Леффлердің сілтілі және полихромды метилен көгі бояғыштарының түсіндірмесі

Бояу үстелінде қатар тұрған үш құтының әрқайсысында метилен көгінің бір нұсқасы көрсетілуі мүмкін. Бірінде — метилен көгінің 1% сулы ерітіндісі. Екіншісінде — Леффлердің сілтілі метилен көгі. Үшіншісінде — полихромды метилен көгі. Жұмысы тығыз қызметкер ең жақын тұрғанын ала салады. Содан кейін жағынды тым солғын, түгелдей біркелкі көк немесе күтпеген күлгін реңктерге боялады да, нәтижеге үлгіні кінәлайды.

Мәселе үлгіде емес, ерітіндінің құрамында. Үш ерітіндіде өзара туыстас бояғыштар болғанымен, олардың бояу қағидалары әртүрлі. Біріншісі — pH мәні бейтарапқа жақын кәдімгі катиондық бояғыш. Екіншісі — сілті қосу арқылы әсері күшейтілген сол бояғыш. Үшіншісі енді жеке бояғыш емес, әдейі тотықтырылған қоспа. Дұрыс нұсқаны таңдамасаңыз, қолыңыздағы бояу қағидасы да өзгереді.

Қысқаша жауап

Кәдімгі сулы метилен көгі — бастапқы салыстыру нұсқасы: суда шамамен 1% бояғыш бар, бактериялардың морфологиясы мен жалпы микроскопияға арналған қарапайым катиондық бояғыш. Леффлердің сілтілі метилен көгі суда сұйылтылған спирттік бастапқы ерітіндіге сұйылтылған сілтінің аз, дәл өлшенген мөлшерін қосу арқылы алынады. Бұл pH мәнін жоғарылатып, катиондық бояғыштың бактериялардың қышқылдық құрылымдарымен байланысуын күшейтеді. Полихромды метилен көгі — сілтілі ортада тотықтыру арқылы әдейі жетілдірілген метилен көгі. Сондықтан құтыда қалдық метилен көгімен бірге деметилденген гомологтар (azure A, azure B, azure C), тионин және метилен күлгіні қоспасы болады. Бұл қоспа әртүрлі құрылымдарды әртүрлі реңктерге бояйды.

Бір ғана сөйлемді есте сақтасаңыз: сілтілендіру бояу қарқындылығын, ал полихромдау бояу түстерін өзгертеді.

Кәдімгі сулы метилен көгі: салыстыру негізі

Ең қарапайым құрам — сілті қосылмаған және тотықтырылмаған, суда ерітілген метилен көгі; оның концентрациясы әдетте 1% w/v болады. Түс беретін бөлшек — хлорид қарсы ионы бар метилтиониний катионы, шағын әрі жазық фенотиазиндік бояғыш. PubChem-дегі метилен көгі туралы жазбада ол метилтиониний хлориді деп сипатталған. Катион ретінде ол нуклеин қышқылдарының фосфатты қаңқаларымен және бактерия жасушаларының қабырғаларындағы қышқылдық топтармен байланысып, ашық фонда жасушаларды көк түске бояйды.

Оның артықшылығы — нәтиженің болжамдылығы. Ядролар мен бактериялар көк болып көрінеді. Контраст аса жоғары емес. Көмескі көрінетін микроорганизмдер әлсіз боялуы мүмкін; Леффлер дәл осы шектеуді жоюға ұмтылған. Бұл ерітінді жататын бактерияларды қарапайым бояу әдістерінің кеңірек тобы туралы бактерияларды қарапайым бояуға арналған шолудан оқуға болады. Мұнда да бояғыштың нақты сәйкестігін сақтау маңызды: метил көгі — мүлде басқа молекула. Бұл метил көгі мен метилен көгінің айырмашылығы туралы мақалада түсіндіріледі. Сондықтан каталогтан тек түс атауы бойынша іздеу бояғыштың қате класын таңдауға әкелуі мүмкін.

Леффлердің сілтілі метилен көгі: сол бояғыштың күшейтілген нұсқасы

Леффлердің классикалық рецепті метилен көгінің спирттік бастапқы ерітіндісін судағы сұйылтылған сілтімен біріктіреді. Оқулықтардағы нұсқаларда 95% этанолдың 30 mL көлемінде ерітілген 0.3 g бояғышқа калий гидроксидінің 0.01% сулы ерітіндісінің 100 mL көлемін қосу көрсетіледі. Баламалы нұсқа — метилен көгінің қаныққан спирттік ерітіндісінің 30 mL көлемі, дистилденген судың 100 mL көлемі және 1% KOH ерітіндісінің 1 mL көлемі. Нәтижесінде айқын сілтілі pH мәні бар, бояғыш мөлшері шамамен 0.3% болатын жұмыс ерітіндісі алынады. Коммерциялық нұсқалар да осы қағидаға сүйенеді. Thermo Fisher микробиологиялық бояғыштар каталогында Леффлердің сілтілі метилен көгі, полихромды және сулы нұсқалар қолданылу мақсаттары бөлек жеке каталог тауарлары ретінде берілген.

Негізгі рөлді сілті атқарады. pH мәнінің жоғарылауы үлгідегі карбоксил және фосфат топтарын депротондап, теріс зарядталған байланысу орындарының тығыздығын арттырады. Ал спирттік бастапқы ерітінді бояғышты толық еріген күйде ұстайды, сондықтан ол осы орындарға мономер түрінде жетеді. Нәтижесінде бактериялар бейтарап сулы бояғышқа қарағанда жылдамырақ әрі қарқындырақ боялады: күнделікті бактериологиялық жағындыға тән қою көк таяқшалар мен кокктар көрінеді. Бояу уақыты әдетте бір минуттан үш минутқа дейін созылады, одан кейін сумен шайылады.

Классикалық қолданылуы — Леффлердің сарысулық ортасында өсірілген Corynebacterium diphtheriae: жіңішке, көбіне шоқпар тәрізді таяқшаларда жинақталған полифосфаттан тұратын метахроматикалық Бабеш–Эрнст түйіршіктері айқын боялады. Орта мен бояғыштың осылай қатар қолданылуы тарихи қалыптасқан: екеуі де бір бактериологтың атымен байланысты, ал түйіршіктердің контрастылығы диагностикалық тұрғыдан маңызды нәтиже береді. Дифтерияға қатысты жұмыстардан бөлек, бұл бояғыш дақылдардан алынған жағындыларға, клиникалық жағындылардағы Neisseria морфологиясына және Грам бойынша бояу қажет емес, бірақ кәдімгі сулы көк бояғыш тым солғын нәтиже беретін жағдайларға арналған жалпы бактериологиялық бояғыш ретінде қолданылады. Бұл — монохромды бояғыш. Қышқылдық қасиеті бар құрылымдардың бәрі көктің белгілі бір реңкіне боялады. Хаттама түстер арқылы ажыратуды талап етсе, сілтінің өзі мұны қамтамасыз ете алмайды.

Бір практикалық ескерту: сілтілі бояғыш ерітінділері сақтау кезінде және көмірқышқыл газын сіңіргенде бұзылып, тұнба түзеді. Сондықтан зертханалар әр заттық әйнекке тұнба түсіретін ескі құтыны сақтап пайдаланудың орнына, ерітіндіні шағын көлемде дайындайды немесе каталогтағы дайын ерітіндіні сатып алып, оның жарамдылық мерзімін сақтайды.

Полихромды метилен көгі: бір атау, бірнеше бояғыш

Полихромды метилен көгі сол бояғыштан алынады, бірақ ол сілтілі ортада бақыланатын тотығуға ұшыратылады. Тарихи тұрғыдан бұл үдеріс жетілдіру немесе полихромдау деп аталған. Сілтілі ортада ұзақ ұстау, карбонатпен қыздыру немесе дихромат сияқты агенттермен тотықтыру диметиламино орынбасарларынан метил топтарын біртіндеп ажыратады. Нәтижесінде қоспа түзіледі: қалдық метилен көгі, azure B (бір метил тобы жоғалған), azure A және azure C (одан әрі деметилденген), тионин (толық деметилденген) және метилен күлгіні тобының тотығу жанама өнімдері. Әр компоненттің өз реңкі және тіндермен байланысу бейімділігі бар. Сондықтан қоспа метахроматикалық түрде бояйды: ядролар, түйіршіктер, муциндер мен шеміршек көктен қызыл-күлгінге дейінгі әртүрлі реңктерге ие болады.

Бұл химиялық үдерістер әйгілі қан бояғыштарының негізінде де жатыр. Алғашқы зерттеушілер сілтілендірілген метилен көгі безгек паразиттерінің ядроларын күлгін реңктерге бояйтынын анықтаған. Алайда олардың жетілдірілген сулы ерітінділері тұрақсыз болып, бірнеше күн ішінде тұнба түзген. Қанға арналған күлгін бояғыштың қалай ойлап табылғаны туралы шолуда Малаховский мен Романовскийдің 1891 жылы бұл әсерді бір-бірінен тәуелсіз қалай пайдаланғаны, бояғыш тұнбасын тұрақтандыру және жағындыларды қыздырмай бекіту үшін метанолдың қалай енгізілгені, кейін Гимзаның нақты өлшенген azure B мен эозинге және глицеринмен тұрақтандыруға сүйеніп қоспаны қалай стандарттағаны баяндалады. Қазіргі Гимза типті бояғыштар полихромды метилен көгі мен эозиннен тікелей тараған; дәл осы үйлесім Романовский әсерін тудырады. Эозинмен үйлесуі және azure B компоненті туралы толығырақ Романовский типті бояғыштар және azure B мен эозиннің өзара әрекеттесуі мақаласынан оқыңыз.

Қоспа болғандықтан, полихромды метилен көгі табиғаты бойынша осы үш нұсқаның ішіндегі ең аз стандартталғаны. Оның нақты реңк арақатынасы тотығу жолы мен дәрежесіне байланысты. Сондықтан гистологияға арналған материалдар жеткізушілері оны ұзақ сақталған Леффлер ерітіндісі ретінде емес, жұмыс сипаттамалары бөлек тексерілетін дербес өнім ретінде сатады. Әдеттегі қолданылуына мес жасушалардың түйіршіктерін, муциндер мен шеміршекті метахроматикалық көрсету, плазмалық жасушалардың бөлшектерін айқындау және Гудпасчер типті полихромды әдістермен тін кесінділеріндегі Helicobacter pylori-ді көрсету жатады. Құрылымдарды түсі бойынша ажырату қажет болса, бұл — дұрыс таңдау. Ал хаттама бактериялардың анық монохромды сұлбасын талап етсе, бұл нұсқа сәйкес келмейді.

Құрамы мен қолданылу мақсатын салыстыру

Кестені таңдау алгоритмі ретінде қарастырыңыз. Үлгі тым солғын боялса, pH қағидасын өзгертіп, Леффлер ерітіндісін таңдаңыз. Бәрі боялғанымен, ешбір құрылым ерекшеленбесе, бояғыш қағидасын өзгертіп, полихромды нұсқаны таңдаңыз. Леффлермен боялған жағынды түйіршіктерді тамаша көрсетіп тұрса, бірақ жетекші ядролар мен цитоплазманың неге бірдей көк екенін сұраса, жауап мынадай: ешбір сілтілі монохромды бояғыш оларды түсі бойынша ажырата алмайды. Бұл міндет полихромды бояғыштар тобына және оның қанды бояуға арналған туындыларына жатады.

Жиі кездесетін шатасулардан сақтану

Шатасулардың көпшілігі екі қатеден туындайды. Біріншісі — құтыда екеуі де көк көрінетіндіктен, Леффлер ерітіндісін кәдімгі метилен көгімен алмастыруға болады деп санау. Олардың pH мәні мен бояу қарқындылығы әртүрлі. Леффлер ерітіндісі көрсетілген жерде бейтарап бояғышты қолдану хаттаманың негізгі мақсаты болған түйіршіктер контрастын жоғалтады. Екіншісі — кез келген ескі немесе кездейсоқ ұзақ сақталған сілтілі көк ерітіндіні полихромды деп қабылдау. Бақылаусыз ескіру құрамы да, концентрациясы да белгісіз қоспа береді. Ал нағыз полихромды ерітінділер анықталған тотығу жолдарымен дайындалады және қан бояғыштары тармағында нақты өлшенген эозинмен біріктіріледі. Бұл тұрғыда тарихтан сабақ алуға болады: 1890-жылдардағы тұрақсыз, жетілдірілген сулы ерітінділердің орнына метанолмен тұрақтандырылған құрамдар келді, өйткені бақыланбайтын қоспаларды қайталап алу мүмкін болмады. Жасы белгісіз құтыдан алынған ерітіндімен диагностикалық препаратты боямас бұрын осы сабақты еске алған жөн.

Атауларды мұқият тексеру бұл мәселені шешуге көмектеседі. Түсіне қарап қорытынды жасаудың орнына, заттаңбадағы каталог нұсқасын (сулы, Леффлер немесе полихромды), бояғыш мөлшерін және қолданылу мақсатын растаңыз. Үш құрамның хромофорлық негізі ортақ. Бірақ мақсаттары ортақ емес.