ჟანგბადის რეაქტიული ფორმების გაზომვა მეთილენის ლურჯის ექსპერიმენტებში

ორი ლაბორატორია ატარებს ექსპერიმენტს, რომელსაც თითოეული მეთილენის ლურჯის ანტიოქსიდანტურ ექსპერიმენტს უწოდებს. ერთი აცხადებს, რომ საღებავი ჟანგბადის რეაქტიულ ფორმებს თრგუნავს. მეორე აცხადებს, რომ ის მათ წარმოქმნის. ორივე აჩვენებს დოზა–პასუხის მკაფიო მრუდებს. ორივე გულწრფელია. განსხვავების მიზეზი არც თაღლითობაა და არც არაკომპეტენტურობა. ორი ჯგუფი სხვადასხვა განათების პირობებში სხვადასხვა რამეს ზომავდა ზონდებით, რომლებიც სხვადასხვა კითხვას პასუხობს, შემდეგ კი ორივე პასუხი ერთი და იმავე სიტყვით აღწერა: ROS.

მეთილენის ლურჯის ზუსტად გაზომვა რთულია სწორედ იმიტომ, რომ ის მონაწილეობს იმ ქიმიურ პროცესებში, რომლებსაც უნდა აკვირდებოდეს. სიბნელეში ის ელექტრონებს დონორებსა და აქცეპტორებს შორის გადააქვს და საწყის ფორმას უბრუნდება, რათა ციკლი ხელახლა გაიაროს. სინათლეზე ის ფოტოსენსიბილიზატორად იქცევა და აღწევს აღგზნებულ ტრიპლეტურ მდგომარეობას, საიდანაც შეუძლია ჟანგბადს ენერგია გადასცეს სინგლეტური ჟანგბადის წარმოსაქმნელად, ან ელექტრონები გადასცეს რადიკალებისა და წყალბადის პეროქსიდის წარმოსაქმნელად. ამ სისტემაში მოთავსებული ნებისმიერი ზონდი შეიძლება თვითონ საღებავმა დაჟანგოს, აღადგინოს, გააუფერულოს ან ოპტიკურად დაფაროს. ამიტომ ROS-ის ნებისმიერი მაჩვენებლის შემთხვევაში პირველი კითხვა არასოდეს არის ის, თუ რა რიცხვი მივიღეთ. პირველი კითხვაა, სინამდვილეში რას აფიქსირებს ანალიზი და როგორ მოქმედებს საღებავი ანალიზზე.

Amplex Red: წყალბადის პეროქსიდის კალიბრირებული ანალიზი

მეთილენის ლურჯისა და Amplex Red-ის კომბინაცია ამ ლიტერატურაში ყველაზე დასაბუთებული შეხამებაა, თუ ანალიზი სწორად არის გამართული. ქიმიური რეაქცია სპეციფიკურია: პირშუშხას პეროქსიდაზა წყალბადის პეროქსიდს იყენებს Amplex-ის სუბსტრატის ფლუორესცენტულ პროდუქტად, რეზორუფინად, დასაჟანგად, დაახლოებით ერთი ერთთან სტოიქიომეტრიული თანაფარდობით. ნიმუშში არსებული პეროქსიდი დეტექტორში ფლუორესცენციად გარდაიქმნება. ROS-ის კლასიკური ჯგუფის სხვა არცერთი წევრი ამ რეაქციას პირდაპირ არ წარმართავს.

გადამწყვეტი უპირატესობა კალიბრაციაა. გულდასმით მომუშავე მკვლევარი პეროქსიდის ცნობილ სტანდარტებს იმავე ბუფერში ამოწმებს, პეროქსიდაზისა და სუბსტრატის იმავე კონცენტრაციებით, ინკუბაციის იმავე დროითა და იმავე ოპტიკური პარამეტრებით, შემდეგ კი ნიმუშების მაჩვენებლებს ამ მრუდს ადარებს. ტვინის იზოლირებული მიტოქონდრიების კვლევაში, რომელსაც ეს მეთოდი ეყრდნობა, ავტორებმა სწორედ ასე იმოქმედეს: ყოველი ცდის ბოლოს პეროქსიდის ცნობილი რაოდენობები დაამატეს და რიცხვები წარმოადგინეს სიჩქარის სახით — პიკომოლებში წუთში, ცილის თითოეულ მილიგრამზე — და არა ფლუორესცენციის პირობით ერთეულებში. სწორედ ეს აქცევს ნათებას გაზომვად.

ამ კვლევიდან სამი დეტალის გამეორება ღირს. პირველი: ავტორებმა სიგნალი კატალაზით გადაამოწმეს, რომელიც პეროქსიდს შლის. კატალაზის დამატების შემდეგ მეთილენის ლურჯით გამოწვეული ფლუორესცენციის მატება შეწყდა, რაც ადასტურებდა, რომ სიგნალი პეროქსიდს ასახავდა და არა ოპტიკურ არტეფაქტს. მეორე: მათ განათების გავლენა უშუალოდ შეამოწმეს — აღმგზნები სხივის ჩამკეტით ნიმუშებისთვის სინათლის ჩვეულებრივი დოზა ერთ მერვედამდე შეამცირეს, სიგნალი კი მხოლოდ ცხრა პროცენტით შემცირდა. მათ მიერ აღწერილი პეროქსიდის ოთხმოცდაათ პროცენტზე მეტი გაზომვისას გამოყენებული სინათლისგან დამოუკიდებლად წარმოიქმნებოდა. მესამე: მათ პეროქსიდის მოცილება ცალკე, ელექტროდით გაზომეს და აღმოაჩინეს, რომ საღებავი ერთდროულად ზრდიდა მის წარმოქმნას და ანელებდა მოცილებას. ზონდი, რომელიც მხოლოდ საბოლოო ფლუორესცენციას აფიქსირებს, ამ ორ ეფექტს ერთმანეთში აურევდა.

ანალიზს მაინც აქვს ხარვეზების წყაროები და მეთილენის ლურჯი რამდენიმე მათგანს ავლენს. საღებავი ფართოდ შთანთქავს სინათლეს იმავე წითელ დიაპაზონში, სადაც რეზორუფინი ასხივებს, ამიტომ საღებავის მაღალი კონცენტრაციისას ნიმუშმა შიდა ფილტრის ეფექტებით შეიძლება საკუთარი სიგნალი დაფაროს. შესაბამისად, სტანდარტებში საღებავის კონცენტრაცია ისეთივე უნდა იყოს, როგორიც ნიმუშებშია. Amplex Red-ს თავადაც შეუძლია ფოტოჟანგვა, ხოლო მის პროდუქტს, რეზორუფინს, შეუძლია ფოტორედოქსულ ციკლში ჩართვა, რომელიც სუპეროქსიდსა და პეროქსიდს წარმოქმნის. ამას განსაკუთრებით დიდი მნიშვნელობა აქვს, როცა ექსპერიმენტში ფოტოსენსიბილიზატორიც ნათდება. პრაქტიკული გამოსავალია ჯერ მეთილენის ლურჯის ნიმუშების დასხივება, შემდეგ კი მათი ალიკვოტების Amplex-ის რეაგენტებით სიბნელეში გაანალიზება, ნაცვლად საღებავისა და ზონდის ერთად განათებისა. დაბოლოს, სუპეროქსიდდისმუტაზა Amplex-ის სიგნალს უბრალოდ არ თრგუნავს: სუპეროქსიდის პეროქსიდად გარდაქმნამ შეიძლება სიგნალი გაზარდოს. SOD-ის საკონტროლო ცდა, რომელიც ფლუორესცენციას ზრდის, წარუმატებელი არ არის. მან სუპეროქსიდი რეაქციის წინმსწრებ ფორმად გამოავლინა.

DCFDA: ჟანგვის არასპეციფიკური ინდიკატორი

მეთილენის ლურჯისა და DCFDA-ს შეხამება გაუგებრობების უმეტესობის წყაროა. DCFH-DA უჯრედში შესატანი წინამორბედია. უჯრედის შიგნით ესტერაზები მას აცეტატის ჯგუფებს აცლიან და ტოვებენ არაფლუორესცენტულ DCFH-ს, რომლის დაჟანგვითაც ფლუორესცენტული DCF მიიღება. მის დამჟანგავთა სია გრძელია: ჰიდროქსილის რადიკალები, პეროქსიდაზისა და ჰემის შუალედური პროდუქტები, აზოტის დიოქსიდი, ჰიპოქლოროვანი მჟავა და პეროქსინიტრიტისგან წარმოქმნილი რადიკალები. მხოლოდ წყალბადის პეროქსიდი მას პირდაპირ არცერთი პრაქტიკულად გამოსადეგი სიჩქარით არ ჟანგავს; პეროქსიდზე დამოკიდებულ ფლუორესცენციას, როგორც წესი, პროცესში რკინის, ჰემის შემცველი ცილების ან პეროქსიდაზული ქიმიის მონაწილეობა სჭირდება.

კრიტიკული შეფასება, რომელიც მეთოდების ყოველ განყოფილებაში უნდა იყოს ციტირებული, კალინარამანისა და მისი კოლეგების მიერ DCFH-ის ზონდად გამოყენების ანალიზიდან მოდის. როგორც შეჯამებულია ტვინის მიტოქონდრიების კვლევაში, რომელმაც ამ მიზეზით DCFDA უარყო, მათ აჩვენეს, რომ საღებავი ნელა რეაგირებს, დაუხასიათებელი სტოიქიომეტრიით, სათანადო კალიბრაციის გარეშე და იმ ნაერთებთანაც, რომლებიც ROS-ს არ მიეკუთვნება. ზონდი იმასაც აძლიერებს, რასაც ზომავს: DCFH-ის ერთელექტრონიანი დაჟანგვა წარმოქმნის DCF-ის რადიკალს, რომელიც ჟანგბადთან რეაგირებს და სუპეროქსიდს წარმოქმნის, ეს უკანასკნელი კი დისმუტაციის შედეგად დამატებით პეროქსიდად გარდაიქმნება. მაჩვენებელი ნაწილობრივ თავად ქმნის იმ ქიმიურ პროცესებს, რომლებსაც ასახავს.

ეს ყველაფერი DCFDA-ს უსარგებლოს არ ხდის. ის სკრინინგის საშუალებად რჩება და არა იდენტიფიკაციის მეთოდად. DCF-ის ფლუორესცენციის მატება ნიშნავს, რომ გაიზარდა ოქსიდანტზე დამოკიდებული ზონდის დაჟანგვა. ეს არ ნიშნავს პეროქსიდის მატებას და მით უმეტეს არ ნიშნავს საერთო ROS-ის მატებას — ამ სიდიდეს ვერცერთი ცალკეული ზონდი ვერ ზომავს. მეთილენის ლურჯის ადრეულ კვლევებში, რომლებიც ერთ მიკრომოლარზე მაღალ კონცენტრაციებზე DCF-ის დაჟანგვას ეყრდნობოდა, პროოქსიდანტური ეფექტები აღირიცხა, მაშინ როცა იმავე პერიოდის სხვა სისტემებში პეროქსიდით გამოწვეული უჯრედული სიკვდილისგან დაცვა აღიწერა. სხვადასხვა რედოქსულ კონტექსტში ერთი და იმავე საღებავისთვის ორივე დაკვირვება შეიძლება ჭეშმარიტი იყოს, ხოლო მხოლოდ DCF-ის შედეგი ვერ გვეტყვის, რომელმა ოქსიდანტმა განაპირობა სიგნალი. ტვინის მიტოქონდრიების ადრეული კვლევის მნიშვნელობა ისაა, რომ მან ეს სკრინინგი პეროქსიდის კალიბრირებული გაზომვით ჩაანაცვლა და დატვირთვა უშუალოდ გამოავლინა: საღებავის ასი ნანომოლარიც კი პეროქსიდის გამოყოფას რამდენჯერმე ზრდიდა ყველა შემოწმებული სუბსტრატისა და სუნთქვის მდგომარეობის პირობებში.

DCFDA-ს მეთილენის ლურჯისთვის სპეციფიკური კიდევ ერთი ხაფანგი ახლავს. საღებავს ინტენსიური შეფერილობა აქვს და რედოქსულად აქტიურია, ამიტომ მას შეუძლია ფლუორესცენციის გაუფერულება, გამოსხივების ჩაქრობა ან ზონდის დაჟანგვა უჯრედული ROS-ისგან დამოუკიდებლად. უჯრედების გარეშე ჩატარებული საკონტროლო ცდა, რომელიც საღებავსა და ზონდს შეიცავს, არჩევითი დამატება არ არის. ეს ის ექსპერიმენტია, რომელიც გიჩვენებთ, ურთიერთქმედებს თუ არა საღებავი ზონდთან.

სპინური დაჭერა და ჟანგბადის მოხმარება: იდენტობა და ნაკადი

ფლუორესცენტული ზონდები გვატყობინებს, რომ რაღაც დაჟანგვადი წარმოიქმნა, ხოლო ელექტრონული სპინური რეზონანსი სპინური დამჭერებით უფრო ახლოს მიდის პასუხთან, თუ რა იყო ეს. მეთილენის ლურჯის ფოტოქიმიის კლასიკურ კვლევაში გამოიყენეს ESR საღებავის, ასკორბატისა და სინათლის მონაწილეობით წარმოქმნილი ასკორბატის რადიკალის გამოსავლენად, შემდეგ კი ჟანგბადის მოხმარების ექსპერიმენტებში აჩვენეს პეროქსიდის წარმოქმნა, ხოლო სპინური დაჭერის ცდებში — რკინით კატალიზებული ჰიდროქსილის რადიკალის წარმოქმნა. თითოეული ტექნიკა პასუხობდა კითხვას, რომელსაც დანარჩენები ვერ პასუხობდა: ESR-მა რადიკალის იდენტობა დაადგინა, ჟანგბადის მოხმარებამ რეაქციის ნაკადი აჩვენა ნებისმიერი ფლუორესცენტული ზონდისგან დამოუკიდებლად, ხოლო მათმა კომბინაციამ გამოავლინა, რომ ერთსა და იმავე განათებულ სისტემაში სინგლეტური ჟანგბადის გზაც მოქმედებდა და რადიკალური გზებიც.

1984 წლის ეს შედეგი დღესაც გაფრთხილებად ჟღერს. განათებისა და აღმდგენი აგენტის არსებობისას საღებავი პეროქსიდს წარმოქმნიდა, ხოლო რკინის არსებობისას სისტემა წარმოქმნიდა ჰიდროქსილის რადიკალს — ამ ჯგუფში ყველაზე რეაქტიულ ფორმას. ავტორებმა ეს თვალში არსებულ ასკორბატს დაუკავშირეს და დაუფიქრებელი ოფთალმოლოგიური გამოყენება ეჭვქვეშ დააყენეს. თანამედროვე მკითხველმა პირობებს უნდა მიაქციოს ყურადღება: სინათლე, აღმდგენი აგენტი და რკინა. რომელიმე მათგანის მოცილებისას გზა სუსტდება ან ქრება.

ჟანგბადის ელექტროდები თავის ღირებულებას სხვაგვარად ამტკიცებს. კლარკის ტიპის ელექტროდი ჟანგბადის ჯამურ მოხმარებას ზომავს, რაც ადასტურებს, რომ საღებავით განპირობებული რედოქსული პროცესები მოლეკულურ ჟანგბადს მოიხმარს, და იძლევა კინეტიკურ მონაცემებს, რომელთა იმიტაციაც ვერცერთ ფლუორესცენციულ არტეფაქტს ვერ შეუძლია. ის პროდუქტს არ ადგენს. პეროქსიდისა და სუპეროქსიდის წარმოქმნა, წყლის წარმოქმნა და სინგლეტური ჟანგბადის დაშლა — ყველა ჟანგბადს მოიხმარს. ნაკადი იდენტობის გარეშე ისეთივე არასრულია, როგორც იდენტობა ნაკადის გარეშე; ამიტომ ძლიერ ნაშრომებში ელექტროდს პეროქსიდის კალიბრირებულ ანალიზთან ან დამჭერთან აერთიანებენ.

რატომ ეწინააღმდეგება ერთმანეთს ანტიოქსიდანტური შედეგები

თუ ამ სამ მაჩვენებელს გვერდიგვერდ განვიხილავთ, მეთილენის ლურჯის შესახებ ლიტერატურაში მოჩვენებითი წინააღმდეგობები მეთოდებს შორის განსხვავებებითა და სამი ბიოლოგიური ფაქტით აიხსნება.

პირველი: საღებავი ერთდროულად ელექტრონების გადამტანიცაა და პეროქსიდის წყაროც. სუნთქვითი ჯაჭვის იმ უბნებიდან ელექტრონების გადამისამართებით, სადაც ჟანგბადი სხვაგვარად სუპეროქსიდად გარდაიქმნებოდა, მას შეუძლია ერთი ROS შეამციროს, მაშინ როცა მისი აღდგენილი ფორმა ჟანგბადს უშუალოდ პეროქსიდამდე აღადგენს და სხვას ზრდის. ამიტომ ლაბორატორია, რომელიც მიტოქონდრიულ რედოქსულ ქიმიასა და საღებავის შემოვლითი გზის ფუნქციას იკვლევს, ზონდზე დამოკიდებულ პასუხებს უნდა ელოდეს: ერთსა და იმავე კიუვეტაში სუპეროქსიდზე მგრძნობიარე მაჩვენებელი იკლებს, ხოლო პეროქსიდის მაჩვენებელი იზრდება.

მეორე: დაბალ დოზებზე პეროქსიდი სიგნალია და არა მხოლოდ დაზიანების წყარო. ადრეული ნაშრომის შემდგომმა თაგვის ტვინის მიტოქონდრიების კვლევამ აჩვენა პეროქსიდის წარმოქმნა საღებავის სულ მცირე ორმოცდაათი ნანომოლარის კონცენტრაციიდან, თერაპიულ დონეებზე მიტოქონდრიული დნმ-ის დაზიანების გარეშე, ხოლო წინასწარი დამუშავების შემდეგ — როტენონით გამოწვეული დაზიანებებისგან დაცვა. მხოლოდ ასი მიკრომოლარის კონცენტრაციაზე, რაც თერაპიულ დიაპაზონს ბევრად აღემატება, აზიანებდა საღებავი დნმ-ის შერჩეულ ფრაგმენტებს, ხოლო წითელი სინათლე და საღებავის ოცი მიკრომოლარი წარმოქმნიდა სინგლეტურ ჟანგბადს, რომელიც ყველა შემოწმებულ ფრაგმენტს აზიანებდა. შემოთავაზებული მექანიზმი ჰორმეზისულია: პეროქსიდის მცირე წარმოქმნა ააქტიურებს Nrf2-თან დაკავშირებულ ანტიოქსიდანტურ დაცვასა და მიტოქონდრიულ ბიოგენეზს, ამიტომ მოკლევადიან პროოქსიდანტურ მაჩვენებელს უფრო გრძელვადიანი ანტიოქსიდანტური შედეგი მოსდევს. ერთი საათის შემდეგ წაკითხული ანალიზი და ერთი დღის შემდეგ წაკითხული ანალიზი შეიძლება ერთმანეთს არ ემთხვეოდეს, რადგან ამ შუალედში ბიოლოგია შეიცვალა.

მესამე: სინათლე განსაზღვრავს იმასაც კი, თუ რომელი მოლეკულა არის სისტემაში. განათება საღებავის დემეთილირებას იწვევს Azure B-სა და მონათესავე პროდუქტების წარმოქმნით, ხოლო ჭურჭლის თავზე მიკროსკოპის ნათურაც საკმარისია მის ფოტოსენსიბილიზაციისთვის. სიბნელეში და განათებისას ჩატარებული ექსპერიმენტები სხვადასხვა ექსპერიმენტია და ნებისმიერი პროტოკოლის განათებისა და საღებავთან მოპყრობის კონტროლების განყოფილებამ ისინი სწორედ ასე უნდა განიხილოს.

კონტროლების მინიმალური ნაკრები და ნებისმიერი მტკიცების შეფასება

ქვემოთ მოცემული შედარება ამ სტატიისთვის შექმნილი საცნობარო მასალაა. მეთილენის ლურჯთან დაკავშირებული ROS-ის ნებისმიერი შედეგის მიღებამდე შეამოწმეთ, რომელი მწკრივის მოთხოვნა შეასრულეს ავტორებმა და რომელი გამოტოვეს.

აქედან შეფასების პრაქტიკული წესი გამომდინარეობს. კალიბრირებული Amplex პეროქსიდაზასთან ერთად, კატალაზით გადამოწმებით, პეროქსიდის შესახებ მტკიცებულებაა. DCFDA ზონდის არასპეციფიკური დაჟანგვის შესახებ მტკიცებულებაა და მეტი არაფერი. სპინური დაჭერა რადიკალების დამჭერი აგენტებით ჩატარებულ კონტროლებთან ერთად რადიკალის იდენტობის შესახებ მტკიცებულებაა. ჟანგბადის მოხმარება ნაკადის შესახებ მტკიცებულებაა. წინადადება, რომელიც იმაზე მეტს ამტკიცებს, ვიდრე მის ანალიზს შეუძლია დაასაბუთოს, როგორი თავდაჯერებითაც უნდა იყოს დაწერილი, ზონდზე საუბრობს და არა საღებავზე. დოზაზე დამოკიდებულებისა და ჰორმეზისული დიაპაზონის, მიტოქონდრიული ელექტრონული ნაკადის, შეღებილ ნიმუშებში ანალიზის ხელისშემშლელი ეფექტების და მიკროსკოპიის განათებით გამოწვეული არტეფაქტების შესახებ დაკავშირებული განხილვები თითოეულ ამ საკითხს ავრცობს, და თითოეული ძალაში რჩება მას შემდეგაც, რაც მისი დროებითი მითითება შეიცვლება.