Метилен көгінің митохондриялық әсерлерін өлшеу: оттегі, ATP және мембрана потенциалы

Зертхана тыныс алуы бұзылған митохондрияларға метилен көгін қосып, оттегі тұтынуының артқанын байқады делік. Мұндайда бояғыш митохондрия қызметін қалпына келтірді деп жазғыңыз келеді. Бірақ бұл тұжырым қате болуы мүмкін. Оттегі ағыны, ATP синтезі және мембрана потенциалы — үш бөлек ұғым. Олар бір органеллада жүреді, дәл сол сияқты сақтық көшірме жасау, синхрондау және ортақ қолжетімділік бір бұлттық қалтада іске асады: өзара байланысты, бірақ әрқайсысы бөлек ережелерге бағынады. Бірін екіншісімен шатастырсаңыз, барлық өлшеу техникалық тұрғыдан дұрыс болса да, оларды түсіндіру қате болады.

Метилен көгі мұндай шатасуды ықтимал етеді, өйткені ол өзі өлшенетін жүйеге қатысады. Ол тізбектің алдыңғы бөлігінде электрондарды қабылдап, кейінгі бөлігінде беретін тотығу-тотықсыздану циклдеріне қатысады; энергияланған митохондрияларда жиналатын липофильді катион болып табылады; әрі кең таралған зондтармен бірдей спектрлік жолақтарда жарықты жұтатын және шығаратын қанық көк қосылыс. Бір ғана көрсеткіш мұның бәрін қамти алмайды. Будапештте жүргізілген митохондриялық зерттеулерде көрсетілген сенімді тәсіл — әр кезеңде бояғышқа тән бақылауларды қолданып, оттегі ағынын, ATP синтезінің жылдамдығын, мембрана потенциалын және сутегі пероксидінің бөлінуін бірге өлшеу.

Респирометрия энергия өндірілуін емес, оттегі ағынын өлшейді

Oroboros Oxygraph немесе Seahorse жасушадан тыс ағын анализаторы қолданылса да, жоғары ажыратымдылықтағы респирометрия бір ғана нәрсені көрсетеді: оттегінің қаншалықты жылдам тотықсызданатынын. Ол бір электронға шаққанда қанша протон айдалғанын, градиенттің қаншалықты сақталғанын немесе ATP-синтазаның оны пайдаланған-пайдаланбағанын көрсетпейді.

Терминдердің маңызы бар. Оқшауланған митохондрияларда ADP-сіз субстрат протондардың ағып кетуіне байланысты тыныс алуды, қанықтыратын мөлшердегі ADP бар субстрат тотығулық фосфорлану қабілетін, ал ажыратқышты титрлеу электрон тасымалдаудың ең жоғары қабілетін көрсетеді. Бүтін жасушаларда бұларға сәйкес келетін Seahorse көрсеткіштері — базалық тыныс алу, олигомицинге сезімтал ATP-мен байланысты тыныс алу, протондардың ағып кетуі, FCCP арқылы анықталатын ең жоғары тыныс алу және ротенон мен антимицинге төзімді митохондриялық емес оттегі тұтынуы. Seahorse нәтижелерін State 3 және State 4 деп атау зерттелетін препарат қамтамасыз ете алмайтын дәлдікті телиді; мұны Agilent Mito Stress Test әдістемесі анық көрсетеді.

Метилен көгі оттегі көбірек тұтынылса, энергия да көбірек өндіріледі деген интуитивті байланысты бұзады. Оқшауланған ми митохондрияларын зерттеу деректеріне сәйкес, теңіз шошқасының оқшауланған ми митохондрияларында 100 nM-ден 1 uM-ге дейінгі бояғыш глутамат пен малат, сукцинат және альфа-глицерофосфат субстраттары бар кезде тыныштықтағы оттегі тұтынуын арттырған; альфа-глицерофосфатпен өсім шамамен 64 пайыз болған. Алайда қалыпты митохондрияларда ADP ынталандыратын тыныс алу іс жүзінде өзгермеген. Протондардың ағып кетуіне байланысты тыныс алу артып, ал ADP ынталандыратын ағын өзгермегендіктен, есептелген тыныс алуды бақылау коэффициенті төмендейді. Бұл төмендеу бояғыш митохондрияларды зақымдады дегенді білдірмейді. Ол бояғыш қалыпты тыныс алуға қосымша оттегі тұтынатын тотығу-тотықсыздану циклін енгізгенін білдіреді. Метилен көгімен оттегі тұтынуын талдау тек осы өсімді көрсетсе, ол нақты химиялық үдерісті өлшегенімен, энергияның сақталуы туралы ештеңе айтпайды.

Қалпына келтіру тәжірибелері осы алшақтықты үлкенірек ауқымда көрсетеді. I кешені тежелгенде, оттегі ағыны шамамен үш есе, ал ATP синтезі тек шамамен 1.5 есе қалпына келген. Электродқа көбірек оттегі жеткен. Бірақ оның азырақ үлесі ATP өндіруге жұмсалған. Тотығулық фосфорланудың жақсарғаны туралы кез келген тұжырымға ATP жөніндегі деректер де қажет; дұрысы, оларды бөлімдегі оттегінің қандай негізде есептелгенін көрсетіп, ATP-нің оттегіге қатынасы түрінде беру керек.

ATP талдаулары синтез жылдамдығын өлшейді, оны ATP мөлшерімен алмастыруға болмайды

ATP талдауы басқа сұраққа жауап береді: уақыт бірлігінде қанша ATP түзіледі. Бірнеше минут бойы бақыланатын жарқырауық қоңыз люциферазасының люминесценциясы немесе 340 nm-де өлшенетін гексокиназа мен глюкоза-6-фосфатдегидрогеназаның жұптасқан талдауы сияқты кинетикалық өлшеу жылдамдықты береді. Соңғы нүктеде жалпы ATP-ні бір рет өлшеу оның мөлшерін береді. Бұл мөлшер синтез бен тұтыну айырмасын көрсетеді және өздігінен тотығулық фосфорлану туралы аз ақпарат береді.

Будапешт тобы аденилаткиназаны тежеп, жұптасқан ферменттік әдісті қолданған. Олар 1–2 uM метилен көгі ротенонмен және антимицинмен өңделген митохондрияларда ATP өндірілуін аздап, бірақ статистикалық мәнді түрде арттырғанын анықтаған. Бұл — шынайы, бірақ ішінара қалпына келу. TEGDMA уыттылығын зерттеу басқа модельде де ұқсас нәтижеге жеткен: 5 mM стоматологиялық мономер TEGDMA I кешенімен байланысты тыныс алуды шамамен 286-дан 28 ағын бірлігіне дейін төмендеткен, ал 2 uM бояғыш оны шамамен 86-ға дейін қалпына келтірген.

Түсті тотығу-тотықсыздану қосылысымен жұмыс істегенде екі бақылау міндетті. Біріншіден, өлшенген ATP синтезінің қанша бөлігі ATP-синтазаға тәуелді екенін анықтау үшін олигомицинмен сынақ жүргізіңіз. Екіншіден, белгілі мөлшердегі ATP, реагенттердің толық қоспасы және тәжірибеде қолданылған бояғыштың дәл сол концентрациялары бар жасушасыз жүйеде қосылған ATP-нің қалпына табылуын тексеріңіз; кемінде 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM және 2 uM концентрацияларын қамтыңыз. Бояғыш шығарылған жарықты жұтуы, репортерлік ферментті тежеуі немесе реагенттердің тотығу-тотықсыздану химиясын өзгертуі мүмкін. Жалпы люциферазалық талдау нұсқаулығы дәл осындай кедергілер үшін қосымша биохимиялық тексерулерді ұсынады. Жоғары концентрацияларда сөну әдетте күштірек болады екен деп, 1 uM-де артефакт жоқ деп ойламаңыз.

Мембрана потенциалының зондтары ағынды емес, бояғыштың таралуын өлшейді

Сафранин O, TMRM және TMRE, родамин 123 және JC-1 — барлығы мембранадан өте алатын катиондар. Олар электрохимиялық тепе-теңдікке сәйкес теріс зарядталған матриксте жиналады, сондықтан жалпы флуоресценция зондтың қайда орналасқаны арқылы потенциалды жанама түрде көрсетеді. Олардың ешқайсысы ATP-ні немесе электрон ағынын өлшемейді.

Әр зондқа қолайлы препарат түрі бар. Сафранин O оқшауланған митохондриялар мен өткізгіштігі арттырылған жасушаларға сай келеді; әдетте шамамен 2 uM концентрацияда, қоздыру толқын ұзындығы шамамен 495 nm және сәуле шығару толқын ұзындығы шамамен 585 nm болғанда қолданылады. Ол сөну режимінде жұмыс істейді: зондтың сіңірілуі жалпы флуоресценцияны өзгертеді. TMRM және TMRE бүтін жасушаларға төмен наномолярлық жүктеме кезінде, сөнусіз режимде қолайлы. Бұл режимде деполяризация бояғышты босатып, митохондриялық флуоресценция төмендейді; жоғары жүктемеде өздігінен сөну салдарынан сигнал өзгерісінің бағыты кері айналуы мүмкін. JC-1 жасыл сигналдың қызыл сигналға ыңғайлы қатынасын береді, бірақ жүктемеге және митохондриялық массаға тәуелді. Сондықтан сандық жұмыс үшін ол мұқият бақыланатын TMRM-ге қарағанда әлсіздеу. Бұл артықшылықтар мен шектеулер кең қолданылатын митохондрия мембранасы потенциалының зондтарына шолуда жинақталған.

Метилен көгі дәл жұмыс концентрацияларында оптикалық кедергі жасайды. Оның шамамен 600–665 nm аралығындағы жұту жолақтары зондтардың қызыл сәуле шығаруымен қабаттасады, сондықтан ішкі сүзгі әсері, сөну және қоздыру жарығының жұтылуы — бәрі ықтимал. Бояғыштың өзі де екінші липофильді катион болып табылады, оның таралуы өлшенетін потенциалға қарай өзгереді. Мұндай кедергіден қорғану жолы — тәуелсіз өлшеулер мен бос бақылаулар: тек зонд, тек бояғыш, бояғыштың әр концентрациясымен бірге зонд, нөлдік тірек ретінде FCCP арқылы толық деполяризация және, мүмкіндігінше, оптикалық қасиеті өзгеше екінші зонд. III кешенін айналып өту зерттеуі осындай үлгі ұсынған: антимицинмен және миксотиазолмен тежеуден кейін мембрана потенциалының қалпына келуін сафранин O және TMRM арқылы қайталап өлшеп, сапалық тұрғыдан бірдей қалпына келу нәтижесін алған. Бір оптикалық репортер — белгі. Екі тәуелсіз репортер — дәлел.

Үш препарат, үш түрлі сұрақ

Оқшауланған митохондриялар, өткізгіштігі арттырылған жасушалар және бүтін жасушалар бір талдаудың өзара алмастырылатын сезімталдық баптаулары емес. Бұлар — жұмыс қағидалары әртүрлі бөлек ұғымдар.

Оқшауланған митохондрияларда электрон тасымалдау тізбегі, ішкі мембрана және матрикстің молекулалық аппараты сақталады, ал плазмалық мембрана, цитозоль және желілік құрылым алынып тасталады. Мұның мақсаты да осы: субстраттар, ADP, тежегіштер және бояғыш концентрациялары дәл белгіленеді, сондықтан нақты жолды анықтауға болады. Оның есесіне табиғи субстратпен қамтамасыз ету, сигнал беру және энергияға сұраныс жоғалады.

Өткізгіштігі арттырылған жасушаларда митохондриялар жасушалық құрылымның едәуір бөлігі ішінде қалады, ал сырттан берілген субстраттар мен ADP өткізгіш етілген плазмалық мембранадан өтеді. Бұл жасушалық ортада субстраттың тотығу жолындағы ақауды анықтауға қолайлы құрал. Өткізгіштікті шамадан тыс арттыру сыртқы мембрананы зақымдайды, ал цитозольдік реттеу компоненттері шайылып кетеді.

Бүтін жасушаларда бәрі сақталады: плазмалық мембрана тосқауылы, цитозольдік тотықсыздандырғыштар, эндогендік субстрат тасымалы, митохондриялық желі және ATP-ге сұраныс. Олар физиологияға ең жақын, бірақ механизмді ажыратуға ең қолайсыз, өйткені бояғыштың сіңірілуі, тотықсыздануы және оқшау бөліктерде жиналуы оның митохондрияларға нақты әсер ететін мөлшерін қалыптастырады.

TEGDMA зерттеуінде барлық үш деңгей әдейі қолданылған: тотығу мен потенциалдың бояғыш арқылы қалпына келуін зерттеу үшін оқшауланған ми митохондриялары; бұзылысты негізінен I кешенімен байланысты субстрат тотығуына жатқызу үшін өткізгіштігі арттырылған тіс ұлпасының дің жасушалары; ал төмендетілген оттегі тұтынуына 2 uM бояғыштың жалпы физиологиялық әсерін бағалау үшін бүтін дің жасушалары. Әртүрлі препараттардағы митохондриялық көрсеткіштерді салыстыратын оқырмандар үшін метилен көгінің тыныс алу тізбегі бойымен электрондарды қалай тасымалдайтыны туралы қосымша түсіндірме осы жолдардың негізін береді, ал метилен көгіне қатысты тыныс алу зерттеулерін түсіну нұсқаулығы концентрациялар мен тежегіштерді қолдану логикасын қарастырады.

Тотығу-тотықсыздану белсенділігі бар бояғыш қажет ететін бақылаулар

Тотығу-тотықсыздану циклдеріне қатысатын қосылыс кәдімгі тежегішке қарағанда көбірек бақылауды қажет етеді, өйткені тек бояғыштың өзіне тән химиялық реакциялар биологиялық үдерістерге ұқсауы мүмкін.

Респирометрия үшін дрейфті бағалайтын тек буфері бар камераны, биологиялық материалсыз буфер мен бояғышы бар камераны және талдаудағы кез келген жасушадан тыс тотықсыздандырғышпен бірге бояғышты тексеріңіз. Бүтін жасушаларда митохондриялық емес оттегі тұтынуын анықтау үшін соңғы кезеңде ротенон мен антимицин қосыңыз. Тотықсызданған бояғыш электрондарды оттегіге беріп, сутегі пероксидін түзе отырып қайта тотығатынын ескеріңіз. Сондықтан электрон доноры жоқ, тек бояғыш қосылған бос бақылау NADH немесе NADPH пайда болғанда туындайтын жасушасыз оттегі тұтынуын төмен бағалайды.

Сутегі пероксидін өлшеу үшін селективті емес DCFDA бояғыштарының орнына калибрленген Amplex UltraRed пен желкек пероксидазасын таңдаңыз, нәтижені каталазамен тексеріңіз және жарықтандыруға тәуелділікті сынаңыз, өйткені бояғыш фотосенсибилизатор болып табылады. Ми митохондрияларын зерттеу небәрі 100 nM бояғыш кезінде пероксид жүктемесі төрт еседен астам артқанын, ал оның жойылуы баяулағанын анықтаған. Пероксид супероксид аралық өнімінсіз, тікелей тотықсызданған бояғыштан түзілген. Зонд таңдау және жарықтандыруды бақылау туралы мәліметтер бояғыштармен жүргізілетін тәжірибелерде оттегінің белсенді түрлерін өлшеу жөніндегі қосымша мақалада берілген. Ал пероксидтің қай кезде сигнал, қай кезде жүктеме ретінде әрекет ететіні туралы кеңірек мәселе жасушалық тотығу-тотықсыздану теңгерімі және антиоксиданттық қасиеттер туралы тұжырымдар тақырыбымен бірге қарастырылады.

Нақты жол туралы тұжырым жасау үшін III кешеніндегі тежегіштердің екі байланысу орнын да сынаңыз: Qi орнында антимицин A, Qo орнында миксотиазол; бұған қоса, IV кешенінің соңғы кезеңін цианидпен тексеріңіз. Тышқан миына жүргізілген ертеректегі зерттеу бояғыштың ротенонмен тежелген тыныс алуды қалпына келтіргенін, бірақ антимицинмен тежелген тыныс алуды қалпына келтірмегенін хабарлаған. Ал кейінгі үш түрге жүргізілген зерттеу екі тежегішпен де ішінара қалпына келуді және c цитохромының тікелей тотықсыздануына қатысты дәлелдерді тапқан. Айналып өту жолын толық анықталған құбылыс емес, жаңа деректермен үйлесетін мүмкіндік ретінде қарастырыңыз, өйткені бояғыш концентрациясы, тежегіштің байланысу орны, субстраттың күйі және бояғыштың таралуы байқалатын жолды өзгертеді.

Талдау әдісін таңдау матрицасы

Бұл кестені сұрақты өлшеуге бейімдеу үшін емес, сұраққа сәйкес өлшеуді таңдау үшін пайдаланыңыз.

Сенімді тұжырым жасауға жеткілікті ең аз деректер үшін бояғыштың бірдей концентрацияларын — 100 nM, 300 nM, 1 uM және 2 uM — барлық өлшеуде қолданыңыз: протондардың ағып кетуі, ADP, олигомицин және ажыратқыш жағдайларындағы оттегі ағыны; ATP синтезінің жылдамдығы; мүмкіндігінше екі зондпен мембрана потенциалы; каталаза және жасушасыз бақылаулармен пероксидтің калибрленген бөлінуі. Өзара байланысты көрсеткіштер жиынтығын беріңіз: оттегі ағыны, ATP түзілу жылдамдығы, ATP-нің оттегіге қатынасы, потенциал және пероксид. Осы сандардың кез келгені жеке алғанда — мағынасын әлі табуды қажет ететін өлшем ғана.