Метилен көгімен қарапайым бояу және Грам әдісімен бояу: әр әдіс нені дәлелдей алады

Студент E. coli деп белгіленген өсіндіден жағынды дайындап, оны бір минутқа метилен көгімен толық жабады, шаяды да, иммерсиялық объектив арқылы қарайды. Көру өрісі көк таяқшаларға толы. Зертханалық есепте: «E. coli ретінде анықталған грам-теріс таяқшалар» деп жазылған. Бақылау дұрыс. Бірақ бұл препарат ондай қорытындыға негіз бермейді.

Қате техникада емес, ұғымдарды түсінуде. Студент қарапайым бояуды дифференциалды сынақ ретінде қабылдаған. Қарапайым бояу мен Грам әдісімен бояу әртүрлі сұрақтарға жауап береді, өйткені олардың бояу қағидалары бөлек. Біріншісі: қандай пішін бар деген сұраққа жауап береді. Екіншісі: сынақ әсеріне жасуша қабырғасы қалай жауап береді деген сұраққа жауап береді. Екеуін шатастырсаңыз, дұрыс боялған препараттың өзі негізсіз есепке әкеледі.

Бұл салыстыру екі әдісті бір-бірінен ажыратып, әр нәтиже қандай тұжырым жасауға негіз беретінін көрсетеді және студенттер жиі қоятын екі сұраққа жауап береді: метилен көгін Грам әдісімен бояуда қолдануға бола ма және E. coli-ді метилен көгімен бояу нақты нені көрсетеді.

Қысқаша жауап

Метилен көгімен қарапайым бояу боялатын барлық жасушаны бірдей көк түске бояйды, сондықтан ол морфологияны (таяқшалар, шарлар, спиральдар) және орналасуды (жеке, жұп, тізбек түрінде) көрсетеді, бірақ Грам санаты туралы ештеңе айтпайды. Грам әдісімен бояуда йод, түссіздендіру кезеңі және қосымша бояғыш қосылады, сондықтан бактериялар қабықшаларының бояғышты қалай ұстап қалатынына қарай грам-оң (күлгін) және грам-теріс (қызғылт немесе қызыл) болып ажыратылады. Метилен көгінен кейінгі көк таяқшалар «таяқша пішінді жасушалар бар» дегенді білдіреді. Грам әдісінің толық тізбегінен кейінгі қызғылт таяқшалар «грам-теріс таяқшалар бар» дегенді білдіреді. Екінші тұжырымның негізі күштірек, өйткені рәсімде қосымша сынақ орындалған.

Осы мақала жататын бактерияларды бір бояғышпен бояу әдістерінің кеңірек тобы туралы микроскопиялық бояу атласынан қараңыз.

Қарапайым бояу: бір бояғыш, бір сұрақ

Метилен көгі — негіздік (катиондық) бояғыш. Оның боялған ионы оң зарядқа ие және жасушадағы теріс зарядталған құрылымдармен, соның ішінде нуклеин қышқылдарымен және беткі қышқылдық топтармен байланысады, сондықтан жасушалар ашық түсті фонда көк болып көрінеді. OpenStax бояуға арналған тарауында осы оң бояу қағидасын сипаттайды. Бояғыш катионының өзі — метилен көгінің химиясы жөніндегі анықтамалықта егжей-тегжейлі сипатталған шағын, жазық фенотиазин ионы; хлорид қарсы ионы бояу қызметін атқармайды.

Стандартты оқу хаттамасы әдейі қарапайым жасалған: жұқа жағынды дайындау, ауада кептіру, қыздырып бекіту, шамамен 1% сулы метилен көгі ерітіндісімен шамамен бір минутқа толық жабу, сумен абайлап шаю, сорғыш қағазбен құрғату және майлы иммерсиямен қарау. LibreTexts оқу хаттамасында дәл осы 1% ерітіндімен бір минут бояу нұсқасы берілген, сонымен бірге кейбір зертханалар уақытты ұзартатыны атап өтіледі. Бекіткіш реагент те, түссіздендіргіш те, екінші бояғыш та жоқ. Әдістің мәні де осы. Бір ғана бояғыш қолданылып, оны таңдамалы түрде кетіру болмаса, бояғышпен байланысқан әрбір жасуша бір түсті болады.

E. coli жағдайында күтілетін көрініс — жеке, жұптасқан немесе шағын топтарға жиналған көк таяқшалар (бациллалар). Көк түс бояғыштан келеді. Таяқша пішіні микроорганизмге тән. Бірақ осы екеуінің үйлесімі микроорганизмді анықтамайды, өйткені көптеген түрлер таяқша пішінді және қарапайым бояуда көптеген таяқшалар көк түске боялады. ATCC өзінің микробиологиялық өсінділер жөніндегі нұсқаулығында нәтиженің тек морфологиямен шектелетінін нақты көрсетеді. Дұрыс есепте: «Көк бациллалар байқалды» деп жазылады. Пішін мен орналасудан тыс кез келген тұжырымға қосымша дәлел қажет.

Грам әдісімен бояу: төрт реагент, әрекетті бағалайтын бір сынақ

Грам әдісімен бояу — дифференциалды бояу. Ол барлық жасушаға бірдей әрекеттер тізбегін қолданып, қай жасушалар алғашқы бояғышты сақтап қалатынын, ал қайсысы оны жоғалтатынын анықтайды. Америкалық микробиология қоғамының Грам әдісімен бояу хаттамалары стандартты төрт кезеңнің ретін белгілейді: кристалды күлгін (негізгі бояғыш), Грам йоды (бекіткіш реагент), спирт немесе ацетон-спирт қоспасы (түссіздендіргіш), содан кейін сафранин (қосымша бояғыш).

Стандартты оқу моделі бұл айырмашылықты жасуша қабықшасының құрылымы арқылы түсіндіреді. Грам-оң жасушалардың пептидогликан қабырғасы қалың болады; ол спиртпен шаю кезінде сусызданып, кристалды күлгін–йод кешенін ұстап қалады. Грам-теріс жасушаларда жұқа пептидогликан қабаты және липидтерге бай сыртқы мембрана бар; түссіздендіргіш бұл мембрананы бұзады, сондықтан кешен шайылып кетеді де, жасушалар кейін сафранинді сіңіреді. NCBI Bookshelf-тегі Грам әдісімен бояу шолуында жасуша қабырғасына негізделген осы түсіндірме берілген. Мамандар толық физикалық-химиялық механизм тек қабырға қалыңдығына қарағанда күрделірек екенін қосады, бірақ зертханада нәтижені түсіндіру үшін осы әрекет ережесі жарамды: күлгін түс бояғыштың сақталғанын, ал қызғылт түс оның жоғалып, кейін қосымша бояғышпен боялғанын білдіреді.

Иллюстрациялық панельдер. Әдістерді салыстыруға арналған стильденген суреттер, камерамен түсірілген микрофотографиялар емес. Логиканы түсіндіру үшін түстер жеңілдетілген: қарапайым бояуда бір түс, Грам әдісімен түссіздендіргеннен кейін екі түс.

Метилен көгін Грам әдісімен бояуда қолдануға бола ма

Бұл сұрақты екі түрлі түсінуге болады және оларға әртүрлі жауап қажет.

Бірінші мағынасы: метилен көгімен бір рет толық жабу Грам әдісінің бүкіл тізбегін алмастыра ала ма. Жоқ. Йод, түссіздендіргіш және қосымша бояғыш болмаса, дифференциалды кезең де болмайды, демек Грам санаты тексерілмейді. Тек метилен көгін қолданғаннан кейінгі көк өріс — құты Грам реагенттерінің жанында тұрса да, қарапайым бояудың нәтижесі. Оны Грам әдісімен бояу нәтижесі ретінде тіркемеңіз.

Екінші мағынасы: метилен көгі 4-кезеңде қосымша бояғыш ретінде сафранинді алмастыра ала ма. Қызметі тұрғысынан ол түссізденген жасушаларды бояй алады, ал оқулықтағы жаттығу мұндай ауыстырудан кейін грам-оң жасушалар күлгін, грам-теріс жасушалар көк болады деп болжайды. Бұл қисынды, өйткені дұрыс түссіздендірілген грам-теріс жасушалар дерлік түссіз болады және басқа катиондық бояғышты сіңіреді. Бірақ бұл стандартты хаттама емес. ASM хаттамаларында сафранин көрсетілген; кейбір нұсқаларда негіздік фуксин сияқты мойындалған баламалар бар, бірақ метилен көгі емес. Практикалық кемшілігі де бар: көк пен күлгінді ажырату қызғылт пен күлгінді ажыратудан қиынырақ, әсіресе жаңадан үйренушілер үшін және микроскоп шамының жарығы әлсірегенде. Оқу жұмыстары үшін де, нәтижесі маңызды кез келген жұмыс үшін де хаттамаңызда көрсетілген қосымша бояғышты, әдетте сафранинді қолданыңыз; метилен көгін қосымша бояғыш ретінде қолдануды стандартқа тең нұсқа емес, демонстрациялық нұсқа деп қарастырыңыз.

Метилен көгінің басқа бір бояғышты нұсқалармен салыстырылуы туралы сабақтас сұрақ бактерияларды қарапайым бояу әдістерін салыстыруда қарастырылған.

E. coli-ді метилен көгімен бояу нені дәлелдейді және нені дәлелдемейді

E. coli — грам-теріс таяқша, бірақ бұл сөйлем бірнеше әдістен алынған деректерді біріктіреді: морфология микроскопиядан, Грам реакциясы Грам әдісімен бояудан, ал түрді анықтау өсіру мен биохимиялық немесе молекулалық зерттеуден алынады. Метилен көгімен боялған жағынды тек бірінші бөлігіне үлес қосады. Ол боялған үлгіде таяқша пішінді жасушалардың бар екенін және олардың қалай орналасқанын анықтайды. Ол Грам реакциясын анықтамайды, өйткені түссіздендіру сынағы жүргізілмеген. Ол түрді де анықтамайды, өйткені мұндай ажырату қабілетінде көптеген түрлердің таяқшалары бір-біріне ұқсайды.

Есептердегі қате дәл осы тұста болжамды түрде пайда болады. Автор бастапқы білімді («бұл өсінді E. coli болуы тиіс, ал E. coli грам-теріс») бақылау жолына енгізеді, сондықтан препарат шын мәнінде алдын ала болжанған нәрсені растағандай көрінеді. Нақтырақ есеп бұл деңгейлерді бөледі: «Метилен көгімен қарапайым бояу: көк бациллалар байқалды; тек морфология, Грам санаты тексерілген жоқ». Содан кейін, егер Грам әдісімен бояу бақылау үлгілерімен дұрыс орындалса: «Грам әдісімен бояу: қызғылт таяқшалар, грам-теріс нәтижеге сәйкес келеді». Түрдің сәйкестігі кейінірек, тек түске қарап емес, анықтау жұмыс үдерісінен белгілі болады.

Нәтижені түсіндіруге арналған практикалық нұсқаулық

Зертханалық жұмыс кезінде мына шешім ережесін қолданыңыз. Егер барлық жасуша бір түсті болса және хаттамада түссіздендіргішсіз бір бояғыш қолданылса, сіз қарапайым бояу жасадыңыз. Пішінді, шамамен өлшемін және орналасуын жазыңыз. Осымен шектеліңіз. Егер хаттамада нәтижесі белгілі оң және теріс бақылау үлгілерімен бірге кристалды күлгін, йод, түссіздендіргіш және қосымша бояғыш қолданылса, сіз Грам әдісімен бояу жасадыңыз. Түс пен морфологияны бірге жазыңыз: тізбектелген күлгін кокктар, қызғылт таяқшалар және т.б.

Түсінбеушіліктің көбіне үш қате себеп болады. Біріншісі — көк таяқшаларды E. coli екенін растайтын белгі деп артық түсіндіру. Екіншісі — метилен көгімен боялған препаратты дәптерде «Грам әдісімен бояу» тақырыбының астына тіркеу; кейін оны оқығандар қате түсінеді. Үшіншісі — қосымша бояғыштарды ойланбастан ауыстырып, кейін әр зертханадағы түстерді түстер жиынтығы бірдей сияқты салыстыру. Үшеуінің де шешімі бірдей: нақты орындалған әдісті атаңыз және тек сол әдіс тексеретін нәрсе туралы ғана тұжырым жасаңыз.

Қарапайым бояудың құндылығы дәл оның тұжырымдары шектеулі болуында. Ол жылдам, ұсақ қателіктерге төзімді және сұрақ морфология туралы болса жеткілікті: бірдеңе бар ма және оның пішіні қандай. Сұрақ жіктеу туралы болса, дифференциалды сынақ жүргізіңіз. Көк препарат жасушалардың қалай көрінетінін көрсетеді. Күлгін немесе қызғылт препарат олардың қабырғаларының қалай әрекет ететінін көрсетеді. Екі препараттың ешқайсысы жеке өзі түрді анықтамайды.