მეთილენის ლურჯი, Nrf2 და მიტოქონდრიული ბიოგენეზი: რა გაიზომა და რა რჩება ვარაუდად

მეთილენის ლურჯის შესახებ ტექსტებში ხშირად გვხვდება ერთი წინადადება: ის ააქტიურებს Nrf2-ს და ქმნის ახალ მიტოქონდრიებს. ეს წინადადება ერთ მტკიცებად იკითხება, მაგრამ შეიცავს ორ განსხვავებულ ცნებას, რომლებიც სხვადასხვა სისტემაში, სხვადასხვა ტიპის მტკიცებულებებით შეისწავლეს. პირველი სასიგნალო გზაა — სენსორი, რომელიც დამცავ გენებს ააქტიურებს. მეორე კი შენების პროგრამაა — უჯრედი მეტ მიტოქონდრიულ აპარატს ქმნის. სიგნალმა შეიძლება შენება დაიწყოს, მაგრამ სიგნალის ამოქმედების ჩვენება არ ნიშნავს იმის ჩვენებას, რომ შენობა აიგო; მეტი სამშენებლო მასალის ჩვენება კი არ ნიშნავს უკეთესი ენერგომომარაგების ჩვენებას. ამ სტატიაში ეს სამი რამ ერთმანეთისგან გამიჯნულია.

Nrf2-ის ცნება: სენსორი და არა ფარი

Nrf2 (ერითროიდულ ბირთვულ ფაქტორ 2-თან დაკავშირებული ფაქტორი 2) ტრანსკრიფციის ფაქტორია — ცილა, რომლის ფუნქცია გენების გააქტიურებაა. მოსვენებულ მდგომარეობაში მას ციტოპლაზმაში აკავებს სენსორული ცილა Keap1, რომელიც Nrf2-ს უჯრედის უტილიზაციის აპარატს უწყვეტი დაშლისთვის გადასცემს. როდესაც ოქსიდანტები ან ელექტროფილები Keap1-ის რეაქტიულ ცისტეინებს ცვლიან, დაშლა წყდება. ახლად წარმოქმნილი Nrf2 გროვდება, ბირთვში გადადის, მცირე Maf ცილებს უერთდება და უკავშირდება დნმ-ის თანმიმდევრობებს, რომლებსაც ანტიოქსიდანტური პასუხის ელემენტები ეწოდება. ეს შეკავშირება დამცავი გენების მთელ ჯგუფს ააქტიურებს.

ამ გზის კანონიკური მაჩვენებლები კონკრეტულია. NQO1 (NAD(P)H ქინონ-დეჰიდროგენაზა 1) და TrxR1 (თიორედოქსინ-რედუქტაზა 1) Nrf2-ის ყველაზე სანდო სამიზნე გენებს შორისაა. HO-1 (ჰემოქსიგენაზა-1) ძლიერ ინდუცირებადია, თუმცა სხვა რეგულატორებსაც პასუხობს. ფერმენტები, როგორიცაა SOD და კატალაზა, ანტიოქსიდანტური აპარატის ნაწილია, მაგრამ მათ დონეებს მრავალი ტრანსკრიფციის ფაქტორი აკონტროლებს, ამიტომ SOD-ის მატება თავისთავად არ ამტკიცებს, რომ მიზეზი Nrf2 იყო. სასიგნალო მოვლენასთან ყველაზე ახლოს მდგომი მტკიცებულებაა ბირთვში Nrf2-ის დაგროვება, ARE რეპორტერის გააქტიურება ან კანონიკური სამიზნეების ინდუქცია, რომელიც Nrf2-ის მოცილებისას ქრება. ყველაფერი დანარჩენი — ოქსიდანტების დაბალი დონე, სტრესის პირობებში უკეთესი გადარჩენა, გლუტათიონის მაღალი დონე — შემდგომი ეფექტია, რომლის გამოწვევაც მრავალ გზას შეუძლია.

ამ ისტორიაში მეთილენის ლურჯთან დაკავშირებული ყველაზე ადრეული შედეგი ამ სკალის სასიგნალო მოვლენასთან ახლო ნაწილს შეესაბამება. მეთილენის ლურჯის ნანომოლარული კონცენტრაციების ზემოქმედების ქვეშ მყოფ ფიბრობლასტებში შეინიშნებოდა დაბერების შეფერხება, IV კომპლექსის გაზრდილი შემცველობა, ჟანგბადის გაზრდილი მოხმარება და მე-2 ფაზის ფერმენტების, TrxR1-ისა და NQO1-ის, ინდუქცია, როგორც აღწერილია კვლევაში, რომელმაც პირველად დაუკავშირა მეთილენის ლურჯი მიტოქონდრიული ფუნქციის გაძლიერებასა და დაბერების შეფერხებას. TrxR1 და NQO1 სწორედ ის კანონიკური Nrf2 სამიზნეებია, რომელთა ნახვაც ყურადღებიან მკითხველს სურს. კვლევას თავად სასიგნალო მოვლენა არ უჩვენებია: არ გაზომილა ბირთვული Nrf2, არ გამოყენებულა ARE რეპორტერი და არც Nrf2-ის ნოკაუტის საკონტროლო მოდელი. ამიტომ კეთილსინდისიერი ინტერპრეტაცია ასეთია: ამ სისტემაში მეთილენის ლურჯი Nrf2-ის ცნობილ სამიზნე გენებს ინდუცირებს, რაც Nrf2-ის გააქტიურებასთან თავსებადია, თუმცა Nrf2-ს მიზეზად ცალსახად არ გამოყოფს. სამიზნე გენის ინდუქცია ჩამრთველის ამოქმედებიდან ერთი ნაბიჯით ქვემოთაა.

ბიოგენეზის ცნება: პროგრამა სამი საკონტროლო წერტილით

მიტოქონდრიული ბიოგენეზი პროგრამაა, რომლის მეშვეობითაც უჯრედი თავის მიტოქონდრიულ პოტენციალს ზრდის. სახელმძღვანელოში აღწერილი მისი იერარქია სამ საკონტროლო წერტილს გადის. პირველ ეტაპზე კოაქტივატორი PGC-1alpha პროგრამას რთავს. მეორე ეტაპზე ბირთვული ტრანსკრიფციის ფაქტორები (დამაბნეველია, რომ ერთ-ერთს NRF1, ბირთვული რესპირაციული ფაქტორი 1, ეწოდება — ეს Nrf2-ისგან განსხვავებული ცილაა) მიტოქონდრიული გენების ექსპრესიას წარმართავენ, მათ შორის TFAM-ის, რომელიც მიტოქონდრიული დნმ-ის შენარჩუნებასა და რეპლიკაციას უზრუნველყოფს. მესამე ეტაპზე უჯრედს მეტი მიტოქონდრიული გენომი და მეტი რესპირაციული აპარატი აქვს, რაც იზომება mtDNA-ის ასლების რაოდენობით, ციტრატსინთაზის აქტივობით ან რესპირაციული კომპლექსების რაოდენობითა და აქტივობით.

თითოეული საკონტროლო წერტილი სხვადასხვა სიძლიერის მტკიცების საფუძველს იძლევა. PGC-1alpha-ს ან TFAM-ის მატრიცული რნმ-ის გაზრდილი დონე აჩვენებს, რომ პროგრამის დაწყების მოთხოვნა გაიცა და არა იმას, რომ ის დასრულდა. მეტი mtDNA ან IV კომპლექსის მეტი ცილა მეტ მასალაზე მიუთითებს, მაგრამ გადაკეთებული მიტოქონდრიებიც შეიძლება იმავე სურათს იძლეოდეს. უკეთესი სუნთქვა, ჟანგბადის გაზრდილი მოხმარება ან კომპლექსის გაზრდილი აქტივობა აჩვენებს, რომ ფუნქცია შეიცვალა, თუმცა ფუნქცია შეიძლება სრულიად ახალი მიტოქონდრიების გარეშეც გაუმჯობესდეს. ბიოგენეზის შესახებ მყარი მტკიცება სამივეს აერთიანებს: რეგულატორს, შემცველობასა და ფუნქციას.

ფიბრობლასტებზე ჩატარებულმა შემდგომმა კვლევამ ამ ჯაჭვის უმეტესი ნაწილი მოიცვა. ადამიანის IMR90 უჯრედებში, რომლებსაც 100 ნანომოლარული მეთილენის ლურჯით ამუშავებდნენ, NAD-ისა და NADH-ის თანაფარდობა 15 წუთის განმავლობაში დროებით გაიზარდა და ერთი დღის განმავლობაში საწყის დონეს დაუბრუნდა. ამ დროებით ენერგეტიკულ სიგნალს მოჰყვა ენერგიის სენსორ AMPK-ის დროებითი ფოსფორილირება, შემდეგ კი PGC-1alpha-სა და SURF1-ის ინდუქცია; SURF1 მოქმედი IV კომპლექსის ასაწყობად აუცილებელი ცილაა. IV კომპლექსის აქტივობა დაახლოებით გაორმაგდა, უჯრედული ოქსიდანტები დაახლოებით 28 პროცენტით შემცირდა, ტელომერების შემოკლება კი შენელდა. სრული თანმიმდევრობა აღწერილია ნაშრომში, რომელიც მეთილენის ლურჯის ჟანგვა-აღდგენით აქტივობას AMPK-სა და მიტოქონდრიულ ბიოგენეზს უკავშირებს.

ამ ნაშრომის ორი დეტალი ყურადღებას იმსახურებს, რადგან სწორედ ასეთი დეტალები იკარგება ხოლმე. პირველი: გააქტიურების ხასიათს უფრო დიდი მნიშვნელობა ჰქონდა, ვიდრე უბრალოდ მის არსებობას. მეთილენის ლურჯი AMPK-ს დროებით ააქტიურებდა, ხოლო შესადარებელი პრეპარატი AICAR — ქრონიკულად; დროებითი აქტივატორი დაბერებას დაახლოებით რვაჯერ უფრო ეფექტიანად აფერხებდა. ამიტომ მტკიცება „მეთილენის ლურჯი ააქტიურებს AMPK-ს“ არასრულია; არსებითი ისაა, რომ იგი AMPK-ს დროებით ააქტიურებს, შედარება კი მიანიშნებს, რომ ქრონიკული გააქტიურება იმავე შედეგს არ იძლევა. მეორე: მეთილენის ლურჯს უჯრედული ციკლი არ შეუცვლია, რაც გამორიცხავს ყველაზე ბანალურ ალტერნატიულ ახსნას — თითქოს უჯრედები უბრალოდ უფრო ნელა იყოფოდა და ამის გამო უფრო ახალგაზრდულად გამოიყურებოდა.

თაგვებზე კვლევის მიმართულება: ქცევა, გენომები და განზრახ პარადოქსული საწყისი ბიძგი

უჯრედულ კულტურებზე ჩატარებული სამუშაო ცხოველებზე გადაიტანა ჯგუფმა, რომელიც საშუალო ასაკის თაგვებს სწავლობდა. მეთილენის ლურჯის პერორალურად მიღების 60 დღის შემდეგ დამუშავებულ თაგვებს უფრო მეტად შეუნარჩუნდათ ფიზიკური გამძლეობა და გარემოს შესწავლის ქცევა, ხოლო შფოთვის მსგავსი ქცევა ნაკლებად გამოუვლინდათ, ვიდრე დაუმუშავებელ ხანდაზმულ თაგვებს. ტვინის ქსოვილში გენების — NRF1-ის, TFAM-ის, SOD2-ისა და IV კომპლექსის სუბერთეულის, COX1-ის — ექსპრესია, რომელიც დაბერებამ დათრგუნა, ზრდასრული ასაკისთვის დამახასიათებელ დონეებს მიუახლოვდა, ხოლო mtDNA-ის ასლების რაოდენობა გაიზარდა. ეს შედეგები — ქცევა, რეგულატორი და გენომის რაოდენობა — აღწერილია საშუალო ასაკის თაგვებზე ჩატარებულ კვლევაში მეთილენის ლურჯისა და ტვინის მიტოქონდრიული ბიოგენეზის შესახებ.

საინტერესოა სავარაუდო საწყისი ბიძგი, რადგან ის ეწინააღმდეგება მარტივ წარმოდგენას, რომ მეთილენის ლურჯი ანტიოქსიდანტია. დამუშავებული თაგვების ტვინის მიტოქონდრიებში ჟანგბადის რეაქტიული ფორმების, კერძოდ წყალბადის პეროქსიდის, წარმოქმნა გაზრდილი იყო. ავტორთა ვარაუდით, სწორედ სუსტი პეროქსიდული სიგნალი ააქტიურებს Nrf2-ის გზას, რომელიც შემდეგ ბიოგენეზის პროგრამას წარმართავს. ამ მოდელში მეთილენის ლურჯი საწყის ეტაპზე პროოქსიდანტია, საბოლოო შედეგის ეტაპზე კი — ანტიოქსიდანტი. ამგვარ მოვლენას ფარმაკოლოგები ჰორმეზისს უწოდებენ: მცირე სტრესი იწვევს დამცავ პასუხს, რომელიც თავად სტრესს აღემატება. იწვევს თუ არა პეროქსიდის ეს მატება რეალურად Nrf2-ის გააქტიურებას, პირდაპირ არ შემოწმებულა; ეს სავარაუდო ხიდია და არა გაზომილი კავშირი.

იმავე ჯგუფის თანმხლებმა კვლევამ ამ ვარაუდის უსაფრთხოების მხარე გამკაცრებულ პირობებში შეამოწმა. ტვინის იზოლირებულ მიტოქონდრიებში მეთილენის ლურჯი წყალბადის პეროქსიდის წარმოქმნას უკვე 50 ნანომოლარული კონცენტრაციისას ზრდიდა, თუმცა თერაპიული კონცენტრაციები მიტოქონდრიული დნმ-ის შესამჩნევ დაზიანებას არ იწვევდა. მხოლოდ 100 მიკრომოლარული კონცენტრაციისას, რაც თერაპიულ დონეებს ბევრად აღემატება, გამოვლინდა mtDNA-ის ზოგიერთი ფრაგმენტის დაზიანება; 20 მიკრომოლარული საღებავისა და წითელი სინათლის კომბინაცია კი წარმოქმნიდა სინგლეტურ ჟანგბადს, რომელიც mtDNA-ს ფართოდ აზიანებდა. ეს საღებავის ცნობილი ფოტოსენსიბილიზატორული მოქმედებაა და არა მისი ფარმაკოლოგიური მოქმედება სიბნელეში. წინასწარმა დამუშავებამ შუა ტვინის ვენტრალური ნაწილის მიტოქონდრიები როტენონით გამოწვეული mtDNA-ის დაზიანებებისგანაც კი დაიცვა. დოზაზე დამოკიდებული პასუხი და გენოტოქსიკურობის საკონტროლო შემოწმებები დეტალურადაა აღწერილი კვლევაში მეთილენის ლურჯის მიერ პეროქსიდის არაგენოტოქსიკური წარმოქმნის შესახებ.

გაზომილი და სავარაუდო: დიაგრამის წაკითხვა

ქვემოთ მოცემული გზის დიაგრამა ამ სტატიისთვის შეიქმნა, რათა მკაფიოდ გამიჯნულიყო ის, რასაც ტექსტიც ერთმანეთისგან გამოყოფს. უწყვეტი საზღვრებით მონიშნული უჯრები ასახავს ეტაპებს, რომლებსაც მეთილენის ლურჯის შესახებ ლიტერატურაში პირდაპირი ექსპერიმენტული მხარდაჭერა აქვს: ჟანგვა-აღდგენითი ციკლირება, რომელიც NAD/NADH-ის თანაფარდობას ცვლის; AMPK-ის დროებითი ფოსფორილირება; PGC-1alpha-სა და SURF1-ის ინდუქცია; IV კომპლექსის გაზრდილი აქტივობა; NQO1-ისა და TrxR1-ის ინდუქცია; თაგვის ტვინში ბიოგენეზის გენების ექსპრესიისა და mtDNA-ის ასლების რაოდენობის აღდგენა; და თერაპიული დოზებისას პეროქსიდის მატება mtDNA-ის დაზიანების გარეშე. წყვეტილი საზღვრებით მონიშნული უჯრები სავარაუდო კავშირებია: Keap1-ის მიერ პეროქსიდული სიგნალის აღქმა, ბირთვში Nrf2-ის დაგროვება, რომელიც დამცავ გენებს ააქტიურებს, და მიზეზობრივი ისარი Nrf2-ის გააქტიურებიდან ბიოგენეზის პროგრამამდე. ეს წყვეტილი ეტაპები სარწმუნოა, მონაცემებს შეესაბამება და სახელმძღვანელოებში აღწერილი ბიოლოგიის ნაწილია, მაგრამ ამ ნაშრომებში ისინი არ გაზომილა ისეთი საკონტროლო მიდგომებით — ბირთვული Nrf2, ARE რეპორტერები, Nrf2-ის ნოკაუტი — რომლებიც მათ უწყვეტი საზღვრებით მონიშნულ უჯრებად აქცევდა.

დიაგრამის დანახვისას სამი აღრევა იკვეთება. პირველი: NRF1 და Nrf2 თითქმის იდენტური სახელების მქონე განსხვავებული ცილებია; თაგვებზე ჩატარებულ კვლევაში გაზომეს ბირთვული რესპირაციული ფაქტორი 1 — ბიოგენეზის რეგულატორი — და არა ანტიოქსიდანტური ტრანსკრიფციის ფაქტორი. მათი ერთმანეთში აღრევა მთელ დიაგრამას ერთ კვანძამდე დაიყვანს. მეორე: გენების ექსპრესია ისტორიის დასაწყისია და არა დასასრული; TFAM-ის ან COX1-ის მატრიცული რნმ-ის დონის აღდგენა ბიოგენეზის დაწყების მოთხოვნას უჭერს მხარს, ხოლო mtDNA-ის ასლების რაოდენობა და IV კომპლექსის აქტივობა ამ მოთხოვნის შესრულების მტკიცებულებაა. მესამე: ანტიოქსიდანტური შედეგი Nrf2-ის გზას არ ადასტურებს; ფიბრობლასტებში ოქსიდანტების 28 პროცენტით შემცირება და თაგვებში როტენონისგან დაცვა რეალური შემდგომი ეფექტებია, მაგრამ მათკენ რამდენიმე გზა მიდის.

რა აქცევდა წყვეტილ უჯრას უწყვეტად

დაკლებული ექსპერიმენტები სტანდარტულია. მეთილენის ლურჯის ზემოქმედების შემდეგ ბირთვში Nrf2 ცილის გაზომვა, დროითი დინამიკით, რომელიც AMPK-ის დროებით სიგნალს შეესაბამება, შეამოწმებდა, ნამდვილად აქტიურდება თუ არა ორივე განშტოება ერთად, როგორც სინქრონული გააქტიურების ჰიპოთეზა ამტკიცებს. ARE-ის მიერ მართული რეპორტერი ტრანსკრიფციულ აქტივობას დაადასტურებდა და სამიზნე გენებიდან მის ირიბად დასკვნას აღარ დაეყრდნობოდა. ბიოგენეზის მაჩვენებლების განმეორებითი გაზომვა Nrf2-ის ექსპრესიის შემცირების ან მისი სრული გამორთვის პირობებში მიზეზობრივ ისარს პირდაპირ შეამოწმებდა: თუ IV კომპლექსის ინდუქცია და mtDNA-ის მატება Nrf2-ის გარეშეც შენარჩუნდება, ხიდის ვარაუდი მცდარია და ეფექტს მარტო AMPK-ის განშტოება განაპირობებს. ცხოველებზე კვლევის შემთხვევაში ხანგრძლივი დოზირების შესწავლა იმავე სამი საკონტროლო წერტილით — რეგულატორი, შემცველობა, ფუნქცია — შეამოწმებდა, რჩება თუ არა პროგრამა ჩართული, თუ ადაპტირდება. მანამდე ენერგეტიკული და დამცავი გზების სინქრონული გააქტიურება რჩება იმად, რაც მას ავტორებმა უწოდეს: შესაძლო საკვანძო ფაქტორად და არა დადგენილ მექანიზმად.

მკითხველებს, რომლებიც საკითხს უფრო ფართო ფარმაკოლოგიური პერსპექტივიდან ეცნობიან, შესაძლოა მიმდებარე კონტექსტიც აინტერესებდეთ: როგორ გადააქვს მეთილენის ლურჯს ელექტრონები მიტოქონდრიულ დონეზე, კიდევ რას აკეთებს ის მიტოქონდრიებსა და უჯრედულ ენერგიასთან მიმართებით, რა ადგილი უკავია უჯრედული დაბერების შესახებ მიგნებებს დაბერების კვლევაში, როგორ უკავშირდება ბიოგენეზის შესახებ მტკიცებები კოგნიტიურ ფუნქციონირებას და რას გვიჩვენებს უსაფრთხოების მონაცემები, რომლებიც დოზირების შესახებ ნებისმიერი განხილვის საზღვრებს განსაზღვრავს. თითოეული მათგანი ცალკე ცნებაა თავისი მტკიცებულებებით და თითოეული იმსახურებს გაზომილისა და სავარაუდოს იმავე გამიჯვნას, რომელიც ამ სტატიაში Nrf2-ს დაეთმო.