მეთილენის ლურჯი და აზოტის მონოქსიდი: NOS, cGMP და სისხლძარღვოვანი სიგნალიზაცია

კითხვა მარტივად ჟღერს: თრგუნავს თუ არა მეთილენის ლურჯი აზოტის მონოქსიდს? ლაბორატორიაში ეს ოთხ ცალკეულ კითხვად იყოფა და თითოეულს განსხვავებული ექსპერიმენტული შემოწმება სჭირდება. მათი ერთმანეთში აღრევა მთავარი მიზეზია იმისა, რომ მეთილენის ლურჯისა და აზოტის მონოქსიდის შესახებ დაწერილი ტექსტები დამაჯერებლად, მაგრამ ბუნდოვნად ჟღერს.

აზოტის მონოქსიდის სიგნალი ოთხრგოლიან ჯაჭვად წარმოიდგინეთ. გენის ტრანსკრიფციის შედეგად წარმოიქმნება აზოტის მონოქსიდის სინთაზა. ფერმენტი არგინინს აზოტის მონოქსიდად გარდაქმნის. აირი დიფუზიით აღწევს სამიზნემდე, სანამ სხვა რამესთან რეაქციაში შევა. ხსნადი გუანილატციკლაზა მას ამოიცნობს და ციკლურ GMP-ს წარმოქმნის. გამოქვეყნებული კვლევები მეთილენის ლურჯის ზემოქმედებას თითოეულ რგოლზე აღწერს, თუმცა მტკიცებულებები მიღებულია სხვადასხვა ექსპერიმენტულ სისტემაში, სხვადასხვა კონცენტრაციითა და სხვადასხვა იზოფორმის მონაწილეობით. ერთ რგოლზე მიღებული შედეგი სხვა რგოლზე მოქმედებას არ ადასტურებს.

კლასიკური ჯაჭვი, მარტივად აღწერილი

სისხლძარღვის კედელში სტანდარტული თანმიმდევრობა ასეთია. სტიმული ენდოთელურ უჯრედზე მოქმედებს. აზოტის მონოქსიდის ენდოთელური სინთაზა, რომელსაც eNOS ან NOS3 ეწოდება, აზოტის მონოქსიდის მცირე იმპულსს წარმოქმნის. აირი დიფუზიით გადადის მეზობელ გლუვკუნთოვან უჯრედში, უკავშირდება ხსნადი გუანილატციკლაზის ჰემის აღდგენილ რკინას და აჩქარებს GTP-ის ციკლურ GMP-ად გარდაქმნას. ციკლური GMP ააქტიურებს პროტეინკინაზა G-ს, იცვლება კალციუმის რეგულაცია და კუნთი დუნდება.

არსებობს მეორე ჯაჭვიც, რომელიც ცალკე უნდა განვიხილოთ. ინფექციის ან ციტოკინების ზემოქმედებისას უჯრედებში სხვა ფერმენტის გენის ტრანსკრიფცია მიმდინარეობს: ეს არის აზოტის მონოქსიდის ინდუცირებადი სინთაზა, ანუ iNOS, რომელსაც NOS2-იც ეწოდება. ის eNOS-თან შედარებით აზოტის მონოქსიდის უფრო დიდ და ხანგრძლივ ნაკადებს წარმოქმნის. მესამე იზოფორმა, ნეირონული NOS ანუ nNOS, კიდევ სხვა კონტექსტს ეკუთვნის. როდესაც ნაშრომში აზოტის მონოქსიდის სინთაზა იზოფორმის დაზუსტების გარეშეა ნახსენები, შეჩერდით და გადაამოწმეთ, რომელი გაზომეს. მიმოხილვა იმის შესახებ, თუ როგორ გადააქვს მეთილენის ლურჯს ელექტრონები, იმავე პრინციპს ზოგადად ჟანგვა-აღდგენით სამიზნეებზეც უსვამს ხაზს: გადამტანი თავისთავად არაფერს აკეთებს და შედეგს მის ორივე ბოლოში არსებული პარტნიორი განსაზღვრავს.

გაზომილი ციკლური GMP-ც ინტეგრირებული მაჩვენებელია და არა ფერმენტის აქტივობის პირდაპირი ტესტი. მისი დონე ასახავს ციკლაზით სინთეზს, რომელსაც აკლდება ფოსფოდიესტერაზებით დაშლა; სისხლძარღვთა გლუვ კუნთში განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია PDE5. ამიტომ ციკლური GMP-ის შემცირება ნიშნავს, რომ დეტექტორამდე ნაკლები სიგნალი მივიდა. მხოლოდ ეს მაჩვენებელი ვერ გვეუბნება, რომელი რგოლი გამოვიდა მწყობრიდან.

რგოლი 1: ნაკლები iNOS ფერმენტი წარმოიქმნება

თაგვის მაკროფაგებში, რომლებიც ბაქტერიული ლიპოპოლისაქარიდით, ინტერფერონ გამათი ან ორივეთი იყო სტიმულირებული, მეთილენის ლურჯმა ხელი შეუშალა iNOS ცილის მოსალოდნელ მატებას და მკვეთრად შეამცირა iNOS-ის საინფორმაციო რნმ მაკროფაგების ტრანსკრიფციის ექსპერიმენტებში. განსაკუთრებით ინფორმაციულია ის, რაც არ შეცვლილა. ინჰიბიტორ I კაპა B ალფას დაშლა, NF კაპა B-ისა და STAT1-ის ფოსფორილირება და ამ ფაქტორების ბირთვში გადასვლა ძირითადად უცვლელი დარჩა. შემცირდა მათი დნმ-თან შეკავშირება, რაც ქრომატინის იმუნოპრეციპიტაციამ დაადასტურა: iNOS-ის პრომოტორზე ამ ფაქტორების დაკავება ნაკლები იყო.

ეს გენის რეგულაციაზე ზემოქმედებაა, რომელიც ფერმენტის რაოდენობის ცვლილებას წინ უსწრებს, და არა უკვე არსებული ფერმენტის მწვავე ბლოკადა. ის ანთებით სიგნალიზაციას ეხება, სადაც ცილის წარმოქმნამდე ტრანსკრიფციის ფაქტორები პრომოტორს უნდა დაუკავშირდნენ. ეს უშუალოდ არაფერს ამბობს მოსვენებულ სისხლძარღვში კონსტიტუციური eNOS-ის შესახებ და სწორედ ამ საზღვრებში უნდა აღიწეროს.

რგოლი 2: არსებული NOS ფერმენტი უფრო ნელა მუშაობს

ვირთაგვებზე ჩატარებულმა კვლევამ სხვა დონე შეამოწმა. გონზე მყოფ მამრ ვირთაგვებს ლიპოპოლისაქარიდი ინტრავენურად შეუყვანეს, შემდეგ კი, სამი საათის შემდეგ, ინტრავენურად მისცეს ან ფიზიოლოგიური ხსნარი, ან მეთილენის ლურჯი 3 mg თითო kg-ზე. მედიალურ ბაზალურ ჰიპოთალამუსში აზოტის მონოქსიდის სინთაზის აქტივობა მონიშნული არგინინის ციტრულინად გარდაქმნით გაზომეს ჰიპოთალამუსში NOS-ის აქტივობის კვლევაში. მხოლოდ სტრესისა და ფიზიოლოგიური ხსნარის კომბინაციამაც გამოიწვია გარკვეული კალციუმდამოუკიდებელი აქტივობა, ლიპოპოლისაქარიდმა კი ის საკონტროლო დონესთან შედარებით დაახლოებით ათჯერ გაზარდა. მეთილენის ლურჯმა ორივე ინდუცირებული კომპონენტი გააქრო. ამ ქსოვილში, ამ დოზითა და ამ დროით წერტილში კალციუმდამოკიდებული კონსტიტუციური აქტივობა არ შეცვლილა.

ეს შედეგი ზუსტად ისე წაიკითხეთ, როგორც აღწერილია: მოცემულ პირობებში გაზომილი iNOS-ის ტიპის აქტივობა დაითრგუნა. ეს არ არის გენის ექსპრესიის გაზომვა და არც იმის მტკიცებულებაა, რომ მეთილენის ლურჯი ყოველთვის შერჩევითად მოქმედებს iNOS-ზე და არა eNOS-ზე ან nNOS-ზე. გასუფთავებულ ფერმენტებზე ჩატარებული კვლევები სიფრთხილის საჭიროებას კიდევ უფრო გამოკვეთს. გასუფთავებული აზოტის მონოქსიდის სინთაზის პირდაპირ ტესტებში მეთილენის ლურჯმა 30 მიკრომოლარულ კონცენტრაციაზე სრულად დაბლოკა ციტრულინის წარმოქმნა; ნახევრად ინჰიბირებისთვის საჭირო კონცენტრაცია სუპეროქსიდდისმუტაზის გარეშე დაახლოებით 5.3 მიკრომოლარული იყო, ხოლო მისი თანაობისას — 9.2 მიკრომოლარული, როგორც აღწერილია გასუფთავებული NOS-ისა და გუანილატციკლაზის შედარებაში. გასუფთავებული nNOS-ის ცალკე კვლევამ მექანიზმში ფერმენტთან დაკავშირებული ჰემის დაჟანგვის მონაწილეობაზე მიუთითა. პრაქტიკული დასკვნა ასეთია: იზოლირებულ სისტემებში NOS-ის პირდაპირი ინჰიბირება ნამდვილად ხდება, მაგრამ ჰიპოთალამუსში მიღებული შედეგი ვერ განზოგადდება მტკიცებად, თითქოს მეთილენის ლურჯი ყველგან ყველა კონსტიტუციურ NOS-ს ხელუხლებელს ტოვებს.

რგოლი 3: აზოტის მონოქსიდი მისვლამდე იკარგება

იმის ყველაზე მკაფიო დემონსტრაცია, რომ ციკლური GMP-ის შემცირება ფერმენტის ბლოკადის გარდა სხვა მექანიზმითაც შეიძლება აიხსნას, კურდღლის ფილტვის არტერიის კულტივირებული გლუვკუნთოვანი უჯრედებიდან მოდის. ექსპერიმენტის დიზაინში ენდოგენური NOS მთლიანად გვერდი აუარეს აზოტის მონოქსიდის დონორების პირდაპირ დამატებით და შემდეგ შეამოწმეს, მაინც თრგუნავდა თუ არა მეთილენის ლურჯი ციკლური GMP-ის პასუხს სისხლძარღვთა გლუვ კუნთში სუპეროქსიდის კვლევაში.

სამი დონორი გამოსცადეს 1-დან 100 მიკრომოლარულ კონცენტრაციამდე: S ნიტროზო L ცისტეინი, ნატრიუმის ნიტროპრუსიდი და სტაბილური დეამინირებული ანალოგი, სახელად MPANO. ყველამ ციკლური GMP დაახლოებით 1.5-ჯერიდან 12-ჯერამდე გაზარდა. 10 მიკრომოლარულ კონცენტრაციაზე მეთილენის ლურჯმა პირველი ორის პასუხი 51-დან 100 პროცენტამდე დათრგუნა, ხოლო MPANO-ს პასუხი უცვლელი დატოვა. მეთილენის ლურჯი უბრალოდ ციკლაზის კატალიზურ უბანს რომ ბლოკავდეს, დონორების მიმართ ასეთი შერჩევითობა ძნელად ასახსნელი იქნებოდა, რადგან სამივე ერთსა და იმავე შემდგომ ფერმენტზე მოქმედებს.

შემდეგ სამმა საკონტროლო ცდამ მექანიზმი სუპეროქსიდს დაუკავშირა. პირველი: ქსანტინითა და ქსანტინოქსიდაზით უჯრედგარეთ სუპეროქსიდის წარმოქმნამ იგივე სურათი გაიმეორა — CYSNO-სა და ნიტროპრუსიდის პასუხი დაიბლოკა, MPANO-სი კი შენარჩუნდა. მეორე: მეთილენის ლურჯმა გლუვკუნთოვანი უჯრედებიდან სუპეროქსიდის დოზასა და დროზე დამოკიდებული წარმოქმნა გამოიწვია, რაც ციტოქრომ c-ის აღდგენით გაზომეს. მესამე: სუპეროქსიდდისმუტაზამ სრულად აღკვეთა ინჰიბირება, კატალაზამ კი ვერა, რაც ამ ექსპერიმენტულ სისტემაში უშუალოდ მოქმედ სახეობად სუპეროქსიდზე მიუთითებს და არა წყალბადის ზეჟანგზე.

ექსპერიმენტის ერთობლივი კულტივირების ვერსიაც უნდა აღიწეროს, რადგან ის ეფექტის სივრცით მდებარეობას გვიჩვენებს. საფარ მინებზე მოთავსებული ენდოთელური უჯრედები მცირე ხნით გლუვკუნთოვან უჯრედებთან ერთად გააშენეს, რის შედეგადაც ბაზალურად გამოთავისუფლებულმა ენდოთელურმა ფაქტორმა გლუვი კუნთის ციკლური GMP სამიდან რვაჯერ გაზარდა. რომელიმე კომპარტმენტის მეთილენის ლურჯით წინასწარმა დამუშავებამ ეს სიგნალი შეამცირა, ხოლო სუპეროქსიდდისმუტაზამ ენდოთელიუმის წინასწარი დამუშავების ეფექტი ნაწილობრივ გააუქმა. სხვა სიტყვებით, მეთილენის ლურჯს სულაც არ სჭირდება გლუვკუნთოვანი დეტექტორი უჯრედის შიგნით მოქმედება. მას შეუძლია სიგნალი გზაში მყოფი მესენჯერის მოცილებით შეამციროს. მეთილენის ლურჯის კვლევების კითხვის გზამკვლევი ამას ზოგად წესად განიხილავს: მოლეკულური სამიზნის დასახელებამდე მიუთითეთ კომპარტმენტი, სადაც ჩარევა მოხდა.

ამისთვის NOS-ის ინჰიბირების დარქმევა არასწორი იქნებოდა. დონორების მოქმედებას სინთაზის ეტაპი არ სჭირდებოდა, თუმცა სიგნალი მაინც შემცირდა.

რგოლი 4: თავად დეტექტორი ნაკლებად პასუხობს

ხსნად გუანილატციკლაზაზე პირდაპირი ზემოქმედება არსებობს, თუმცა კონცენტრაციებს მნიშვნელობა აქვს. ზემოთ ციტირებულ გასუფთავებული ფერმენტების შედარებაში აზოტის მონოქსიდით სტიმულირებული ციკლაზის ნახევრად ინჰიბირებას მეთილენის ლურჯის დაახლოებით 60 მიკრომოლარული კონცენტრაცია სჭირდებოდა, მაშინ როცა NOS-ისთვის შესაბამისი კონცენტრაცია დაახლოებით 5-დან 9 მიკრომოლარულამდე იყო; 1 მილიმოლარულმაც კი მაქსიმალური ბლოკადა მხოლოდ ნაწილობრივ გამოიწვია. ეს დაახლოებით ექვსიდან თერთმეტჯერამდე სხვაობაა. ამიტომ დაბალ მიკრომოლარულ კონცენტრაციებზე ჩატარებულ უჯრედულ ექსპერიმენტს, რომელშიც ციკლური GMP მცირდება, მხოლოდ ციკლური GMP-ის მაჩვენებლის საფუძველზე ციკლაზის შერჩევითი ინჰიბირება ვერ ეწოდება.

მოგვიანებით ჩატარებულმა ჟანგვა-აღდგენითმა კვლევამ კიდევ ერთი სიფრთხილის მიზეზი დაამატა: მეთილენის ლურჯმა აზოტის მონოქსიდით გააქტიურებული ციკლაზა დეაქტივაცია გაუკეთა მექანიზმით, რომელიც ჰემის რკინის ჰაერით უბრალო დაჟანგვისგან განსხვავდებოდა. ამგვარად, დეტექტორის ფუნქცია შეიძლება დაირღვეს, მაგრამ ქიმიური მექანიზმი საბოლოოდ დადგენილი არ არის. კონცენტრაციებს შორის სხვაობა კი ნიშნავს, რომ დაბალ მიკრომოლარულ კონცენტრაციებზე პირველ რიგში სუპეროქსიდისა და NOS-ის ეფექტები უნდა გამოირიცხოს. აქვე მნიშვნელოვანია ფოსფოდიესტერაზის კონტროლიც. თუ დაშლა არ გაზომილა ან არ დაბლოკილა, ციკლური GMP-ის შემცირებული დაგროვება თავსებადია როგორც ნაკლებ სინთეზთან, ისე უფრო სწრაფ დაშლასთან, ან ორივესთან ერთად.

რატომ არ დაიყვანება ეს ყველაფერი არტერიული წნევის შესახებ ერთ მტკიცებამდე

თითოეული რგოლი განსხვავებულ სისტემაში დადასტურდა. მაკროფაგებში ტრანსკრიფცია ჰიპოთალამუსში ფერმენტული აქტივობა არ არის. ლიპოპოლისაქარიდის შემდეგ ჰიპოთალამუსში აქტივობა მოსვენების მდგომარეობაში ენდოთელური ტონუსი არ არის. ერთობლივ კულტურაში ბაზალურად გამოთავისუფლებული ენდოთელური ფაქტორი აგონისტით სტიმულირებული ვაზოდილატაცია არ არის. ფილტვის არტერიის კულტივირებული უჯრედები მეთილენის ლურჯის 10 მიკრომოლარულ კონცენტრაციაზე ადამიანის სისხლის მიმოქცევა არ არის. მათი გაერთიანება ისეთ მტკიცებად, როგორიცაა „მეთილენის ლურჯი აზოტის მონოქსიდის ბლოკირებით არტერიულ წნევას ზრდის“, სწორედ იმ განსხვავებებს უგულებელყოფს, რომელთა შესანარჩუნებლადაც საკონტროლო ცდები იყო შექმნილი.

სამი შემოწმება აღწერას სიზუსტეს უნარჩუნებს. პირველი: დაასახელეთ იზოფორმა — eNOS მოსვენების მდგომარეობაში სისხლძარღვოვანი ტონუსისთვის, iNOS ინდუცირებული ანთებითი ნაკადისთვის და nNOS ნეირონული და ზოგიერთი გასუფთავებული ფერმენტის კონტექსტისთვის. მეორე: დაასახელეთ აზოტის მონოქსიდის სიგნალის მიწოდების გზა — ენდოგენური სინთეზი, ბაზალური ენდოთელური გამოთავისუფლება ან კონკრეტული დონორი, როგორიცაა CYSNO, ნიტროპრუსიდი ან MPANO, რადგან სტაბილური დონორი მეთილენის ლურჯის ზემოქმედების მიმართ მდგრადი აღმოჩნდა, ლაბილურები კი არა. მესამე: დაასახელეთ კონცენტრაცია და ეფექტის აღმდგენი კონტროლი — სუპეროქსიდდისმუტაზით აღდგენა სუპეროქსიდის მონაწილეობაზე მიუთითებს; კატალაზის არაეფექტურობა ამ სისტემაში წყალბადის ზეჟანგის მონაწილეობას ეწინააღმდეგება; ქსანტინოქსიდაზით ეფექტის გამეორება სუპეროქსიდის საკმარისობას აჩვენებს; გასუფთავებული ფერმენტების ტესტები კი კატალიზზე პირდაპირ ზემოქმედებას სიგნალის გზაში დაკარგვისგან გამოყოფს.

მოკლე შეჯამება ასეთია. მეთილენის ლურჯი უფრო მართებულია განვიხილოთ აზოტის მონოქსიდიდან ციკლურ GMP-მდე სიგნალიზაციის მრავალ უბანზე მოქმედ დამრღვევად და არა ციკლაზის შერჩევით ბლოკატორად. ექსპერიმენტული სისტემისა და კონცენტრაციის მიხედვით, მას შეუძლია შეამციროს iNOS-ის ტრანსკრიფციის ფაქტორების შეკავშირება, უშუალოდ დათრგუნოს NOS ფერმენტები, სუპეროქსიდის წარმოქმნით შეამციროს აზოტის მონოქსიდის ხელმისაწვდომობა და დაარღვიოს აზოტის მონოქსიდით გააქტიურებული ციკლაზის ფუნქცია. ციკლური GMP-ის სიგნალიზაციის როლი სისხლძარღვების კვლევებში და უჯრედულ ტესტებში გამოყენებული აზოტის მონოქსიდის დონორების შედარება ამ განშტოებებს ცალ-ცალკე უფრო დეტალურად განიხილავს, ხოლო ჟანგვა-აღდგენითი ეფექტების ფერმენტული ეფექტებისგან გასამიჯნად გამოყენებული მეთოდები ხსნის, რატომ გვხვდება ამ ლიტერატურაში ასე ხშირად სუპეროქსიდდისმუტაზის, კატალაზისა და სტაბილური დონორის საკონტროლო ცდის კომბინაცია.

მეთილენის ლურჯის შემდეგ ციკლური GMP-ის დაბალი მაჩვენებელი ჯაჭვის დარღვევაზე მიუთითებს. მხოლოდ საკონტროლო ცდები გვიჩვენებს, რომელი რგოლი გაწყდა.