Метилен көгі тәжірибелерінде оттегінің реактивті түрлерін өлшеу

Екі зертхана өздері метилен көгінің антиоксиданттық әсерін зерттейтін тәжірибе деп атаған жұмысты жүргізеді. Бірі бояғыш оттегінің реактивті түрлерін азайтатынын хабарлайды. Екіншісі оларды түзетінін хабарлайды. Екеуі де дозаға тәуелділіктің айқын қисықтарын көрсетеді. Екеуі де шынайы нәтижелерін ұсынады. Айырмашылық алаяқтықта немесе біліксіздікте емес. Екі топ әртүрлі жарық жағдайында, әртүрлі сұрақтарға жауап беретін зондтармен әртүрлі құбылыстарды өлшеген, кейін екі нәтижені де бір сөзбен атаған: ROS.

Метилен көгін дәл өлшеу қиын, өйткені бұл молекула өзі бақылауға тиіс химиялық үдерістерге қатысады. Қараңғыда ол электрондарды донорлар мен акцепторлар арасында тасымалдап, бастапқы күйіне оралады да, циклді қайта бастауға дайын болады. Жарықта ол фотосенсибилизаторға айналып, қозған триплет күйге өтеді. Осы күйден оттегіне энергия беріп, синглетті оттегін түзе алады немесе электрондарды тасымалдап, радикалдар мен сутек пероксидін түзе алады. Мұндай жүйеге енгізілген кез келген зондты бояғыштың өзі тотықтыруы, тотықсыздандыруы, түссіздендіруі немесе оның оптикалық сигналын бүркемелеуі мүмкін. Сондықтан кез келген ROS көрсеткішіне қатысты алғашқы сұрақ ешқашан санның қанша болғаны емес. Алдымен талдау әдісі нақты нені анықтайтынын және бояғыштың сол әдіске қалай әсер ететінін сұрау керек.

Amplex Red: калибрленген сутек пероксиді талдауы

Дұрыс ұйымдастырылған жағдайда метилен көгі мен Amplex Red үйлесімі осы саладағы әдебиетте ең негізді жұп болып саналады. Оның химиясы нақты: желкек пероксидазасы сутек пероксидін пайдаланып, Amplex субстратын флуоресцентті өнім — резоруфинге тотықтырады; стехиометриялық қатынасы шамамен бірге бір. Үлгідегі пероксид детекторда флуоресценцияға айналады. ROS тобының дәстүрлі өкілдерінің ешқайсысы бұл реакцияны тікелей жүргізбейді.

Шешуші артықшылығы — калибрлеу. Мұқият зерттеуші концентрациясы белгілі пероксид стандарттарын сол буферде, пероксидаза мен субстраттың бірдей концентрацияларымен, бірдей инкубация уақытында және бірдей оптикалық баптаулармен өлшейді, содан кейін үлгілерді сол қисықпен салыстырады. Осы әдіске негіз болған оқшауланған ми митохондрияларын зерттеуде авторлар дәл осылай істеген: әр өлшеу соңында пероксидтің белгілі мөлшерін қосқан. Нәтижелер шартты флуоресценция бірліктерімен емес, ақуыздың бір миллиграмына шаққандағы минутына пикомоль түріндегі жылдамдықтармен берілген. Жарқырауды нақты өлшемге айналдыратын — осы.

Сол зерттеудің үш ерекшелігін үлгі етуге болады. Біріншіден, авторлар сигналды пероксидті ыдырататын каталаза арқылы тексерген. Каталаза қосылғанда метилен көгі туғызған флуоресценция өсімі тоқтаған. Бұл сигналдың оптикалық артефакт емес, пероксидтен туындағанын растаған. Екіншіден, олар қоздыру сәулесін жапқышпен шектеп, үлгілерге әдеттегі жарық дозасының сегізден бірін ғана түсіру арқылы жарықтандыру әсерін тікелей тексерген; сигнал небәрі тоғыз пайызға төмендеген. Олар тіркеген пероксидтің тоқсан пайыздан астамы өлшеу жарығына тәуелсіз болған. Үшіншіден, олар пероксидтің жойылуын электродпен бөлек өлшеп, бояғыш оның түзілуін арттырып қана қоймай, жойылуын да баяулататынын анықтаған. Тек қорытынды флуоресценцияны көрсететін зонд осы екі әсерді бір-бірінен ажыратпай біріктірер еді.

Бұл талдау әдісінде әлі де қателік туғызатын жағдайлар бар, ал метилен көгі олардың бірнешеуін іске қосады. Бояғыш резоруфин сәуле шығаратын қызыл спектр аймағында кеңінен жұтады. Сондықтан бояғыш концентрациясы жоғары болғанда үлгі ішкі сүзгі әсерлері арқылы өз сигналын бүркемелеуі мүмкін. Демек, стандарттардағы бояғыш концентрациясы үлгілердегідей болуы керек. Amplex Red өздігінен фотототыға алады, ал оның өнімі резоруфин супероксид пен пероксид түзетін фотототығу-тотықсыздану цикліне қатыса алады. Тәжірибеде фотосенсибилизатор да жарықтандырылса, бұл аса маңызды. Іс жүзіндегі шешім — бояғыш пен зондты бірге жарықтандырмай, алдымен метилен көгі бар үлгілерді сәулелендіріп, содан кейін олардың аликвоталарын Amplex реагенттерімен қараңғыда талдау. Соңында, супероксиддисмутаза Amplex сигналын жай ғана баспайды: супероксидті пероксидке айналдыру сигналды арттыруы мүмкін. Флуоресценцияны арттырған SOD бақылауы сәтсіз болған жоқ. Ол супероксидтің реакциялар тізбегінің алдыңғы сатысына қатысатынын анықтады.

DCFDA: бейспецификалық тотығу индикаторы

Метилен көгі мен DCFDA үйлесімі шатасудың басым бөлігінің көзі болып табылады. DCFH-DA — жасушаға енгізілетін прекурсор. Жасуша ішіндегі эстеразалар оның ацетат топтарын ажыратып, флуоресценция бермейтін DCFH қалдырады, ал DCFH тотыққанда флуоресцентті DCF түзіледі. Оны тотықтыратын заттар тізімі ұзақ: гидроксил радикалдары, пероксидаза мен гемнің аралық өнімдері, азот диоксиді, гипохлорлы қышқыл және пероксинитриттен туындайтын радикалдар. Сутек пероксиді өздігінен оны тәжірибеде мәні бар жылдамдықпен тікелей тотықтырмайды; пероксидке тәуелді флуоресценция үшін әдетте реакциялар тізбегінде темір, гем ақуыздары немесе пероксидазалық химия қажет.

Әрбір әдістер бөлімінде сілтеме берілуі тиіс сын Kalyanaraman мен әріптестерінің DCFH-ты зонд ретінде талдауынан бастау алады. Осы себеппен DCFDA-дан бас тартқан ми митохондриялары зерттеуінде қорытындыланғандай, олар зондтың баяу, сипатталмаған стехиометриямен, жарамды калибрлеусіз және ROS тобына жатпайтын қосылыстармен де әрекеттесетінін көрсеткен. Зонд өзі өлшейтін құбылысты күшейтеді де: DCFH-тың бір электрондық тотығуы DCF радикалын түзеді; ол оттегімен әрекеттесіп, супероксид түзеді, ал супероксид дисмутацияланып, қосымша пероксидке айналады. Өлшеудің өзі тіркеп отырған химиялық үдерісті ішінара туғызады.

Мұның ешқайсысы DCFDA-ны пайдасыз етпейді. Бұл оны заттың түрін анықтау құралы емес, скрининг құралы етеді. DCF флуоресценциясының өсуі тотықтырғыштарға тәуелді зонд тотығуының артқанын білдіреді. Бұл пероксидтің артқанын білдірмейді және жалпы ROS мөлшері артты дегенді де мүлде білдірмейді: мұндай шаманы бір ғана зонд өлшей алмайды. Метилен көгі бойынша бұрынғы жұмыстарда бір микромолярдан жоғары концентрацияларда DCF тотығуына сүйеніп, прооксиданттық әсерлер туралы хабарланған. Ал сол кезеңдегі басқа жүйелерде пероксид туғызған жасуша өлімінен қорғаныс байқалған. Бір бояғыш әртүрлі тотығу-тотықсыздану жағдайларында осы екі нәтижені де бере алады, ал DCF нәтижесі жалғыз өзі сигналды қай тотықтырғыш туғызғанын айта алмайды. Бұрынғы ми митохондриялары жұмысының маңызы — ол осы скринингті калибрленген пероксид өлшеуімен алмастырып, жүктемені тікелей анықтады: тіпті жүз наномоляр бояғыш сыналған әрбір субстрат пен тыныс алу күйінде пероксидтің бөлінуін бірнеше есе арттырған.

DCFDA-да метилен көгіне тән тағы бір тұзақ бар. Бояғыштың түсі қанық әрі ол тотығу-тотықсыздануға белсенді қатысады. Сондықтан ол флуоресцентті өнімді түссіздендіруі, сәуле шығаруды сөндіруі немесе жасушалық ROS-қа тәуелсіз зондты тотықтыруы мүмкін. Бояғыш пен зонд бар, бірақ жасушалар жоқ жасушасыз бақылау — жай қосымша емес. Бұл бояғыштың зондпен әрекеттесетін-әрекеттеспейтінін көрсететін тәжірибе.

Спиндік ұстау және оттегінің сіңірілуі: түрін анықтау және ағын

Флуоресцентті зондтар тотыға алатын бір нәрсе пайда болғанын көрсетсе, спиндік ұстағыштары бар электрондық спиндік резонанс оның не болғанын дәлірек көрсетеді. Метилен көгінің фотохимиясы жөніндегі классикалық зерттеуде бояғыш, аскорбат және жарық әсерінен түзілген аскорбат радикалын анықтау үшін ESR қолданылған. Кейін оттегінің сіңірілуі тәжірибелерінде пероксидтің түзілуі, ал спиндік ұстау тәжірибелерінде темір катализдейтін гидроксил радикалының түзілуі көрсетілген. Әр әдіс басқалары жауап бере алмайтын сұраққа жауап берген: ESR радикалдың түрін анықтаған, оттегінің сіңірілуі кез келген флуоресцентті зондтан тәуелсіз реакция ағынын көрсеткен, ал олардың үйлесімі бір жарықтандырылған жүйеде синглетті оттегі жолы да, радикалдық жолдар да жұмыс істейтінін көрсеткен.

1984 жылғы бұл нәтиже әлі де ескерту ретінде оқылады. Жарық пен тотықсыздандырғыш болғанда бояғыш пероксид түзген, ал темір болғанда жүйе осы топтағы ең реактивті түр — гидроксил радикалын түзген. Авторлар мұны көздегі аскорбатпен байланыстырып, офтальмологияда бейқам қолдануға күмән келтірген. Қазіргі оқырман жағдайларға назар аударуы керек: жарық, тотықсыздандырғыш және темір. Осылардың кез келген бірін алып тастаса, бұл жол әлсірейді немесе жойылады.

Оттегі электродтарының құндылығы басқа. Кларк типті электрод оттегінің таза тұтынылуын өлшейді. Бұл бояғыш қозғаған тотығу-тотықсыздану химиясының молекулалық оттегін тұтынатынын дәлелдеп, ешбір флуоресценциялық артефакт жалған көрсете алмайтын кинетиканы береді. Бірақ ол өнімнің түрін анықтамайды. Пероксид, супероксид және судың түзілуі, сондай-ақ синглетті оттегінің ыдырауы — бәрі де оттегін тұтынады. Өнімнің түрінсіз ағын туралы мәлімет те, ағынсыз өнімнің түрі туралы мәлімет те толық емес. Сондықтан сапалы жұмыстар электродты калибрленген пероксид талдауымен немесе ұстағышпен бірге қолданады.

Антиоксиданттық нәтижелер неліктен қайшы келеді

Үш өлшеу тәсілін қатар қойсақ, метилен көгі туралы әдебиеттегі көрінетін қайшылықтар әдістердің айырмашылығы мен үш биологиялық дерекке келіп тіреледі.

Біріншіден, бояғыш әрі электрон тасымалдаушы, әрі пероксид көзі болып табылады. Оттегі супероксидке айналуы мүмкін тыныс алу тізбегінің учаскелерінен электрондарды басқа жаққа бағыттау арқылы ол бір ROS түрін азайта алады. Ал оның тотықсызданған түрі оттегін тікелей пероксидке дейін тотықсыздандырып, басқа ROS түрін арттырады. Сондықтан митохондриялық тотығу-тотықсыздану химиясын және метилен көгінің айналма жолдағы рөлін зерттейтін зертхана зондқа тәуелді нәтижелер күтуі керек: бір кюветада супероксидке сезімтал көрсеткіш төмендеп, пероксид көрсеткіші артуы мүмкін.

Екіншіден, төмен дозалардағы пероксид тек зақым көзі емес, сигнал да болып табылады. Алдыңғы жұмысты жалғастырған тышқан миының митохондрияларын зерттеу небәрі елу наномоляр бояғыштан пероксид түзілетінін, бірақ терапиялық деңгейлерде митохондриялық ДНҚ зақымдары болмайтынын анықтаған. Алдын ала әсер еткізгеннен кейін ротенон туғызатын зақымдардан қорғаныс байқалған. Тек терапиялық ауқымнан әлдеқайда жоғары жүз микромоляр концентрацияда бояғыш жекелеген ДНҚ фрагменттерін зақымдаған. Ал қызыл жарық пен жиырма микромоляр бояғыш синглетті оттегін түзіп, сыналған барлық фрагменттерді зақымдаған. Ұсынылған механизм — гормезистік: пероксидтің аздап түзілуі Nrf2-мен байланысты антиоксиданттық қорғанысты және митохондриялық биогенезді іске қосады. Сондықтан қысқа мерзімді прооксиданттық көрсеткіш ұзақ мерзімді антиоксиданттық нәтижеден бұрын байқалады. Бір сағаттан кейін және бір күннен кейін өлшенген талдау нәтижелері бір-біріне қайшы келуі мүмкін, өйткені осы аралықта биологиялық жағдай өзгерген.

Үшіншіден, жарық жүйеде қай молекуланың болатынын да анықтайды. Жарықтандыру бояғышты деметилдеп, Azure B және оған ұқсас өнімдерге айналдырады; ыдыстың үстіндегі микроскоп шамының өзі оны фотосенсибилизациялауға жеткілікті. Қараңғыда және жарықта жүргізілген тәжірибелер — әртүрлі тәжірибелер. Кез келген хаттаманың жарықтандыру мен бояғышпен жұмыс істеуді бақылау бөлімі оларды солай қарастыруы керек.

Ең аз қажетті бақылаулар жиынтығы және кез келген тұжырымды қалай түсіндіру керек

Төмендегі салыстыру — осы мақалаға арнайы әзірленген анықтамалық материал. Метилен көгіне қатысты кез келген ROS нәтижесін қабылдамас бұрын, авторлардың қай жолдағы бақылауды орындағанын және қайсысын өткізіп жібергенін тексеріңіз.

Осыдан нәтижелерді түсіндірудің практикалық ережесі шығады. Пероксидазамен қолданылған, калибрленген және каталаза арқылы тексерілген Amplex — пероксид туралы дәлел. DCFDA — зондтың бейспецификалық тотығуы туралы ғана дәлел. Радикалдарды бейтараптандыратын заттармен бақылау жүргізілген спиндік ұстау — радикалдың түрі туралы дәлел. Оттегінің сіңірілуі — ағын туралы дәлел. Қаншалықты сенімді жазылса да, талдау әдісі негіздей алатыннан артық тұжырым жасайтын сөйлем бояғыш туралы емес, зонд туралы сөйлем болып қалады. Дозаға тәуелділік пен гормезистік ауқым, митохондриядағы электрон ағыны, боялған үлгілердегі талдауға кедергілер және микроскопиялық жарықтандыру артефакттары туралы байланысты талқылаулар осы тармақтардың әрқайсысын толықтырады. Уақытша сілтемелер нақты сілтемелермен алмастырылғаннан кейін де олардың әрқайсысы өз күшінде қалады.