Жаңа метилен көгі және ретикулоциттерді бояу: бөлек бояғыш және тірі жасушаларға арналған әдіс

Студент ретикулоциттерді санауға дайындалып, метилен көгіне тапсырыс береді, оны қанмен араластырады, бірақ ештеңе дерлік көрмейді. Оның курстасы «жаңа метилен көгі» деп белгіленген құтыны пайдаланып, эритроциттердің бір бөлігінің ішінен айқын көк жіпшелерді көреді. Бірінші студент екінші құтыдағы бояғыш жаңарақ немесе қоюырақ деп ойлайды. Екеуі де дұрыс емес. Оның құрамында басқа молекула бар.

Осы саладағы түсінбеушіліктің көбі дәл осы ұғымдық қателіктен туындайды. Атауы жаңа метилен көгін метилен көгінің жетілдірілген партиясы сияқты көрсетеді. Алайда химиялық тұрғыдан олай емес. Жаңа метилен көгі N — өзінің Colour Index нөмірі, орынбасушы топтарының орналасу үлгісі және гематологиядағы стандартталған қызметі бар бөлек фенотиазин бояғышы. Осы айырмашылық түсінікті болғанда, әдістің қалған тұстары да айқындалады: бояу кезінде жасушалар неге тірі болуы керек, нені ретикулоцит деп санау керек, Гейнц денешіктерінің орны қандай және бриллиантты крезил көгі қашан қолданылады.

Қысқаша жауап

Гематологиялық реагент болып саналатын жаңа метилен көгі N әдетте PubChem дерекқорындағы жаңа метилен көгі жазбасында Basic Blue 24 ретінде көрсетіледі: C.I. 52030, CAS 1934-16-3, формуласы C18H22ClN3S. Кәдімгі метилен көгі PubChem дерекқорындағы өз жазбасында метилтиониний хлориді, Basic Blue 9 ретінде көрсетілген: C.I. 52015, CAS 61-73-4, формуласы C16H18ClN3S. Құрылымдық тұрғыдан жаңа метилен көгінің сақинасында екі метил тобы және метилен көгіндегі диметиламино топтарының орнына этиламино бүйірлік тізбектері бар. Осы айырмашылық боялу сипатын өзгертеді. Гематология оқулықтары кәдімгі метилен көгін ретикулоциттерді салыстырмалы түрде нашар бояйтын, ал жаңа метилен көгін қанығырақ әрі біркелкі бояйтын бояғыш ретінде сипаттайды. Бұл салыстыру ScienceDirect сайтындағы жаңа метилен көгі туралы шолуда жинақталған.

Иә, жаңа метилен көгі — суправиталды бояғыш. NCBI сайтындағы суправиталды бояу қағидаларына арналған шолуда анықталғандай, суправиталды бояу дегеніміз — ағзадан алынған тірі жасушаларды фиксациялауға дейін бояу. Жаңа метилен көгі де, бриллиантты крезил көгі де осы санатқа жатады, ал ретикулоциттерге арналған CLSI стандарты жаңа метилен көгін суправиталды бояғыш ретінде нақты қамтиды. Студенттер кейде мұны фиксацияланған жағындыларды Романовский әдісімен бояумен бір санатқа жатқызады. Мұндай түсінік бұл жерде жарамайды. Алдымен фиксация жасалса, әдіс жұмыс істемейді.

Атаулары ұқсас бояғыштарды ажыратқысы келетін оқырмандар үшін метил көгі мен метилен көгінің айырмашылығы аниондық триарилметан бояғышы мен катиондық фенотиазиндер тобы арасындағы басқа, анағұрлым ауқымды шатасуды түсіндіреді. Зертханалық бояу әдістеріне шолу суправиталды бояуды фиксацияланған жағындыларға арналған әдістермен қатар қарастырады, ал қан жасушаларының морфологиясы жөніндегі нұсқаулық ретикулоциттерді бағалаудың кеңірек дифференциалды талдаудағы орнын көрсетеді.

Каталогқа қатысты бір ескерту: жаңа метилен көгінің мырыш хлоридімен түзілген бөлек қос тұз түрі CAS 6586-05-6 нөмірімен тіркелген. Сондықтан әдістер бөлімінде тек жалпы атауды емес, тұздың түрі мен жеткізушіні де көрсету керек.

Суправиталды бояу шын мәнінде не істейді

Ретикулоцит — ядросын жоғалтқан, бірақ қалдық рибосомалық РНҚ-сы сақталған жас эритроцит. Боялмаған ылғалды препаратта бұл РНҚ көрінбейді. Суправиталды бояғыш тірі жасушаға еніп, сол РНҚ-ны тұндырады немесе біріктіріп, көк түйіршіктер мен жіпшелер түзеді. Майлы иммерсиямен қарағанда көрінетін торлы-жіпшелі материал — осы. Демек, тор — бояуды күтіп тұрған дайын қаңқа емес, бояу нәтижесінде түзілген өнім. Сондықтан хаттама айнымалылары — бояғыш концентрациясы, буфер, қан мен бояғыштың арақатынасы, температура және уақыт — бояғыш атауы сияқты маңызды.

Іс жүзінде бұл әрекеттердің қатаң ретін талап етеді: алдымен антикоагулянт қосылған қанды бояғышпен араластырып, инкубациялау, содан кейін жағындылар жасап, оларды фиксациясыз және қосымша бояусыз қарау керек. Бояуға дейінгі фиксация немесе әлсіз жіпшелерді көлегейлейтін қосымша бояу санауға қажетті ақпаратты жояды.

Ретикулоциттерді жаңа метилен көгімен бояудың жұмыс хаттамасы

Бірыңғай әмбебап құрам жоқ, сондықтан қолданылған құрамды көрсету керек. Құжатталған үш нұсқа олардың ауқымын көрсетеді.

Классикалық Брехер үлгісіндегі әдісте калий оксалаты бар шамамен 0.5 пайыздық жаңа метилен көгі жақсы араластырылған EDTA қосылған қанмен тең көлемде араластырылып, бөлме температурасында шамамен 10–15 минут инкубацияланады. Қайтадан ақырын араластырғаннан кейін жұқа сына тәрізді жағындылар дайындалып, ауада кептіріледі және фиксациясыз 100x майлы иммерсиялық объективпен қаралады. NCBI сайтындағы ретикулоциттерді санау рәсімі осы жұмыс ретін және онымен бірге қолданылатын санау жақтауын сипаттайды.

Дейси мен Льюис нұсқасында цитратты тұзды ерітіндідегі 1.0 пайыздық жаңа метилен көгі пайдаланылады. Ол қанның 2–4 көлемімен араластырылып, жағынды жасалғанға дейін 37 C температурада 15–20 минут ұсталады. CLSI H44 рәсімін үйлестіруге арналған жуырдағы жұмыста pH 7.4 фосфатты буферлік тұзды ерітіндідегі сұйығырақ, 0.1 пайыздық ерітінді қолданылған: 20 C температурада 10 минут инкубацияланып, фиксация жасалмаған. Бұл 2026 жылғы NMB әдісін үйлестіру зерттеуінде баяндалған.

Санау ережелері барлық нұсқаларға ортақ. Жасушада көк түске боялған кемінде екі бөлек түйіршік немесе жіпше бөлігі болса, оны ретикулоцит деп есептеңіз. Бұл бояғыштың жалғыз шөгіндісін есепке қоспауға мүмкіндік береді. Күнделікті жұмыста кемінде 1,000 эритроцит санап, ретикулоциттерді пайызбен көрсетіңіз. Пайызы төмен болғанда статистикалық тұрғыдан көбірек жасуша санау қажет. CLSI H44 әдістемесіне шолуда ретикулоциттер шамамен 1 пайыз болғанда санау вариациясын 5 пайызға дейін түсіру үшін шамамен 4,400 жасуша қажет екені айтылған; бұл мәлімет De Gruyter сайтындағы CLSI H44 шолуында берілген. Миллер окулярлық дискісі көп жасушаны санауды іс жүзінде ыңғайлы етеді. Бояғышты сүзгілеңіз немесе жаңадан дайындаңыз, өйткені тұнба түйіршікті қосындыларға ұқсайды.

Сол препараттағы Гейнц денешіктері

Сол суправиталды жағындыдан Гейнц денешіктерін де көруге болады. Олар қалдық РНҚ емес, тотыққан және денатурацияланған гемоглобин агрегаттары. Жаңа метилен көгімен дайындалған препараттарда олар дөңгелек денешіктер түрінде көрінеді, көбіне жалғыз және мембранаға жақын орналасады, әрі торлы-жіпшелі материалға қарағанда ашығырақ көк түске боялады. Олар фиксация мен қосымша бояу кезінде нашар сақталады, сондықтан фиксацияланбаған жағындыны қарау керек. Жуырдағы бір хаттамада EDTA қосылған қанның 20 микролитрі 1 пайыздық жаңа метилен көгінің 20 микролитрімен араластырылып, 15 минут инкубацияланғаннан кейін 250 эритроцит арасындағы Гейнц денешіктері бар жасушалар саналған. Бұл рәсім PMC сайтындағы зерттеуде баяндалған.

Екі айырмашылық қате түсіндіруден сақтайды. Біріншіден, ScienceDirect сайтындағы Гейнц денешіктері туралы шолуда атап өтілгендей, метил күлгіні мен кристалл күлгіні Гейнц денешіктерін жаңа метилен көгіне қарағанда қанығырақ бояйды. Жаңа метилен көгі — ретикулоциттер мен Гейнц денешіктерін бірге бағалауға ыңғайлы таңдау, бірақ Гейнц денешіктеріне арнайы арналған ең күшті бояғыш емес. Екіншіден, альфа-талассемия тасымалдаушылығындағы HbH қосындылары суправиталды бояудан кейін жасушаның бүкіл аумағында көптеген ұсақ нүкте түрінде көрінеді, ал классикалық Гейнц денешіктері саны жағынан азырақ, ірірек және көбіне мембранамен байланысты болады. Үшінші ұқсас көрініс — бояғыш шөгіндісі: ол жасушалардың фокустық жазықтығынан тыс жатады және көру өрістері арасында өзгеріп отырады.

Бриллиантты крезил көгі мен жаңа метилен көгінің айырмашылығы

Екі бояғыш та ретикулоциттерді суправиталды бояуға арналған, бірақ стандарттау олардың біріне басымдық береді. Гематологияны стандарттау жөніндегі халықаралық кеңеспен бірлесіп әзірленген және CLSI H44 стандартының бетінде көрсетілген CLSI H44-A2 ретикулоциттер әдісі EDTA қосылған қанды жаңа метилен көгімен бояуды қолмен орындалатын салыстыру әдісі ретінде белгілейді. Классикалық гематология оқулықтары көрініс жөнінде осы пікірмен келіседі: жаңа метилен көгі жіпшелерді қанығырақ әрі біркелкі бояйды, ал бриллиантты крезил көгінің нәтижесі партиялар мен үлгілер арасында көбірек өзгереді.

Бұл мәртебеге қатысты ескерту қажет. ICSH анализаторларын бағалау жөніндегі нұсқаулық жаңа метилен көгімен бояп, қолмен жүргізілетін микроскопияны референттік салыстыру тәсілі ретінде қабылдайды, бірақ оны субъективті және салыстырмалы түрде дәлдігі төмен деп сипаттайды; мүмкіндік болған жағдайда ағындық цитометрияға негізделген референттік рәсімдерге басымдық беріледі. 2022 жылы 100 үлгіге жүргізілген салыстыруда бриллиантты крезил көгінің нәтижелері қолданылған анализатор көрсеткіштерінен жаңа метилен көгіне қарағанда азырақ жүйелі ауытқыған. Бұл PMC сайтындағы бояу әдістерін салыстыру зерттеуінде баяндалған. Студенттерге арналған негізді қорытынды мынадай: жаңа метилен көгін стандартталған қолмен салыстыру әдісінде қолданыңыз, жергілікті бриллиантты крезил көгі әдісін соған немесе автоматтандырылған әдіске қатысты тексеріңіз және екі жағдайда да қолмен жүргізілетін микроскопия нәтижелерінің шашырауы кеңірек болатынын ескеріңіз. Бұрынырақ шыққан стандарттау әдебиетінде коммерциялық бояғыш партияларының құрамы өзгеріп отырғандықтан, тазартылған Azure B химиялық тұрғыдан тазарақ балама ретінде ұсынылған. Бұл Azure B туралы Маршалл зерттеуінде айтылған және әдістерді талқылауда реагенттің тазалық дәрежесі неліктен әлі де сөз болатынын түсіндіреді.

Жиі кездесетін қателерден сақтану

Сәтсіз препараттардың көбіне төрт қате себеп болады. Жаңа метилен көгі N орнына кәдімгі метилен көгіне тапсырыс беру техникаға емес, химиялық қасиеттерге байланысты әлсіз боялуға әкеледі. Қарауға дейін фиксациялау немесе қосымша бояу суправиталды сигналды жояды. Бояғыш тұнбасын түйіршіктер деп санау нәтижені асырады; екі түйіршік ережесі мен сүзгіленген бояғыш бұған жол бермейді. Ретикулоциттердің пайызы төмен кезде тым аз жасуша санау дәл көрінетін, бірақ сенімділік шектері кең сан береді. Бұл қателердің бәріне ортақ белгі бар: микроскопист реагентпен жұмыс істеу кезеңінде анықталған нәтижеге микроскопты кінәлайды.