მეთილენის ლურჯით მარტივი შეღებვა და გრამით შეღებვა: რისი დადასტურება შეუძლია თითოეულ მეთოდს

სტუდენტი ამზადებს ნაცხს კულტურისგან, რომელსაც E. coli აწერია, ერთი წუთით ფარავს მას მეთილენის ლურჯით, ავლებს წყალს და აკვირდება ზეთოვანი იმერსიის ობიექტივით. მხედველობის არე სავსეა ლურჯი ჩხირებით. ლაბორატორიულ ანგარიშში წერია: „გრამუარყოფითი ჩხირები იდენტიფიცირებულია, როგორც E. coli.“ დაკვირვება სწორია. თუმცა ეს პრეპარატი ასეთ დასკვნას არ ამყარებს.

შეცდომა კონცეპტუალურია და არა ტექნიკური. სტუდენტმა მარტივი შეღებვა დიფერენციულ ტესტად მიიჩნია. მარტივი შეღებვა და გრამით შეღებვა სხვადასხვა კითხვას პასუხობს, რადგან შეღებვის განსხვავებულ პრინციპებს ეფუძნება. ერთი კითხულობს: რა ფორმის უჯრედებია წარმოდგენილი. მეორე კითხულობს: როგორ იქცევა უჯრედის კედელი საცდელი ზემოქმედებისას. ამ ორის აღრევის შემთხვევაში სწორად შეღებილი პრეპარატიც კი დაუსაბუთებელ ანგარიშს წარმოშობს.

ეს შედარება ერთმანეთისგან მიჯნავს ორ მეთოდს, აჩვენებს, რა მტკიცების საფუძველს იძლევა თითოეული შედეგი, და პასუხობს სტუდენტების ორ ყველაზე ხშირ კითხვას: შეიძლება თუ არა მეთილენის ლურჯის გამოყენება გრამით შეღებვაში და რას აჩვენებს სინამდვილეში E. coli-ის მეთილენის ლურჯით შეღებვა.

მოკლე პასუხი

მეთილენის ლურჯით მარტივი შეღებვა ყველა შეღებვად უჯრედს ერთსა და იმავე ლურჯ ფერს აძლევს, ამიტომ აჩვენებს მორფოლოგიას (ჩხირები, სფეროები, სპირალები) და განლაგებას (ცალ-ცალკე, წყვილებად, ჯაჭვებად), მაგრამ არაფერს ამბობს გრამის კატეგორიაზე. გრამით შეღებვა ამატებს იოდს, გაუფერულების ეტაპსა და დამატებით საღებავს, ამიტომ ბაქტერიებს ყოფს გრამდადებითებად (იისფერი) და გრამუარყოფითებად (ვარდისფერი ან წითელი) იმის მიხედვით, თუ როგორ ინარჩუნებს მათი გარსი საღებავს. მეთილენის ლურჯით შეღებვის შემდეგ ლურჯი ჩხირები ნიშნავს: „წარმოდგენილია ჩხირისებრი უჯრედები.“ გრამით შეღებვის სრული თანმიმდევრობის შემდეგ ვარდისფერი ჩხირები ნიშნავს: „წარმოდგენილია გრამუარყოფითი ჩხირები.“ მეორე მტკიცება უფრო ძლიერია, რადგან პროცედურამ დამატებითი ტესტი ჩაატარა.

ერთსაღებავიანი ბაქტერიული მეთოდების უფრო ფართო ჯგუფის გასაცნობად, რომელსაც ეს სტატიაც მიეკუთვნება, იხილეთ მიკროსკოპიული შეღებვის ატლასი.

მარტივი შეღებვა: ერთი საღებავი, ერთი კითხვა

მეთილენის ლურჯი ფუძოვანი (კათიონური) საღებავია. მისი ფერადი იონი დადებითადაა დამუხტული და უკავშირდება უჯრედში არსებულ უარყოფითად დამუხტულ სტრუქტურებს, მათ შორის ნუკლეინის მჟავებსა და ზედაპირის მჟავურ ჯგუფებს, ამიტომ უჯრედები ღია ფონზე ლურჯად ჩანს. OpenStax შეღებვის შესახებ თავში აღწერს დადებითი შეღებვის ამ პრინციპს. თავად საღებავის კათიონი ფენოთიაზინის მცირე ზომის ბრტყელი იონია, რომელიც დეტალურადაა განხილული მეთილენის ლურჯის ქიმიის ცნობარში; ქლორიდის საწინააღმდეგო იონი შეფერილობას არ განაპირობებს.

სტანდარტული სასწავლო პროტოკოლი განზრახ მარტივია: მოამზადეთ თხელი ნაცხი, გააშრეთ ჰაერზე, დააფიქსირეთ გაცხელებით, დაახლოებით ერთი წუთით დაფარეთ მეთილენის ლურჯის დაახლოებით 1%-იანი წყალხსნარით, ფრთხილად გაავლეთ წყალი, შეაშრეთ შემწოვი ქაღალდით და შეისწავლეთ ზეთოვანი იმერსიით. LibreTexts-ის სასწავლო პროტოკოლი სწორედ ამ 1%-იან, ერთწუთიან ვარიანტს აღწერს და აღნიშნავს, რომ ზოგი ლაბორატორია დროს ახანგრძლივებს. არც საღებავის დამამაგრებელი, არც გამაუფერულებელი, არც მეორე საღებავი. სწორედ ეს არარსებობაა არსებითი. როდესაც მხოლოდ ერთი საღებავია და შერჩევითი მოცილება არ ხდება, ყველა უჯრედი, რომელიც საღებავს იკავშირებს, საბოლოოდ ერთსა და იმავე ფერს იღებს.

E. coli-ის შემთხვევაში მოსალოდნელია ლურჯი ჩხირები (ბაცილები), ცალ-ცალკე, წყვილებად ან მცირე ჯგუფებად. ლურჯი ფერი საღებავისგან მოდის. ჩხირისებრი ფორმა ორგანიზმის თვისებაა. თუმცა ეს კომბინაცია ორგანიზმს ვერ განსაზღვრავს, რადგან მრავალი სახეობა ჩხირისებრია და მარტივი შეღებვისას მრავალი ჩხირი ლურჯად იღებება. ATCC მიკრობიოლოგიური კულტურების სახელმძღვანელოში მკაფიოდ აღნიშნავს, რომ ეს მეთოდი მხოლოდ მორფოლოგიით შემოიფარგლება. სწორი ანგარიში ასე იკითხება: „დაფიქსირდა ლურჯი ბაცილები.“ ფორმისა და განლაგების მიღმა ნებისმიერი დასკვნა დამატებით მტკიცებულებას საჭიროებს.

გრამით შეღებვა: ოთხი რეაგენტი, ერთი ქცევითი ტესტი

გრამით შეღებვა დიფერენციული შეღებვაა. ყველა უჯრედი ერთსა და იმავე თანმიმდევრობას გადის და განისაზღვრება, რომელი ინარჩუნებს პირველ საღებავს და რომელი კარგავს მას. ამერიკის მიკრობიოლოგიის საზოგადოების გრამით შეღებვის პროტოკოლები განსაზღვრავს სტანდარტულ ოთხეტაპიან თანმიმდევრობას: კრისტალური იისფერი (პირველადი საღებავი), გრამის იოდი (საღებავის დამამაგრებელი), სპირტი ან აცეტონ-სპირტი (გამაუფერულებელი), შემდეგ კი საფრანინი (დამატებითი საღებავი).

სტანდარტული სასწავლო მოდელი ამ დაყოფას გარსის აგებულებით ხსნის. გრამდადებით უჯრედებს პეპტიდოგლიკანის სქელი კედელი აქვთ, რომელიც სპირტით ჩამორეცხვისას დეჰიდრატირდება და კრისტალური იისფრისა და იოდის კომპლექსს ინარჩუნებს. გრამუარყოფით უჯრედებს პეპტიდოგლიკანის თხელი შრე და ლიპიდებით მდიდარი გარე მემბრანა აქვთ; გამაუფერულებელი ამ მემბრანას არღვევს, ამიტომ კომპლექსი გამოირეცხება და უჯრედები შემდეგ საფრანინს იკავშირებს. NCBI Bookshelf-ის გრამით შეღებვის მიმოხილვა უჯრედის კედელზე დაფუძნებულ ამ ახსნას გვთავაზობს. სპეციალისტები დასძენენ, რომ სრული ფიზიკურ-ქიმიური მექანიზმი მხოლოდ კედლის სისქეზე რთულია, თუმცა ლაბორატორიული ინტერპრეტაციისთვის ქცევითი წესი ძალაში რჩება: იისფერი ნიშნავს, რომ საღებავი შენარჩუნდა, ვარდისფერი კი — რომ ის დაიკარგა და შემდეგ უჯრედი დამატებითი საღებავით შეიღება.

საილუსტრაციო პანელები. სტილიზებული ნახატები მეთოდების შესადარებლად და არა კამერით გადაღებული მიკროფოტოგრაფიები. ფერები გამარტივებულია ლოგიკის ასახსნელად: ერთი ფერი მარტივი შეღებვისას, ორი ფერი გრამის მეთოდით გაუფერულების შემდეგ.

შეიძლება თუ არა მეთილენის ლურჯის გამოყენება გრამით შეღებვაში

ამ კითხვას ორი მნიშვნელობა აქვს და თითოეულს განსხვავებული პასუხი სჭირდება.

პირველი მნიშვნელობა: შეუძლია თუ არა მეთილენის ლურჯის ერთჯერად დასხმას გრამით შეღებვის მთელი თანმიმდევრობის ჩანაცვლება. არა. იოდის, გამაუფერულებლისა და დამატებითი საღებავის გარეშე დიფერენციული ეტაპი არ არსებობს, ამიტომ გრამის კატეგორია არ მოწმდება. მხოლოდ მეთილენის ლურჯის გამოყენების შემდეგ მიღებული ლურჯი ველი მარტივი შეღებვის შედეგია მაშინაც კი, თუ მისი ბოთლი გრამის რეაგენტების გვერდით დგას. ნუ ჩაიწერთ მას გრამით შეღებვის შედეგად.

მეორე მნიშვნელობა: შეუძლია თუ არა მეთილენის ლურჯს საფრანინის ჩანაცვლება დამატებით საღებავად მე-4 ეტაპზე. ფუნქციურად მას შეუძლია გაუფერულებული უჯრედების შეღებვა, ხოლო სახელმძღვანელოს სავარჯიშო ასეთი ჩანაცვლების შემდეგ იისფერ გრამდადებით და ლურჯ გრამუარყოფით უჯრედებს პროგნოზირებს. ლოგიკა გამართლებულია, რადგან სწორად გაუფერულებული გრამუარყოფითი უჯრედები თითქმის უფეროა და სხვა კათიონურ საღებავსაც შეიკავშირებს. თუმცა ეს სტანდარტული პროტოკოლი არ არის. ASM-ის პროტოკოლებში მითითებულია საფრანინი, ზოგიერთ ვარიანტში კი — ისეთი აღიარებული ალტერნატივები, როგორიცაა ფუძოვანი ფუქსინი, და არა მეთილენის ლურჯი. არსებობს პრაქტიკული ნაკლიც: ლურჯისა და იისფრის გარჩევა უფრო რთულია, ვიდრე ვარდისფრისა და იისფრის, განსაკუთრებით დამწყებთათვის და განსაკუთრებით მიკროსკოპის დასუსტებული განათებისას. სასწავლო სამუშაოსა და ნებისმიერი მნიშვნელოვანი შედეგისთვის გამოიყენეთ თქვენს პროტოკოლში დასახელებული დამატებითი საღებავი, ჩვეულებრივ საფრანინი, ხოლო მეთილენის ლურჯით დამატებითი შეღებვა განიხილეთ სადემონსტრაციო ვარიანტად და არა ეკვივალენტურ სტანდარტად.

დაკავშირებული კითხვა — როგორ განსხვავდება მეთილენის ლურჯი სხვა ერთსაღებავიანი ვარიანტებისგან — განხილულია ბაქტერიების მარტივი შეღებვის მეთოდების შედარებაში.

რას ადასტურებს E. coli-ის მეთილენის ლურჯით შეღებვა და რას — არა

E. coli გრამუარყოფითი ჩხირია, მაგრამ ეს წინადადება რამდენიმე მეთოდით მიღებულ ფაქტებს აერთიანებს: მორფოლოგიას — მიკროსკოპიიდან, გრამის რეაქციას — გრამით შეღებვიდან, სახეობრივ იდენტობას — კულტივირებისა და ბიოქიმიური ან მოლეკულური ტესტირებისგან. მეთილენის ლურჯით შეღებილი ნაცხი მხოლოდ პირველ ნაწილს გვაწვდის. ის ადგენს, რომ შეღებილ ნიმუშში ჩხირისებრი უჯრედებია და აჩვენებს მათ განლაგებას. ის ვერ ადგენს გრამის რეაქციას, რადგან გაუფერულების გამოცდა არ ჩატარებულა. ის ვერ განსაზღვრავს სახეობას, რადგან ამ გარჩევადობის პირობებში მრავალი სახეობის ჩხირები ერთმანეთს ჰგავს.

სწორედ აქ ჩნდება ანგარიშებში პროგნოზირებადი შეცდომა. ავტორი წინასწარ ცოდნას („ეს კულტურა წესით E. coli უნდა იყოს, ხოლო E. coli გრამუარყოფითია“) დაკვირვების ჩანაწერში გადაიტანს, რის გამოც იქმნება შთაბეჭდილება, თითქოს პრეპარატმა დაადასტურა ის, რაც სინამდვილეში მხოლოდ ვარაუდი იყო. უფრო ზუსტი ანგარიში ამ დონეებს ერთმანეთისგან მიჯნავს: „მეთილენის ლურჯით მარტივი შეღებვა: დაფიქსირდა ლურჯი ბაცილები; მხოლოდ მორფოლოგია, გრამის კატეგორია არ შემოწმებულა.“ შემდეგ, თუ გრამით შეღებვა სწორად, კონტროლებთან ერთად ჩატარდა: „გრამით შეღებვა: ვარდისფერი ჩხირები, რაც გრამუარყოფით რეაქციას შეესაბამება.“ სახეობრივი იდენტობა მოგვიანებით დგინდება, იდენტიფიკაციის სამუშაო პროცესით და არა მხოლოდ ფერით.

ინტერპრეტაციის პრაქტიკული გზამკვლევი

ლაბორატორიულ სამუშაო ადგილზე გამოიყენეთ ეს გადაწყვეტილების წესი. თუ ყველა უჯრედი ერთი ფერისაა და პროტოკოლში გამოყენებული იყო ერთი საღებავი გამაუფერულებლის გარეშე, ჩატარდა მარტივი შეღებვა. მიუთითეთ ფორმა, ზომის შეფასება და განლაგება. ამით შემოიფარგლეთ. თუ პროტოკოლში გამოიყენეთ კრისტალური იისფერი, იოდი, გამაუფერულებელი და დამატებითი საღებავი ცნობილ დადებით და უარყოფით კონტროლებთან ერთად, ჩატარდა გრამით შეღებვა. მიუთითეთ ფერი და მორფოლოგია: იისფერი კოკები ჯაჭვებად, ვარდისფერი ჩხირები და ასე შემდეგ.

აღრევის უმეტესობას სამი შეცდომა იწვევს. პირველი — ლურჯი ჩხირების E. coli-ის დადასტურებად მიჩნევა. მეორე — მეთილენის ლურჯით შეღებილი პრეპარატის რვეულში „გრამით შეღებვის“ სათაურის ქვეშ ჩაწერა, რასაც შემდგომი მკითხველები არასწორად გაიგებენ. მესამე — დამატებითი საღებავების დაუფიქრებლად ჩანაცვლება და შემდეგ სხვადასხვა ლაბორატორიაში მიღებული ფერების შედარება ისე, თითქოს ფერთა პალიტრები ერთმანეთს ემთხვეოდეს. სამივე შეცდომას ერთი გამოსავალი აქვს: დაასახელეთ რეალურად ჩატარებული მეთოდი და ამტკიცეთ მხოლოდ ის, რასაც ეს მეთოდი ამოწმებს.

მარტივი შეღებვა თავის ადგილს სწორედ იმიტომ იმსახურებს, რომ მცირე მოცულობის დასკვნის საშუალებას იძლევა. ის სწრაფია, მცირე ტექნიკური შეცდომებისადმი ტოლერანტულია და საკმარისია, როდესაც კითხვა მორფოლოგიას ეხება: არის თუ არა საერთოდ რამე და რა ფორმა აქვს მას. როდესაც კითხვა კლასიფიკაციას ეხება, ჩაატარეთ დიფერენციული ტესტი. ლურჯი პრეპარატი გიჩვენებთ, როგორ გამოიყურება უჯრედები. იისფერი ან ვარდისფერი პრეპარატი გიჩვენებთ, როგორ იქცევა მათი კედლები. ცალკე აღებული არცერთი პრეპარატი არ გეუბნებათ, რომელ სახეობას ეკუთვნის უჯრედები.