineke kurt a lizozomî, wek bafilomycin A1 an klorokîn, dipîve. Heke sepandin bi rastî hilberînê bileztir bike, astengkirina hilweşandinê divê LC3-II hîn bilindtir bike. Raporkereke cot a mCherry-GFP-LC3 nêrîneke duyemîn zêde dike: avahî berî yekbûna bi lizozomê re zer dibiriqin û piştî ku asîd sînyala GFP vemirîne tenê sor dibiriqin. Ji ber vê yekê, zêdebûna xalên tenê sor piştgirî dide pêşketina ber bi otolizozomên asîdî ve. Kêmbûna proteîna p62 dikare hilweşandina bar piştrast bike, lê divê bê jibîrkirin ku transkrîpsiyona p62 bi xwe jî bersivê dide stresê û divê li asta mRNA bê kontrolkirin.

Lîsteya kontrolê ya li jêr her testê ku di vê wêjeya zanistî de hatiye bikaranîn bi tiştê ku dipîve û tiştê ku bi tena serê xwe nikare îspat bike ve girê dide. Xwîner dikarin wê ji bo her îdiayeke makrootofajiyê ya paşerojê ji nû ve bi kar bînin, di nav de argumanên rojîgirtin û dirêjahiya temenê ku van nîşankeran bi kar tînin.

Bala xwe bidin xefikeke peyvkirinê ku tablo ji wê diparêze. ACC ya fosforîlekirî forma ku ji aliyê enzîmî ve hatiye astengkirin e. Zêdebûna wê derana AMPK nîşan dide, ne çalakkirina ACC.

Gotina «astengkirina makrootofajiyê parastina neuronî ji holê rakir» heman hûrbûnê dixwaze. Di modela HT22 de ev tê wê wateyê ku destwerdana rêya otofajî û lizozomê avantaja zindîmayînê ya şîna metîlenê di bin bêparkirina ji serumê de ji holê rakir. Ev di wê firaxê de piştgirî dide rola otofajiyê wek pêvajoyeke pêwîst an alîkar. Ev nayê wê wateyê ku otofajî yekane mekanîzmeya parastinê ya vê pêkhatê ye, îspat nake ku klorokîn tenê bi rêya otofajiyê tevdigere, û ji bo bihêzkirina îdiaya sedemî, destwerdaneke genetîk di ATG5, ATG7 an ULK1 de pêwîst e.

Du rê ber bi heman mekanîzmeyê ve

Nexşeyeke sade alîkar e. Stresa enerjiyê AMPK zêde dike, AMPK kompleksa ULK1 çalak dike û otofajî dest pê dike. Faktorên mezinbûnê û madeyên xurekî mTORC1 zêde dikin, mTORC1 ULK1 asteng dike û otofajî neçalak dimîne. Li xwarê ji ULK1, kompleksa Beclin-1 û VPS34 avakirina fagoforê dest pê dike, LC3-I bi lîpîdkirinê dibe LC3-II, otofagozom digire, bi lizozomê re dibe yek û bar tê hilweşandin, di heman demê de p62 jî tê hilweşandin.

Şema her encama şîna metîlenê li ser vê nexşeyê bi cih dike: encama hîpokampal li kêleka şaxa AMPK, encama şaneyên pêşber li kêleka şaxa mTOR.

Ev çarçove nakokiya xuya ya bi lêkolîna duyemîn a Xie re çareser dike. Di şaneyên pêşber ên sinirî yên mezinbûyî yên mişkên mezin de, ceribandineke cuda dît ku 5 μM şîna metîlenê pirbûnê asteng kir û rewşa bêçalakiyê teşwîq kir. Şaneyên Ki67-erênî di rojên 1 û 3 de kêm bûn, lê cudabûna ber bi neuronê ve ya ku berê dest pê kiribû sax ma. Li wir mekanîzme bi rêya tepeserkirina sînyaldayîna mTOR xebitî: mTOR ya giştî û mTOR ya fosforîlekirî kêm bûn, derbirîna p70S6K û 4EBP1 jî kêm bû, û derbirîna sîklînên E1, B1, D1 û D2 hate daxistin. Fenotîpa serdest bêçalakiya şaneyên pêşber bû, ku nivîskaran bi derengxistina pîrbûna şaneyî ve girê da, ne bi rizgarkirina şaneyên hîpokampal ên bin stresê ve.

Di navbera her du gotarên zanistî de nakokî tune ye. AMPK û mTOR yekxistkerên ku li gorî şert û mercan bersivê didin in, ne guhêrkerên sabît. Şaneyeke dişibe neuronê ku di bin stresê de ye dikare AMPK çalak bike bêyî astengkirineke mTOR ya ku bê pîvan, lê şaneyeke pêşber ku bi mîtojenê tê ajotin dikare bi kêmkirina mekanîzmên mezinbûnê yên girêdayî mTOR bersivê bide heman pêkhatê. Cureyê şaneyê, şertên stresê, konsantrasyon û dema pîvanê diyar dikin ka kîjan şax serdest e. Herwiha ji ber vê yekê ye ku bandorên şîna metîlenê yên li ser enerjî û redoksa mîtokondrîyan di heman wêneyê de cih digirin: wek ku nirxandineke mekanîzmî ya parastina neuronî rave dike, ev pêkhate wek hilgireke alternatîf a elektronan tevdigere, sînyaldayîna antîoksîdan û dij-apoptozî çalak dike, MAO û NOS asteng dike û bi rêya bîyojeneza mîtokondrîyan û otofajiyê bi nûkirina mîtokondrîyan ve girê dide. Otofajî şaxeke profîleke pirbandorî ye, ne tevahiya çîrokê.

Ceribandin çi nîşan nadin

Bêparkirina ji serumê stresa trofîk û metabolîk di firaxekê de model dike. Ew rojîgirtina tevahiya organîzmayê model nake: glukoz, asîdên amînî û xwê di navenda bingehîn de dimînin û tu tevgera xwarinê tune ye. Konsantrasyonên çandina şaneyan ji 20 nM heta 5 μM bi hesabkirineke arîtmetîk nayên veguhertin dozên mirovan, ji ber ku kişandin, girêdana bi proteînan, rewşa redoksê, metabolîzm, komkirina di tevnê de û dema rûbirûbûnê hemû ji hev cuda ne.

Tu ceribandineke li ser mirovan nehatiye sêwirandin ku di nexweşan de herikîna otofajîk a bi şîna metîlenê hatî destpêkirin nîşan bide. Delîlên mekanîzmî hîn li asta xebatên şaneyî, ex vivo û heywanan in, û nirxandin hîn delîlên veguhastina ber bi sepandina klînîkî ve wek pêşîn bi nav dikin. Ji ber vê yekê, ev lêkolîn nîşan nadin ku şîna metîlenê rojîgirtinê dubare dike, bi rêya otofajiyê temenê mirovan dirêj dike an herikîna otofajîk di mejiyê mirovan de temam dike. Îdiayên derbarê teqlîdkirina rojîgirtinê û dirêjahiya temenê de delîlên klînîkî yên xwe dixwazin, û ceribandinên şîna metîlenê yên li ser mirovan ji bo armancên din tenê bi girêdanê nabin ceribandinên otofajiyê. Lêkolînên li ser modelên stresa madeyên xurekî û dirêjahiya temenê divê bi li ber çavan girtina vî sînorî bên xwendin.

Ji bo gotara zanistî ya din ku hûn dixwînin, lîsteya kontrolê bi rêzê bi kar bînin. Pêşî bipirsin ka kîjan şax guherî: AMPK, mTOR an tu yek ji wan. Paşê bipirsin ka encama LC3 bi testeke herikînê re hatibû cotkirin an bi tena serê xwe bû. Piştre kontrol bikin ka astengkirina rêyê feyde ji holê rakir an na, û bi kîjan rêbazê. Lêkolîneke ku bersiva her sêyan dide, bingeheke xurt ji bo îdiayeke mekanîzmî bi dest xistiye. Ya ku tenê bersiva ya yekem dide, sînyaleke destûrê nîşan daye, û beşa mayî ya rêwîtiyê hîn nexşekirî nîne.