Метилен көгі, Nrf2 және митохондриялық биогенез туралы түсіндірме

Метилен көгі туралы мәтіндерде бір сөйлем жиі кездеседі: ол Nrf2-ні белсендіреді және жаңа митохондриялар түзеді. Бұл сөйлем бір тұжырым сияқты оқылады, бірақ онда әртүрлі жүйелерде, әртүрлі дәлелдер арқылы зерттелген екі бөлек ұғым бар. Біріншісі — қорғаныс гендерін іске қосатын сенсордан тұратын сигналдық жол. Екіншісі — жасушаның митохондриялық аппаратын көбейтетін құрылыс бағдарламасы. Сигнал құрылысты бастай алады, бірақ сигналдың іске қосылғанын көрсету ғимараттың салынғанын көрсетумен бірдей емес; ал құрылыс материалының көбейгенін көрсету энергиямен қамтамасыз етудің жақсарғанын көрсетумен бірдей емес. Бұл мақала осы үш нәрсені бір-бірінен ажыратады.

Nrf2 ұғымы: қалқан емес, сенсор

Nrf2 (эритроидтық 2 факторымен байланысты ядролық фактор 2) — транскрипция факторы, яғни міндеті гендерді іске қосу болып табылатын ақуыз. Тыныштық жағдайында оны Keap1 деп аталатын сенсорлық ақуыз цитоплазмада ұстап тұрады және үздіксіз ыдырату үшін жасушаның жою аппаратына беріп отырады. Тотықтырғыштар немесе электрофилдер Keap1 құрамындағы реакцияға қабілетті цистеиндерді өзгерткенде, бұл жою тоқтайды. Жаңадан түзілген Nrf2 жиналып, ядроға өтеді, шағын Maf ақуыздарымен жұптасады және антиоксиданттық жауап элементтері деп аталатын ДНҚ тізбектеріне байланысады. Осы байланысу қорғаныс гендерінің тұтас тобын іске қосады.

Бұл жолдың канондық көрсеткіштері нақты. NQO1 (NAD(P)H хинон дегидрогеназасы 1) және TrxR1 (тиоредоксинредуктаза 1) — Nrf2-нің ең сенімді нысана-гендерінің қатарында. HO-1 (гемоксигеназа-1) күшті индукцияланады, бірақ басқа реттеушілерге де жауап береді. SOD және каталаза сияқты ферменттер антиоксиданттық аппаратқа жатады, алайда олардың деңгейін көптеген транскрипция факторлары басқарады. Сондықтан SOD деңгейінің жоғарылауы өздігінен оған Nrf2 себеп болғанын дәлелдемейді. Сигналдық оқиғаға ең жақын дәлелдер — Nrf2-нің ядрода жиналуы, ARE репортерінің белсендірілуі немесе Nrf2 жойылғанда жоғалатын канондық нысаналардың индукциясы. Қалғанының бәрі — тотықтырғыштар деңгейінің төмендеуі, стресс жағдайында тірі қалудың жақсаруы, глутатионның көбеюі — көптеген жолдар тудыра алатын кейінгі әсерлер.

Осы тақырыптағы метилен көгіне қатысты ең алғашқы нәтиже сол шкаланың сигналға жақын бөлігіне сәйкес келеді. Наномолярлық концентрациядағы метилен көгі әсер еткен фибробласттарда жасушалық қартаю баяулап, IV кешеннің мөлшері мен оттегіні тұтыну жоғарылаған және 2-фаза ферменттері TrxR1 мен NQO1 индукцияланған. Бұл метилен көгін митохондриялар жұмысының жақсаруымен және жасушалық қартаюдың баяулауымен алғаш байланыстырған зерттеуде баяндалған. TrxR1 мен NQO1 — мұқият оқырман іздейтін Nrf2-нің дәл сол канондық нысаналары. Бірақ зерттеу сигналдық оқиғаның өзін көрсетпеді: ядродағы Nrf2 өлшенбеді, ARE репортері қолданылмады, Nrf2 нокауты бар бақылау болмады. Сондықтан негізді қорытынды мынадай: осы жүйеде метилен көгі Nrf2-нің белгілі нысана-гендерін индукциялайды. Бұл Nrf2 белсендірілуіне сәйкес келеді, бірақ Nrf2-ні жеке себеп ретінде айқындамайды. Нысана-геннің индукциясы — қосқыш іске қосылғаннан кейінгі бір қадам.

Биогенез ұғымы: үш бақылау нүктесі бар бағдарлама

Митохондриялық биогенез — жасушаның митохондриялық қуатын арттыратын бағдарлама. Оқулықтағы иерархиясы үш бақылау нүктесінен өтеді. Біріншіден, PGC-1alpha коактиваторы бағдарламаны іске қосады. Екіншіден, ядролық транскрипция факторлары митохондриялық гендердің, соның ішінде митохондриялық ДНҚ-ны сақтайтын және репликациялайтын TFAM генінің экспрессиясын күшейтеді. Атауы шатастыруы мүмкін: осы факторлардың бірі NRF1, яғни ядролық тыныс алу факторы 1 деп аталады, бірақ ол Nrf2-ден бөлек ақуыз. Үшіншіден, нәтижесінде жасушада митохондриялық геномдар мен тыныс алу аппараты көбейеді; мұны mtDNA көшірмелерінің саны, цитратсинтаза белсенділігі немесе тыныс алу кешендерінің мөлшері мен белсенділігі арқылы өлшеуге болады.

Әр бақылау нүктесіндегі тұжырым алдыңғысымен салыстырғанда әлсіздеу не күштірек болады. PGC-1alpha немесе TFAM ақпараттық РНҚсының жоғарылауы бағдарламаның іске қосылуына сұраныс болғанын көрсетеді, бірақ оның аяқталғанын көрсетпейді. mtDNA немесе IV кешен ақуызының көбеюі материалдың артқанын көрсетеді, алайда қайта құрылымдалған митохондрияларда да осындай көрініс болуы мүмкін. Тыныс алудың жақсаруы, оттегіні тұтынудың немесе кешен белсенділігінің жоғарылауы қызметтің өзгергенін көрсетеді, бірақ қызмет бірде-бір жаңа митохондрия түзілмей-ақ жақсаруы мүмкін. Биогенез туралы сенімді тұжырым үшеуін де біріктіреді: реттеуші, мөлшер және қызмет.

Фибробласттарға жүргізілген кейінгі зерттеу осы тізбектің көп бөлігін қамтыды. 100 наномолярлық метилен көгімен өңделген адамның IMR90 жасушаларында NAD пен NADH арақатынасы 15 минут ішінде уақытша жоғарылап, бір тәулік ішінде бастапқы деңгейіне оралды. Бұл уақытша энергетикалық сигналдан кейін энергия сенсоры AMPK уақытша фосфорланды, содан соң PGC-1alpha және жұмыс істейтін IV кешенді құрастыруға қажет SURF1 ақуызы индукцияланды. IV кешеннің белсенділігі шамамен екі есе артты, жасушалық тотықтырғыштар шамамен 28 пайызға азайды, ал теломерлер баяуырақ қысқарды. Толық реттілік метилен көгінің тотығу-тотықсыздану белсенділігін AMPK және митохондриялық биогенезбен байланыстыратын мақалада берілген.

Бұл мақаладағы екі жайтқа назар аудару керек, өйткені мұндай егжей-тегжейлер көбіне түсіп қалады. Біріншіден, белсендірудің болғанынан гөрі оның сипаты маңыздырақ болды: метилен көгі AMPK-ны уақытша іске қосты, ал салыстыру препараты AICAR оны созылмалы түрде іске қосты. Уақытша белсендіргіш жасушалық қартаюды шамамен сегіз есе тиімдірек баяулатты. Сондықтан «метилен көгі AMPK-ны белсендіреді» деген тұжырым толық емес; маңызды тұжырым — оның AMPK-ны уақытша белсендіретіні, ал салыстыру созылмалы белсендірудің дәл сондай нәтиже бермейтінін меңзейді. Екіншіден, метилен көгі жасушалық циклді өзгертпеді. Бұл ең қарапайым балама түсіндірмені — жасушалар жай ғана баяуырақ бөлініп, соның арқасында жас көрінді деген болжамды — жоққа шығарады.

Тышқандардағы зерттеу тармағы: мінез-құлық, геномдар және әдейі парадоксты қозғаушы сигнал

Орта жастағы тышқандарды зерттеген топ жасуша өсінділеріндегі жұмысты жануарларға жалғастырды. Метилен көгін ауыз арқылы 60 күн қабылдаған тышқандар препарат берілмеген қартайған тышқандармен салыстырғанда физикалық төзімділігі мен зерттеушілік мінез-құлқын көбірек сақтап, мазасыздыққа ұқсас мінез-құлықты азырақ көрсетті. Ми тінінде қартаю әсерінен бәсеңдеген NRF1, TFAM, SOD2 және IV кешеннің COX1 суббірлігі гендерінің экспрессиясы ересек жастағы деңгейлерге қарай қалпына келді, ал mtDNA көшірмелерінің саны артты. Мінез-құлық, реттеушілер және геном мөлшерін қамтитын бұл нәтижелер метилен көгі мен мидағы митохондриялық биогенез туралы орта жастағы тышқандарға жүргізілген зерттеуде баяндалған.

Ұсынылған қозғаушы сигнал — ең қызықты тұсы, өйткені ол метилен көгі жай ғана антиоксидант деген түсінікке қайшы келеді. Препарат берілген тышқандардың ми митохондрияларында оттегінің белсенді түрлері, нақтырақ айтқанда сутегі пероксиді көбірек түзілген. Авторлардың болжамы бойынша, әлсіз пероксид сигналы Nrf2 жолын белсендіреді, ал ол өз кезегінде биогенез бағдарламасын іске қосады. Бұл модельде метилен көгі бастапқы қозғаушы қадамда прооксидант, ал нәтиже кезеңінде антиоксидант болады. Фармакологтар мұндай заңдылықты гормезис деп атайды: шағын стресс өзінен күштірек қорғаныс жауабын туғызады. Пероксид деңгейінің жоғарылауы шынымен Nrf2 белсендірілуіне себеп бола ма деген сұрақ тікелей тексерілмеген; бұл өлшенген байланыс емес, ұсынылған байланыстырушы болжам.

Сол топтың ілеспе зерттеуі осы болжамның қауіпсіздік жағын қосымша сынақтан өткізді. Оқшауланған ми митохондрияларында метилен көгі небәрі 50 наномолярлық концентрацияның өзінде сутегі пероксидінің түзілуін арттырды, бірақ терапиялық концентрацияларда митохондриялық ДНҚ-ның анықталатын зақымдануы байқалмады. Тек терапиялық деңгейлерден әлдеқайда жоғары 100 микромолярлық концентрацияда ғана mtDNA-ның жекелеген фрагменттерінде зақымдану көрінді. Ал 20 микромолярлық бояғышты қызыл жарықпен біріктіру mtDNA-ны кеңінен зақымдайтын синглетті оттегі түзді. Бұл — бояғыштың жарықсыз жағдайдағы фармакологиясы емес, оның белгілі фотосенсибилизаторлық қасиеті. Алдын ала өңдеу тіпті ортаңғы мидың вентралдық бөлігіндегі митохондрияларды ротенон туғызған mtDNA зақымдануынан қорғады. Дозаға тәуелді жауап пен геноуыттылықты бақылау сынақтары метилен көгінің геноуытты әсерсіз пероксид түзуі туралы зерттеуде егжей-тегжейлі берілген.

Өлшенген және болжанған: сызбаны түсіну

Төмендегі жол сызбасы мәтінде жасалған айырмашылықты айқын көрсету үшін осы мақалаға арнайы әзірленді. Тұтас жиекті блоктар — метилен көгі туралы әдебиетте тікелей тәжірибелік дәлелі бар қадамдар: NAD/NADH арақатынасын өзгертетін тотығу-тотықсыздану циклі, AMPK-ның уақытша фосфорлануы, PGC-1alpha және SURF1 индукциясы, IV кешен белсенділігінің жоғарылауы, NQO1 мен TrxR1 индукциясы, тышқан миында биогенез гендерінің экспрессиясы мен mtDNA көшірмелері санының қалпына келуі, сондай-ақ терапиялық дозаларда mtDNA зақымданбай, пероксид деңгейінің жоғарылауы. Үзік жиекті блоктар — болжанған байланыстар: Keap1-дің пероксид сигналын сезуі, Nrf2-нің ядрода жиналып, қорғаныс гендерін іске қосуы және Nrf2 белсендірілуінен биогенез бағдарламасына апаратын себептік көрсеткі. Бұл үзік сызықты қадамдар қисынды, деректерге сәйкес келеді және оқулықтардағы қалыпты биологияға жатады. Бірақ осы мақалаларда оларды тұтас жиекті блоктарға айналдыруға мүмкіндік беретін бақылаулармен — ядродағы Nrf2, ARE репортерлері, Nrf2 нокауты — өлшемеген.

Сызбаға қарағанда үш шатасу анық көрінеді. Біріншіден, NRF1 мен Nrf2 — атаулары өте ұқсас, бірақ бөлек ақуыздар. Тышқандарға жүргізілген зерттеуде антиоксиданттық транскрипция факторы емес, биогенез реттеушісі — ядролық тыныс алу факторы 1 өлшенген. Оларды шатастыру бүкіл сызбаны бір түйінге біріктіріп жібереді. Екіншіден, ген экспрессиясы — үдерістің соңы емес, басы. TFAM немесе COX1 ақпараттық РНҚсының қалпына келуі биогенезге сұраныс болғанын қолдайды, ал mtDNA көшірмелерінің саны мен IV кешеннің белсенділігі сол сұраныстың орындалғанына дәлел болады. Үшіншіден, антиоксиданттық нәтиже Nrf2 жолын дәлелдемейді. Фибробласттардағы тотықтырғыштардың 28 пайызға төмендеуі мен тышқандардағы ротенон әсерінен қорғаныс — шынайы кейінгі әсерлер, бірақ оларға бірнеше жол тоғысады.

Үзік жиекті блокты тұтас жиекті ету үшін не қажет

Жетіспейтін тәжірибелер — қалыпты тәжірибелер. Метилен көгі әсерінен кейін ядродағы Nrf2 ақуызын AMPK-ның уақытша сигналына сәйкес уақыт аралықтарында өлшеу синхронды белсендіру болжамында айтылғандай, екі тармақтың шынымен бірге іске қосылатынын тексерер еді. ARE басқаратын репортер транскрипциялық белсенділікті нысана-гендерден жанама тұжырымдау орнына тікелей растауға мүмкіндік берер еді. Nrf2 экспрессиясы бәсеңдетілгенде немесе гені толық өшірілгенде биогенез көрсеткіштерін қайта өлшеу себептік көрсеткіні тікелей тексерер еді: егер IV кешен индукциясы мен mtDNA көбеюі Nrf2 жоқ кезде де сақталса, ұсынылған байланыс қате, ал әсерді AMPK тармағы жалғыз өзі қамтамасыз етеді. Жануарлардағы зерттеуде препаратты ұзақ уақыт беру кезінде сол үш бақылау нүктесін — реттеуші, мөлшер, қызмет — бағалау бағдарламаның белсенді күйде қалатынын немесе бейімделетінін тексерер еді. Оған дейін энергетикалық және қорғаныс жолдарының синхронды белсендірілуі авторлар қалай атаған болса, сол күйінде қалады: орныққан механизм емес, ықтимал негізгі фактор.

Жалпы фармакология тұрғысынан келген оқырмандарға кеңірек мәнмәтін қажет болуы мүмкін: метилен көгі митохондриялық деңгейде электрондарды қалай тасымалдайды, митохондриялар мен жасушалық энергияға тағы қандай әсер етеді, жасушалық қартаюға қатысты нәтижелер қартаю зерттеулерінде қандай орын алады, биогенез туралы тұжырымдар когнитивтік қызметпен қалай байланысты және кез келген дозалау талқылауының шегін белгілейтін қауіпсіздік деректері қандай. Бұлардың әрқайсысы — өз дәлелдері бар бөлек ұғым, әрі әрқайсысына осы мақалада Nrf2 үшін қолданылғандай, өлшенгенді болжанғаннан ажырататын тәсіл қажет.