Метилен көгі қышқылға төзімділікті анықтау үшін бояуда неліктен қарсы бояғыш ретінде қолданылады

Зертханашы бояудың барлық кезеңінен өткен қақырық жағындысын қарайды. Көк фонда қызыл таяқшалар анық көрінеді, ал қорытындыда қышқылға төзімді бациллалар байқалғаны жазылады. Келесі күні басқа заттық шыныда қызыл таяқшаларсыз біркелкі көк өріс көрінеді де, оның нәтижесі туберкулезге теріс деп беріледі. Осы екі қорытындының бірі заттық шыныдан алынған деректен артық тұжырым жасайды, және ол — біріншісі емес.

Шатасудың себебі — ұғымды дұрыс түсінбеу. Зертханашы көк бояғышты анықтау химиясының бір бөлігі ретінде қабылдап, метилен көгі микобактерияларды табуға көмектеседі деп ойлаған. Бірақ олай емес. Метилен көгі заттық шыныға түскен кезде сынақ әлдеқашан аяқталған болады. Бояғыш нәтижені оқуға ыңғайлы ету үшін тек фонды бояйды. Бұл мақалада қышқылға төзімділікті анықтау үшін бояуда метилен көгінің қандай қызмет атқаратыны, неге басқа түс емес, көк түс таңдалатыны және көк фонда қызыл нысандардың көрінуі қандай қорытынды жасауға мүмкіндік беретіні түсіндіріледі.

Қысқаша жауап

Қышқылға төзімділікті анықтау үшін бояу — үш қағидаға негізделген дифференциалдық сынақ. Негізгі бояғыш карбол-фуксин барлық жасушаға, соның ішінде балауыз тәрізді қабықшасы бар микобактерияларға да күштеп енгізіледі. Түссіздендіргіш қышқылды спирт кәдімгі жасушалардан қызыл бояғышты кетіреді, бірақ оны қышқылға төзімді жасушалардан шығара алмайды. Одан кейін қарсы бояғыш метилен көгі түссіздендіргіш бояуын кетірген барлық нысанды бояйды. Нәтижесінде қышқылға төзімсіз жасушалар, иесінің жасушалары және қалдықтар көк болып көрінеді, ал қышқылға төзімді бациллалар қызыл күйінде қалады. Қарсы бояғыш контраст жасайды. Ол жасушаның қышқылға төзімділігін қамтамасыз ететін химиялық үдеріске қатыспайды.

Әр кезеңнің қызметі

Төмендегі сызбада кезеңдердің қызметі көрсетілген. Оны рәсімнің реті ретінде солдан оңға қарай оқыңыз, ал төменгі жолақ бояу әдістерінің әр тобы әртүрлі сұраққа жауап беретінін еске салады.

Алдымен бояғыш жасушаға енуі керек. Микобактериялардың қабықшасы ерекше гидрофобты болғандықтан, олар кәдімгі сулы бояғыштарға қарсы тұрады, сондықтан хаттама бояғыштың ішке енуін күшейтеді. Циль–Нильсен әдісінде бумен қыздыру құрамында фенол бар карбол-фуксинді балауыз тәрізді қабырға арқылы өткізеді. Киньонның суық әдісінде қыздырудың орнына негізгі бояғыштың әлдеқайда қою құрамы қолданылады, ал қыздырусыз орындалатын кейбір өзгертілген нұсқаларға беттік-белсенді заттар қосылады. Америкалық микробиология қоғамының қышқылға төзімділікті анықтау үшін бояу хаттамаларында екі құрам қатар берілген, олардың концентрациясы айтарлықтай өзгеше: қыздыру әдісінде әр 100 mL-ге шамамен 0.3 g негіздік фуксин, ал суық әдісте шамамен 4 g қолданылады.

Екінші кезең — саралау. Әдетте 97 mL 95 пайыздық этанолға 3 mL концентрлі тұз қышқылын қосып дайындайтын қышқылды спирт қабырғасы ерекше төзімділік танытпайтын әр жасушадан қызыл бояғышты шайып шығарады. Микобактериялық липидті қабықшасы бүтін жасушалар бояғышты ұстап қалады. Бүкіл әдістің мәні осы кезеңге тіреледі және төменде айтылғандай, ол орындау техникасына ең сезімтал кезең болып табылады.

Соңғы кезең — контраст жасау. Енді заттық шыныда бояуы кеткен жасушалардың түссіз дерлік фонында қызыл қышқылға төзімді жасушалар бар. 0.3 пайыз w/v метилен көгі сол фонды қызылдан барынша ерекшеленетін түске бояп, қайтадан көрінетін етеді. Қарсы бояу қысқа уақытқа созылады: қыздыру әдісінде әдетте 20–30 секунд, ал суық әдістің кейбір нұсқаларында бірнеше минутқа дейін. Бұл уақыт бояғыштың өз қасиетіне емес, хаттамаға байланысты.

Неліктен осы бояғыш және неліктен көк түс

Метилен көгі — катиондық негіздік бояғыш. Яғни оның түсті ионы оң зарядқа ие және түссіздендірілген бактериялардың, иесінің жасушалары мен қалдықтардың теріс зарядталған беттеріне байланысады. OpenStax Microbiology зарядтардың осы өзара әрекетін негіздік бояғыштардың жалпы жұмыс қағидасы ретінде сипаттайды. Алайда бұл тұрғыдан метилен көгі химиялық жағынан бірегей емес. Кристалды күлгін мен сафранин де негіздік бояғыштар. Таңдау химияға емес, оптикаға байланысты.

Қызыл таяқшаларға түсі айқын ерекшеленетін фон қажет, ал көк түс жарық өрісті микроскопияда қызылмен ең қолайлы контраст жасайды. Сафранин қарсы бояғыш ретінде қолайсыз болар еді, өйткені оның соңғы қызғылт-қызыл түсі жасушада сақталған карбол-фуксиннің түсіне тым жақын болып, рәсім жасаған айырмашылықты жояды. Кристалды күлгін қою күлгін фон түзеді де, жіңішке қызыл бациллалардың байқалуына кедергі келтіреді. Бұл қызметтің химиядан гөрі контрастқа қатысты екенін ең анық дәлелдейтін жайт — бояғышты алмастыру мүмкіндігі: малахит жасылы мен бриллиант жасылы сияқты жасыл қарсы бояғыштар кейбір ветеринариялық және өзгертілген хаттамаларда қолданылады, әрі сынақ жұмыс істей береді, өйткені айқын ерекшеленетін кез келген түс сол қызметті атқарады.

Бұдан екі практикалық қорытынды шығады. Біріншіден, стандартты рецептте pH реттеу қарастырылмаған; осы қарапайым 0.3 пайыздық сулы ерітіндіні басқа бояу қағидасына жататын Леффлердің метилен көгі сияқты сілтілі құрамдармен шатастырмаңыз. Екіншіден, шамадан тыс бояу зиян келтіреді. Гистология әдебиетінде тым қою көк фон аз мөлшердегі бациллаларды жасыруы мүмкін екені арнайы ескертіледі. Сондықтан заттық шыныны бояғышта хаттама рұқсат еткеннен ұзақ ұстау ешқандай пайда бермей, нәтижені оқуды қиындатады.

Сынақты мүмкін ететін қабырға химиясы

Қышқылды спирттің жасушаларды ажырату себебі микобактериялық қабықшада жатыр. Оның құрылымдық өзегі — миколил-арабиногалактан-пептидогликан кешені: пептидогликан арабиногалактанмен байланысқан, ал оның сыртқы ұштарына тізбегі өте ұзын микол қышқылдары жалғанған. Олар липидке бай, өткізгіштігі ерекше төмен сыртқы микомембрана түзеді. Микобактериялардың сыртқы мембранасына арналған шолуда бұл құрылым егжей-тегжейлі сипатталған. Тосқауыл екі бағытта да жұмыс істейді. Ол бояғыштың енуіне қарсы тұрады, сондықтан бояғышты енгізу үшін қыздыру немесе күшейтілген негізгі бояғыш қажет. Сондай-ақ ол бояғыштың шығарылуына қарсы тұрады, сондықтан карбол-фуксин ішке енгеннен кейін қышқылды спирт оны кетіре алмайды. Кәдімгі бактерияларда мұндай қабықша жоқ, сондықтан олар бояғышты жоғалтады. Демек, қышқылға төзімділікті фуксиннің микол қышқылымен химиялық байланысуы емес, липидті тосқауыл құбылысы ретінде түсінген дұрыс.

Осы химия жиі кездесетін бір түсініксіз жайтты да түсіндіреді: микобактериялар Грам әдісімен нашар әрі біркелкі емес боялады, кейде солғын моншақ тәрізді пішіндер немесе боялмаған көмескі сұлбалар түрінде көрінеді. Олардың гидрофобты қабырғасы кристалды күлгіннің енуін шектейді. Қышқылға төзімділікті анықтау үшін бояу — Грам бойынша бояудың өзгертілген нұсқасы емес. Ол қабырғаның басқа қасиетіне негізделген өзгеше саралау қағидасын қолданады; ал қалған екі әдістің айырмашылығы қарапайым бояу мен Грам бойынша бояуды салыстыруда көрсетілген.

Үш әдіс, үш сұрақ

Бактерияларды бір бояғышпен бояу әдістерінің кеңірек тобы туралы микроскопиялық бояу атласынан қараңыз.

Көк фонда қызыл нысандардың көрінуі нені дәлелдей алмайды

Қызыл таяқшалар микроорганизмдердің қышқылды спирт әсерінен кейін карбол-фуксинді сақтап қалғанын білдіреді. Мұндай нәтиже Mycobacterium tuberculosis-ке сәйкес келеді, бірақ CDC-дің туберкулез диагностикасы жөніндегі нұсқаулығында басқа микобактериялардың да қышқылға төзімді екені нақты айтылған. Сондықтан түрді анықтау үшін түс емес, өсінді алу және нуклеин қышқылдарын зерттеу қажет.

Техникалық қателер көбіне екі шаю кезеңінде туындайды. Жеткіліксіз түссіздендіру фондық материалды қызыл күйінде қалдырып, жалған оң нәтиже беруге себеп болады. Шамадан тыс түссіздендіру әлсіз ұсталған негізгі бояғышты кетіріп, жалған теріс нәтижелерге ықпал етеді. Тым қою жағылған қарсы бояғыш аз мөлшердегі бациллаларды көк фонда жасырады. Қалың жағындылар, тұнбаға түскен реактивтер және ластанған шаю суы да өз артефактілерін қосады.

Орындау техникасы қаншалықты мінсіз болса да, сезімталдық микроорганизмдердің мөлшерімен шектеледі. Кәдімгі жағынды микроскопиясына қақырықтың әр миллилитрінде шамамен 5,000–10,000 бацилла қажет. CDC-дің бұрынғы дәлелдеме шолуларында өсіндімен расталған өкпе туберкулезі жағдайларында жағынды сезімталдығы шамамен 45–80 пайыз деп көрсетілген. Сондықтан теріс жағынды туберкулезді ешқашан жоққа шығармайды. CDC-дің қазіргі нұсқаулығы әр жағындымен қатар өсінді зерттеуін жүргізуді сақтап отыр және өкпе туберкулезіне күдік туып, нәтиже науқасты жүргізу тактикасын өзгертетін жағдайда кемінде бір тыныс жолы үлгісінде нуклеин қышқылдарын амплификациялау сынағын орындауды ұсынады.

Практикалық жұмыс бекітілген хаттамаларға сүйенуі тиіс

Оқу мақсатындағы сипаттамалар, соның ішінде осы мақала, клиникалық жұмыс жүргізуге рұқсат бермейді. Зертханада жұмыс істегенде CDC, APHL немесе CLSI-дің қолданыстағы құжаттарына сәйкес келетін, зертхана валидациялаған стандартты операциялық рәсімді ұстаныңыз; CDC-дің Stacks мұрағатындағы қышқылға төзімділікті анықтау үшін бояу жөніндегі анықтамалығы осындай рәсімдерде реактивтер мен нәтижені бағалау тәртібі қалай белгіленетінін көрсетеді. Туберкулез үлгілерімен жұмыс тиісті оқшаулау шараларын қажет етеді: жағындылар биологиялық қауіпсіздік шкафында дайындалады, өйткені дайындау кезінде аэрозольдер мен шашырандылар түзіледі. CDC-дің зертханалық қауіпсіздік нұсқаулығында қыздыру арқылы бекітілген жағындылардың өзінде тіршілікке қабілетті туберкулез бациллалары болуы мүмкін екені және олармен ластанған материал ретінде жұмыс істеу қажет екені айтылған. CDC-дің Қоғамдық денсаулық сақтау суреттер кітапханасындағы M. leprae-ні іздеу үшін зерттелген, карбол-фуксин және метилен көгімен боялған жағынды туралы жазба әдістің туберкулезден тыс та қолданылатынын еске салады: қышқылға төзімді микроорганизмдер ізделетін жерде көк фонда қызыл түстің дәл осы контрасты қолданылады, ал мұқият тексерілген теріс нәтиженің өзі тіркеуге тұрарлық қорытынды болып табылады.

Дайын заттық шыныны бағалау

Қарсы бояғыштың маңызы бастапқы шолу кезінде көрінеді. Кіші үлкейтумен қарайтын микроскопист алдымен көк фон арқылы жағынды сапасын бағалайды: жасушалардың біркелкі таралуы, фокусты келтіруге көмектесетін иесінің бүтін жасушалары және қою тұнбаның болмауы. Одан кейін қызыл күдікті нысандар назарға түседі, өйткені заттық шыныда басқа ештеңе қызыл емес. Растау майлы иммерсиямен жүргізіледі: онда нағыз бациллалар біркелкі бояғыш қалдықтары түрінде емес, күтілетін жіңішке, кейде сәл иілген немесе моншақ тәрізді таяқшалар түрінде көрінеді.

Фонды бояу қорытындының тұжырымын да айқындайды. Қызыл бациллалары бар заттық шынының нәтижесі қышқылға төзімді бациллалар байқалды деп беріледі, көбіне зертхана шкаласы бойынша жартылай сандық бағамен толықтырылады. Қызыл микроорганизмдері жоқ заттық шынының нәтижесі қышқылға төзімді бациллалар байқалмады деп беріледі, ешқашан туберкулезге теріс деп жазылмайды. Бұл айырмашылық маңызды: көк өріс бояудың орындалғанын, жасушалардың қарсы бояғышты қабылдағанын және оптикалық жағдайдың жеткілікті болғанын көрсетеді, бірақ анықтау шегінен төмен мөлшердегі микроорганизмдер туралы ештеңе айтпайды. Қызыл нысандарсыз көк өріс — заттық шыныға қатысты жарамды нәтиже, науқас туралы түпкілікті қорытынды емес.

Кезеңдердің қызметін есте сақтасаңыз, қорытындыны дұрыс тұжырымдау оңай. Карбол-фуксин күдікті нысандарды айқындайды. Қышқылды спирт сынақты жүргізеді. Метилен көгі жауапты тек оқуға ыңғайлы етеді: қызыл нысандар қышқыл әсеріне қарамастан бояғышты сақтады, көк нысандар оны жоғалтты. Қалғанының бәрі — түрі, мөлшері және клиникалық мәні — заттық шыныны қараудан тыс зерттеулер арқылы анықталады.