Метилен көгі және аутофагия: AMPK, mTOR және нейрондық тәжірибелер

Жасушаларға тәжірибе жүргізіп, метилен көгін қосқаныңызды және блоттағы LC3-II деп аталатын ақуыз жолағының қоюлана түскенін көргеніңізді елестетіңіз. Қосылыс «аутофагияны күшейтеді» деп жариялап, әрі қарай өте шығу оңай. Бірақ мұндай қорытынды жасауға әлі ерте. LC3-II жолағының қоюлануы жасушаның тазалауға арналған көпіршіктерді көбірек түзіп жатқанын да, жою кезеңі бөгелгендіктен сол көпіршіктердің жиналып қалғанын да білдіруі мүмкін. Бұл екі түсіндірме бір-біріне қарама-қайшы бағыттарды көрсетеді, ал метилен көгінің нейрондарға әсері туралы әдебиетте дәлелдің осы екі түріне де мысалдар бар. Бұл мақалада әр талдау әдісі бойынша нақты не өлшенгені қарастырылады.

Мұнда зерттелген түр — макроаутофагия, яғни жасуша құрамдастарын жаппай қайта өңдеу үдерісі. Фагофор деп аталатын мембраналық қапшық тозған ақуыздар мен органеллаларды қоршай өсіп, тұйықталып аутофагосомаға айналады, лизосомамен қосылады, содан кейін ішіндегі жүк ыдырап, қайта пайдалануға босатылады. Нейрондар осы үдеріске тәуелді, өйткені олар бөлінбейді және зақымдалған бөліктерін бөліну арқылы сұйылта алмайды. Қайта өңдеу тоқыраса, қалдықтар жиналады. Ал ол жүріп тұрса, жасуша стресс жағдайында құрылыс материалдарын қайта алады.

Гиппокамп жасушаларымен жүргізілген бір тәжірибе нені көрсетті

Индукцияны зерттеген негізгі жұмыста тышқан гиппокампының HT22 жасушалары 24 сағат бойы сарысусыз ортада ұсталып, стреске ұшыратылды. Мұндай жағдайда өсу факторлары мен трофикалық сигналдар алынып тасталып, апоптоз да, аутофагия да іске қосылады. Зерттеушілердің хабарлауынша, метилен көгі жасушалардың өлуін дозаға тәуелді түрде азайтқан және бұл қорғаныш әсерімен қатар макроаутофагия белгілері байқалған.

Маркерлердің өзгерістері нақты сипатталған. Метилен көгінің концентрациясы шамамен 20 nM болғаннан бастап, LC3B-нің жайылған боялуы ядро маңындағы нүктелік ошақтарға қайта таралған, ал LC3-I және LC3-II жауабы шамамен 1 μM кезінде ең күшті болған. LC3B-I де, LC3B-II де дозаға және уақытқа тәуелді түрде артқан. Ең маңыздысы — зерттеушілер статикалық LC3 блотымен шектелмеген. Олар лизосомалық ыдыратуды бөгейтін 10 μM хлорохин қосып, метилен көгімен өңделген жасушаларда LC3-II деңгейінің жоғарылауын және p62 тұрақтануын анықтаған. Мұндай көрініс жай ғана жиналып қалуды емес, лизосомаға тәуелді айналымды қолдайды. Сондай-ақ олар хлорохиннің апоптозға қарсы әсерді ішінара әлсірететінін көрсеткен; бұл осы модельдегі қорғаныш әсерін аутофагия және лизосома жолымен байланыстырады.

Сигналдық нәтижелер — көбіне қате жеткізілетін бөлік. Фосфорланған AMPK және оның төменгі сатыдағы нысанасы — фосфорланған ACC арқылы бағаланған AMPK сигналдары 12 және 24 сағатта дозаға тәуелді түрде артқан. Соңғы 4 сағат ішінде 20 μM концентрацияда қолданылған AMPK тежегіші Compound C ACC фосфорлануын да, LC3 белсенуін де азайтқан. Ал фосфорланған mTOR деңгейінде анықталатын тежелу байқалмаған. Демек, стреске ұшыраған гиппокамп жасушаларында анықталған құбылыс — mTOR-ға тәуелсіз болып көрінетін жол арқылы жүретін, AMPK-пен байланысты индукция. Дәл осындай көрініс тірі тышқандарда да байқалған: метилен көгімен өңдеу ми қыртысы мен гиппокампта макроаутофагия маркерлерінің пайда болуын туындатқан.

Индукция — толық аяқталған аутофагиялық ағын емес

Мұнда ұғымдарды ажырату аса маңызды. Индукция дегеніміз — үдерістің бастапқы сатыларындағы механизмдердің көбірек аутофагосома түзуі. Ағын дегеніміз — жүктің бүкіл жолдан өтуі: оқшаулану, жетілу, лизосомамен қосылу, ыдырау және қайта өңделу. Ағынды тексеру қалған сатылардың орындалғанын растағанға дейін, LC3-II деңгейінің кез келген өсуі тек индукция туралы тұжырым болып қалады.

Ағынды стандартты тексеруде LC3-II деңгейі бафиломицин A1 немесе хлорохин сияқты заттармен лизосомалық қызмет қысқа уақытқа бөгелгенде және бөгелмегенде өлшенеді. Егер әсер шынымен түзілу үдерісін жеделдетсе, ыдырауды бөгеу LC3-II деңгейін одан әрі жоғарылатуы тиіс. Тандемді mCherry-GFP-LC3 репортері басқа қырынан бағалауға мүмкіндік береді: құрылымдар лизосомамен қосылғанға дейін сары түспен, ал қышқыл орта GFP сигналын өшіргеннен кейін тек қызыл түспен жарқырайды. Сондықтан тек қызыл түсті нүктелік ошақтардың көбеюі қышқыл аутолизосомаларға өту үдерісін қолдайды. p62 ақуызының азаюы жүк айналымын қосымша растауы мүмкін, бірақ p62 транскрипциясының өзі де стреске жауап беретінін ескеріп, оны мРНҚ деңгейінде тексеру қажет.

Төмендегі бақылау тізімі осы әдебиетте қолданылған әрбір талдау әдісінің нені өлшейтінін және өздігінен нені дәлелдей алмайтынын көрсетеді. Оқырмандар оны макроаутофагия туралы кез келген кейінгі тұжырымға, соның ішінде осы маркерлерге сүйенетін ашығу мен ұзақ өмір сүру туралы пайымдарға да қолдана алады.

Кесте сақтандыратын бір тұжырымдық қателікке назар аударыңыз. Фосфорланған ACC — ферменттік белсенділігі тежелген түр. Оның артуы ACC белсенуін емес, AMPK әсерінің нәтижесін көрсетеді.

«Макроаутофагияны тежеу нейропротекцияны жойды» деген тіркес те осындай дәлдікті талап етеді. HT22 моделінде бұл аутофагия және лизосома жолына кедергі келтіру сарысусыз жағдайда метилен көгі берген жасушалардың тіршілігін сақтау артықшылығын жойғанын білдіреді. Бұл сол жасушалық культурада аутофагияның қажетті немесе үлес қосатын үдеріс екенін қолдайды. Бірақ ол аутофагияның қосылыстың жалғыз қорғаныш механизмі екенін анықтамайды, хлорохиннің тек аутофагия арқылы әсер ететінін дәлелдемейді. Себеп-салдар туралы тұжырымды нығайту үшін ATG5, ATG7 немесе ULK1 қызметін генетикалық жолмен өзгерту қажет болар еді.

Бір механизмге апаратын екі жол

Қарапайым сызба түсінуге көмектеседі. Энергетикалық стресс AMPK белсенділігін арттырады, AMPK ULK1 кешенін белсендіреді, сөйтіп аутофагия басталады. Өсу факторлары мен қоректік заттар mTORC1 белсенділігін арттырады, mTORC1 ULK1-ді тежейді, сөйтіп аутофагия іске қосылмайды. ULK1-ден кейінгі сатыларда Beclin-1 және VPS34 кешені фагофор түзілуін бастайды, LC3-I липидтеніп LC3-II-ге айналады, аутофагосома тұйықталады, лизосомамен қосылады, содан кейін жүк ыдырап, p62 айналымға түседі.

Сызба метилен көгіне қатысты әр нәтижені осы жолдарға орналастырады: гиппокамптағы нәтиже AMPK тармағының, ал ізашар жасушалардағы нәтиже mTOR тармағының жанына қойылған.

Осы түсіндіру Xie жүргізген екінші зерттеумен арадағы көрінетін қайшылықты шешеді. Көбейіп жатқан егеуқұйрықтың жүйкелік ізашар жасушаларымен жүргізілген бөлек тәжірибеде 5 μM метилен көгі көбеюді тежеп, тыныштық күйіне өтуді ынталандырғаны анықталған. Ki67-оң жасушалар 1 және 3 күндері азайған, ал нейрондық бағытқа бекінген жасушалардың дифференциациясы сақталған. Мұнда механизм mTOR сигналдарының тежелуі арқылы жүрген: жалпы mTOR мен фосфорланған mTOR деңгейлері азайып, p70S6K және 4EBP1 экспрессиясы төмендеген, сондай-ақ E1, B1, D1 және D2 циклиндерінің экспрессиясы бәсеңдеген. Негізгі фенотип ізашар жасушалардың тыныштық күйі болған. Авторлар оны стреске ұшыраған гиппокамп жасушаларын сақтап қалумен емес, жасушалық қартаюдың кешігуімен байланыстырған.

Екі мақала арасында қайшылық жоқ. AMPK пен mTOR — өзгермейтін қосқыштар емес, жағдайға сезімтал сигнал біріктірушілер. Стреске ұшыраған, нейронға ұқсас жасуша mTOR-дың өлшенетін тежелуінсіз AMPK-ті іске қоса алады. Ал митоген әсерімен көбейетін ізашар жасуша дәл сол қосылысқа mTOR-ға тәуелді өсу механизмдерін баяулату арқылы жауап беруі мүмкін. Қай тармақтың басым болатынын жасуша түрі, стресс жағдайы, концентрация және өлшеу уақыты анықтайды. Метилен көгінің митохондриялық энергияға және тотығу-тотықсыздану үдерістеріне әсерін де осы көріністің бір бөлігі ретінде қарастыру керек. Нейропротекция механизмдері туралы шолуда сипатталғандай, қосылыс балама электрон тасымалдаушысы ретінде әрекет етеді, антиоксиданттық және апоптозға қарсы сигналдық жолдарды іске қосады, MAO мен NOS-ты тежейді және биогенез бен аутофагия арқылы митохондриялардың жаңаруымен байланысады. Аутофагия — көпқырлы әсерлердің бір тармағы ғана, бүкіл құбылыстың өзі емес.

Тәжірибелер нені көрсетпейді

Сарысусыз орта жасушалық культурада трофикалық және метаболизмдік стрессті модельдейді. Ол тұтас ағзаның ашығуын модельдемейді: негізгі ортада глюкоза, аминқышқылдары мен тұздар қалады, әрі қоректену мінез-құлқы болмайды. Культурадағы 20 nM мен 5 μM аралығындағы концентрацияларды қарапайым арифметикамен адамға арналған дозаларға айналдыруға болмайды, өйткені сіңу, ақуыздармен байланысу, тотығу-тотықсыздану күйі, метаболизм, тіндерде жиналу және әсер ету уақытының бәрі өзгеше.

Адамдарда жүргізілген ешбір сынақ пациенттерде метилен көгі туындатқан аутофагиялық ағынды көрсету мақсатында жоспарланбаған. Механизмдерге қатысты дәлелдер әлі де жасушалық, ex vivo және жануарлардағы жұмыстармен шектеледі, ал шолулар бұл нәтижелерді клиникаға көшіруге қатысты дәлелдерді әлі де алдын ала деректер деп сипаттайды. Сондықтан бұл зерттеулер метилен көгінің ашығуды қайталайтынын, аутофагия арқылы адамның өмірін ұзартатынын немесе адам миында аутофагиялық ағынды толық аяқтайтынын көрсетпейді. Ашығуға ұқсас әсер мен ұзақ өмір сүру туралы тұжырымдарға өз алдына клиникалық дәлелдер қажет. Адамдарда метилен көгін басқа көрсетілімдер бойынша сынау аутофагиямен байланыстырылғаны үшін ғана аутофагия сынағына айналмайды. Қоректік тапшылық стрессі мен ұзақ өмір сүру модельдері жөніндегі зерттеулерді осы шекараны ескеріп оқу керек.

Келесі мақаланы оқығанда, бақылау тізімін ретімен қолданыңыз. Алдымен қай тармақ өзгергенін сұраңыз: AMPK пе, mTOR ма, әлде екеуі де емес пе? Содан кейін LC3 нәтижесі ағынды тексерумен қатар алынған ба, әлде жеке берілген бе, соны анықтаңыз. Одан соң жолды бөгеу пайдалы әсерді жойған-жоймағанын және қандай әдіс қолданылғанын тексеріңіз. Үшеуіне де жауап берген зерттеу механизм туралы сенімді тұжырым жасауға негіз береді. Тек біріншісіне жауап берген зерттеу іске қосылуға рұқсат беретін сигналды ғана көрсеткен, ал үдерістің қалған жолы әлі анықталмаған.