მეთილენის ლურჯის მიტოქონდრიული ეფექტების გაზომვა: ჟანგბადი, ATP და მემბრანის პოტენციალი

დავუშვათ, ლაბორატორია სუნთქვადარღვეულ მიტოქონდრიებს მეთილენის ლურჯს უმატებს და ჟანგბადის მოხმარების ზრდას აკვირდება. ბუნებრივია, ამის შემდეგ დაიწეროს, რომ საღებავმა მიტოქონდრიული ფუნქცია აღადგინა. ეს წინადადება შეიძლება მცდარი იყოს. ჟანგბადის ნაკადი, ATP-ის სინთეზი და მემბრანის პოტენციალი სამი განსხვავებული ცნებაა. მათ ერთი და იგივე ორგანელა აერთიანებს, ისევე როგორც სარეზერვო ასლის შექმნას, სინქრონიზაციასა და გაზიარებას აერთიანებს ერთი ღრუბლოვანი საქაღალდე: ერთმანეთთან დაკავშირებულია, მაგრამ სხვადასხვა წესს ექვემდებარება. ერთის მეორედ მიჩნევა ინტერპრეტაციას მცდარს ხდის მაშინაც კი, როცა ყველა გაზომვა ტექნიკურად სწორია.

მეთილენის ლურჯი ამ აღრევას განსაკუთრებით მოსალოდნელს ხდის, რადგან თავადაც მონაწილეობს იმ სისტემაში, რომლის გაზომვაც ხდება. ის რედოქსციკლირებადი ნაერთია, რომელიც ელექტრონებს ჯაჭვის ადრეულ უბნებში იღებს და შემდგომ უბნებში გასცემს; ლიპოფილური კატიონია, რომელიც ენერგიზებულ მიტოქონდრიებში გროვდება; და მკვეთრად ლურჯი ნაერთია, რომელიც სინათლეს გავრცელებული ზონდების მსგავს სპექტრულ ზოლებში შთანთქავს და ასხივებს. ერთი მაჩვენებელი ამ ყველაფერს ვერ ასახავს. ბუდაპეშტის მიტოქონდრიულ კვლევებში ნაჩვენები სანდო მიდგომაა ჟანგბადის ნაკადის, ATP-ის სინთეზის სიჩქარის, მემბრანის პოტენციალისა და წყალბადის ზეჟანგის გამოყოფის ერთობლივი გაზომვა, თითოეულ ეტაპზე საღებავის სპეციფიკური კონტროლებით.

რესპირომეტრია ზომავს ჟანგბადის ნაკადს და არა ენერგიის გამომუშავებას

მაღალი გარჩევადობის რესპირომეტრია, იქნება ეს Oroboros Oxygraph-ით თუ Seahorse-ის უჯრედგარე ნაკადის ანალიზატორით, ერთ რამეს გვიჩვენებს: რამდენად სწრაფად აღდგება ჟანგბადი. ის არ გვიჩვენებს, რამდენი პროტონი გადაიტუმბა თითო ელექტრონზე, რა ოდენობის გრადიენტი შენარჩუნდა ან გამოიყენა თუ არა ის ATP-სინთაზამ.

ტერმინოლოგიას მნიშვნელობა აქვს. იზოლირებულ მიტოქონდრიებში სუბსტრატი ADP-ის გარეშე იძლევა გაჟონვით სუნთქვას, სუბსტრატი ADP-ის გამაჯერებელი კონცენტრაციით — ჟანგვითი ფოსფორილირების შესაძლებლობას, ხოლო განმაცალკევებლის ტიტრაცია — ელექტრონების გადაცემის მაქსიმალურ შესაძლებლობას. მთლიან უჯრედებში Seahorse-ის შესაბამისი მაჩვენებლებია ბაზალური სუნთქვა, ოლიგომიცინისადმი მგრძნობიარე, ATP-თან დაკავშირებული სუნთქვა, პროტონების გაჟონვა, FCCP-ით განსაზღვრული მაქსიმალური სუნთქვა და როტენონისა და ანტიმიცინისადმი მდგრადი არამიტოქონდრიული ჟანგბადის მოხმარება. Seahorse-ის მაჩვენებლების State 3-ად და State 4-ად მოხსენიება მათ ისეთ სიზუსტეს მიაწერს, რომელსაც ეს პრეპარატი ვერ უზრუნველყოფს, როგორც ამას Agilent-ის Mito Stress Test-ის ჩარჩო ნათლად აჩვენებს.

მეთილენის ლურჯი არღვევს ინტუიციურ კავშირს მეტ ჟანგბადსა და მეტ ენერგიას შორის. ზღვის გოჭის ტვინის იზოლირებულ მიტოქონდრიებში 100 nM-დან 1 uM-მდე საღებავმა გაზარდა მოსვენების მდგომარეობაში ჟანგბადის მოხმარება გლუტამატისა და მალატის, სუქცინატისა და ალფა-გლიცეროფოსფატის სუბსტრატებზე; ალფა-გლიცეროფოსფატზე ზრდა დაახლოებით 64 პროცენტი იყო. თუმცა ჯანმრთელ მიტოქონდრიებში ADP-ით სტიმულირებული სუნთქვა არსებითად უცვლელი დარჩა, როგორც ტვინის იზოლირებული მიტოქონდრიების კვლევა გვიჩვენებს. რადგან გაჟონვითი სუნთქვა გაიზარდა, ADP-ით სტიმულირებული ნაკადი კი უცვლელი დარჩა, გამოთვლილი სუნთქვის კონტროლის კოეფიციენტი მცირდება. ეს შემცირება არ ნიშნავს, რომ საღებავმა მიტოქონდრიები დააზიანა. ის ნიშნავს, რომ საღებავმა ჩვეულებრივ სუნთქვას ჟანგბადის მომხმარებელი რედოქსციკლი დაუმატა. მეთილენის ლურჯის ჟანგბადის მოხმარების ანალიზი, რომელიც მხოლოდ ზრდას აღწერს, რეალურ ქიმიურ პროცესს ზომავს, მაგრამ ენერგიის შენარჩუნებაზე არაფერს ამბობს.

აღდგენის ექსპერიმენტები იმავე სხვაობას უფრო დიდი მასშტაბით აჩვენებს. I კომპლექსის ბლოკირებისას ჟანგბადის ნაკადი დაახლოებით სამჯერ აღდგა, ATP-ის სინთეზი კი — მხოლოდ დაახლოებით 1.5-ჯერ. ელექტროდამდე მეტი ჟანგბადი მივიდა, მაგრამ მისი უფრო მცირე წილი მოხმარდა ATP-ის წარმოქმნას. ჟანგვითი ფოსფორილირების გაუმჯობესების შესახებ ნებისმიერ მტკიცებას ATP-ის მაჩვენებელიც სჭირდება, სასურველია ATP-ისა და ჟანგბადის თანაფარდობის სახით, მნიშვნელის განსაზღვრის გამოყენებული წესის მითითებით.

ATP-ის ანალიზები ზომავს სინთეზის სიჩქარეს, რომელსაც შემცველობა ვერ ჩაანაცვლებს

ATP-ის ანალიზი სხვა კითხვას პასუხობს: რამდენი ATP წარმოიქმნება დროის ერთეულში. კინეტიკური გაზომვა — იქნება ეს ციცინათელას ლუციფერაზის ლუმინესცენციის რამდენიმე წუთის განმავლობაში აღრიცხვა თუ ჰექსოკინაზისა და გლუკოზა-6-ფოსფატდეჰიდროგენაზის შეუღლებული ანალიზი 340 nm-ზე — სიჩქარეს გვაძლევს. ერთ საბოლოო წერტილში საერთო ATP-ის გაზომვა კი შემცველობას გვაძლევს, რომელიც სინთეზსა და მოხმარებას შორის სხვაობას ასახავს და თავისთავად ჟანგვითი ფოსფორილირების შესახებ ცოტას გვეუბნება.

ბუდაპეშტის ჯგუფმა გამოიყენა შეუღლებული ფერმენტული მეთოდი ადენილატკინაზის დათრგუნვით და აღმოაჩინა, რომ 1-დან 2 uM-მდე მეთილენის ლურჯი როტენონითა და ანტიმიცინით დამუშავებულ მიტოქონდრიებში ATP-ის წარმოქმნას მცირედ, მაგრამ სტატისტიკურად მნიშვნელოვნად ზრდიდა. ეს ნამდვილი აღდგენაა, თუმცა ნაწილობრივი. TEGDMA-ის ტოქსიკურობის კვლევამ სხვა მოდელში მსგავსი შედეგი მიიღო: 5 mM სტომატოლოგიურმა მონომერმა TEGDMA-მ I კომპლექსთან დაკავშირებული სუნთქვა ნაკადის დაახლოებით 286 ერთეულიდან 28-მდე შეამცირა, ხოლო 2 uM საღებავმა ის დაახლოებით 86-მდე აღადგინა.

ფერად რედოქსნაერთთან მუშაობისას ორი კონტროლი აუცილებელია. პირველი: გამოიყენეთ ოლიგომიცინი, რათა დაადგინოთ, გაზომილი ATP-ის სინთეზის რა ნაწილი დამოკიდებულია ATP-სინთაზაზე. მეორე: ჩაატარეთ უჯრედების გარეშე ცნობილი რაოდენობის ATP-ის დამატების აღდგენის ტესტი, სრული რეაგენტითა და ზუსტად იმ საღებავის კონცენტრაციებით, რომლებიც გამოიყენეთ — სულ მცირე, 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM და 2 uM. საღებავმა შეიძლება გამოსხივებული სინათლე შთანთქას, რეპორტერული ფერმენტი დათრგუნოს ან რეაგენტის რედოქსქიმია შეცვალოს; სწორედ ამ ტიპის ჩარევისთვის ზოგადი ლუციფერაზის ანალიზის სახელმძღვანელო ბიოქიმიურ საკონტროლო სკრინინგს გვირჩევს. ნუ ჩათვლით, რომ 1 uM არტეფაქტებისგან თავისუფალია მხოლოდ იმიტომ, რომ ჩაქრობა ჩვეულებრივ უფრო ძლიერია მაღალ კონცენტრაციებზე.

მემბრანის პოტენციალის ზონდები ზომავს საღებავის განაწილებას და არა ნაკადს

საფრანინი O, TMRM და TMRE, როდამინი 123 და JC-1 მემბრანაში გამავალი კატიონებია. ისინი ელექტროქიმიური წონასწორობის შესაბამისად გროვდება უარყოფითად დამუხტულ მატრიქსში, ამიტომ მთლიანი ფლუორესცენცია პოტენციალს ირიბად ასახავს — იმის მიხედვით, თუ სად იმყოფება ზონდი. არცერთი მათგანი არ ზომავს ATP-ს ან ელექტრონების ნაკადს.

თითოეულ ზონდს თავისი შესაფერისი პრეპარატი აქვს. საფრანინი O გამოდგება იზოლირებული მიტოქონდრიებისა და პერმეაბილიზებული უჯრედებისთვის, ჩვეულებრივ დაახლოებით 2 uM კონცენტრაციით, აღგზნებით დაახლოებით 495 nm-ზე და გამოსხივებით დაახლოებით 585 nm-ზე. ის ჩაქრობის რეჟიმში მუშაობს, სადაც ზონდის შეთვისება მთლიან ფლუორესცენციას ცვლის. TMRM და TMRE გამოდგება მთლიანი უჯრედებისთვის დაბალი ნანომოლარული დატვირთვით, ჩაქრობის გარეშე რეჟიმში, სადაც დეპოლარიზაცია საღებავს ათავისუფლებს და მიტოქონდრიული ფლუორესცენცია მცირდება; მაღალი დატვირთვისას თვითჩაქრობამ სიგნალის მიმართულება შეიძლება შეაბრუნოს. JC-1 მწვანე და წითელი სიგნალების მოსახერხებელ თანაფარდობას იძლევა, მაგრამ დატვირთვასა და მიტოქონდრიულ მასაზეა დამოკიდებული, რის გამოც რაოდენობრივი მუშაობისთვის ის ნაკლებად საიმედოა, ვიდრე სათანადოდ კონტროლირებული TMRM. ეს კომპრომისები შეჯამებულია ფართოდ გამოყენებულ მიტოქონდრიული მემბრანის პოტენციალის ზონდების მიმოხილვაში.

მეთილენის ლურჯი ოპტიკურ ჩარევას სწორედ სამუშაო კონცენტრაციებზე იწვევს. მისი შთანთქმის ზოლები დაახლოებით 600-დან 665 nm-მდე წითელი ზონდების გამოსხივებას გადაფარავს, ამიტომ შიდა ფილტრის ეფექტები, ჩაქრობა და აღმგზნები სინათლის შთანთქმა სავსებით მოსალოდნელია. საღებავი ამასთან მეორე ლიპოფილური კატიონიცაა, რომლის საკუთარი განაწილება გასაზომ პოტენციალთან ერთად იცვლება. დაცვითი მიდგომაა რამდენიმე დამოუკიდებელი გაზომვა და ცარიელი კონტროლები: მხოლოდ ზონდი, მხოლოდ საღებავი, ზონდი საღებავის თითოეულ კონცენტრაციასთან ერთად, სრული დეპოლარიზაცია FCCP-ით ნულოვანი საცნობარო ნიშნულის მისაღებად და, სასურველია, მეორე, ოპტიკურად განსხვავებული ზონდი. III კომპლექსის გვერდის ავლის კვლევამ ამის პრეცედენტი შექმნა: ანტიმიცინითა და მიქსოთიაზოლით ინჰიბირების შემდეგ მემბრანის პოტენციალის აღდგენა როგორც საფრანინი O-თი, ისე TMRM-ით გადაამოწმეს და თვისებრივად ერთნაირი აღდგენა მიიღეს. ერთი ოპტიკური რეპორტერი მინიშნებაა. ორი დამოუკიდებელი რეპორტერი — მტკიცებულება.

სამი პრეპარატი, სამი განსხვავებული კითხვა

იზოლირებული მიტოქონდრიები, პერმეაბილიზებული უჯრედები და მთლიანი უჯრედები ერთი ანალიზის მგრძნობელობის ურთიერთჩანაცვლებადი პარამეტრები არ არის. ისინი განსხვავებული მიდგომებია, განსხვავებული სამუშაო პრინციპებით.

იზოლირებულ მიტოქონდრიებში შენარჩუნებულია ელექტრონების სატრანსპორტო ჯაჭვი, შიდა მემბრანა და მატრიქსის მექანიზმები, ხოლო პლაზმური მემბრანა, ციტოზოლი და ქსელური არქიტექტურა მოცილებულია. სწორედ ეს მოცილებაა მიზანი: სუბსტრატები, ADP, ინჰიბიტორები და საღებავის კონცენტრაციები ზუსტად განისაზღვრება, რაც შესაბამისი გზის დადგენის საშუალებას იძლევა. სანაცვლოდ იკარგება სუბსტრატების ბუნებრივი მიწოდება, სიგნალიზაცია და მოთხოვნილება.

პერმეაბილიზებულ უჯრედებში მიტოქონდრიები უჯრედული არქიტექტურის დიდი ნაწილის შიგნით რჩება, ხოლო გახსნილი პლაზმური მემბრანა ეგზოგენურ სუბსტრატებსა და ADP-ს ატარებს. ისინი შესაფერისია უჯრედულ კონტექსტში სუბსტრატული გზის დეფექტის დასადგენად. გადაჭარბებული პერმეაბილიზაცია გარე მემბრანას აზიანებს, ხოლო ციტოზოლური რეგულაცია გამორეცხვისას იკარგება.

მთლიანი უჯრედები ყველაფერს ინარჩუნებს: პლაზმური მემბრანის ბარიერს, ციტოზოლურ აღმდგენებს, ენდოგენური სუბსტრატების ტრანსპორტს, მიტოქონდრიულ ქსელსა და ATP-ზე მოთხოვნილებას. ისინი ყველაზე ახლოსაა ფიზიოლოგიასთან და ყველაზე შორს — მექანიზმის გამიჯვნასთან, რადგან საღებავის შეთვისება, აღდგენა და სეკვესტრაცია ერთობლივად განსაზღვრავს მიტოქონდრიებზე მის ეფექტურ ზემოქმედებას.

TEGDMA-ის კვლევაში სამივე დონე მიზანმიმართულად გამოიყენეს: ტვინის იზოლირებული მიტოქონდრიები — საღებავით ჟანგვისა და პოტენციალის აღდგენის შესაფასებლად; კბილის პულპის პერმეაბილიზებული ღეროვანი უჯრედები — ძირითადად დაზიანების I კომპლექსთან დაკავშირებულ სუბსტრატის ჟანგვაში ლოკალიზებისთვის; და მთლიანი ღეროვანი უჯრედები — დათრგუნულ ჟანგბადის მოხმარებაზე 2 uM საღებავის ფიზიოლოგიური ჯამური ეფექტის შესაფასებლად. მკითხველებისთვის, რომლებიც სხვადასხვა პრეპარატში მიტოქონდრიულ მაჩვენებლებს ადარებენ, თანმხლები განმარტებითი სტატია იმის შესახებ, თუ როგორ გადააქვს მეთილენის ლურჯს ელექტრონები სუნთქვით ჯაჭვში, ამ გზის საფუძვლებს ხსნის, ხოლო მეთილენის ლურჯის სუნთქვის კვლევების წაკითხვის გზამკვლევი დოზისა და ინჰიბიტორების გამოყენების ლოგიკას განიხილავს.

კონტროლები, რომლებსაც რედოქსაქტიური საღებავი მოითხოვს

რედოქსციკლირებად ნაერთს ჩვეულებრივ ინჰიბიტორზე მეტი კონტროლი სჭირდება, რადგან მხოლოდ საღებავის ქიმიურმა პროცესებმაც შეიძლება ბიოლოგიური პროცესების იმიტაცია შექმნას.

რესპირომეტრიისთვის გამოიყენეთ მხოლოდ ბუფერის კამერა დრეიფის შესაფასებლად, ბუფერისა და საღებავის კამერა ბიოლოგიური მასალის გარეშე, საღებავი ანალიზში არსებული ნებისმიერი უჯრედგარე აღმდგენით და საბოლოოდ როტენონი და ანტიმიცინი მთლიანი უჯრედების არამიტოქონდრიული ჟანგბადის მოხმარების განსასაზღვრად. გაითვალისწინეთ, რომ აღდგენილი საღებავი ხელახლა იჟანგება ჟანგბადისთვის ელექტრონების გადაცემით და წყალბადის ზეჟანგს წარმოქმნის. ამიტომ მხოლოდ საღებავის ცარიელი კონტროლი, ელექტრონების დონორის გარეშე, სათანადოდ ვერ აფასებს უჯრედების გარეშე ჟანგბადის მოხმარებას, რომელიც NADH-ის ან NADPH-ის ხელმისაწვდომობისას ჩნდება.

წყალბადის ზეჟანგისთვის უპირატესობა მიანიჭეთ დაკალიბრებულ Amplex UltraRed-ს პირშუშხას პეროქსიდაზასთან ერთად და არა არასელექციურ DCFDA საღებავებს; შედეგი კატალაზით გადაამოწმეთ და განათებაზე დამოკიდებულება შეამოწმეთ, რადგან საღებავი ფოტოსენსიბილიზატორია. ტვინის მიტოქონდრიების კვლევამ აჩვენა, რომ მხოლოდ 100 nM საღებავის დროს ზეჟანგის დატვირთვა ოთხჯერ მეტზე გაიზარდა, მისი მოცილება კი შენელდა; ზეჟანგი უშუალოდ აღდგენილი საღებავისგან წარმოიქმნებოდა, სუპეროქსიდის შუალედური წარმოქმნის გარეშე. ზონდის არჩევისა და სინათლის კონტროლების დეტალები განხილულია თანმხლებ სტატიაში საღებავებით ექსპერიმენტებში ჟანგბადის რეაქტიული ფორმების გაზომვის შესახებ, ხოლო უფრო ფართო კითხვა — როდის მოქმედებს ზეჟანგი სიგნალად და როდის წარმოადგენს დატვირთვას — განხილულია უჯრედული რედოქსბალანსისა და ანტიოქსიდანტური მტკიცებების თემასთან ერთად.

მექანიზმთან დაკავშირებული მტკიცებებისთვის შეამოწმეთ III კომპლექსის ინჰიბირების ორივე უბანი: ანტიმიცინი A — Qi უბანზე და მიქსოთიაზოლი — Qo უბანზე; ამას დაუმატეთ IV კომპლექსის საბოლოო საკონტროლო ეტაპი ციანიდით. თაგვის ტვინის უფრო ადრეულმა კვლევამ აჩვენა საღებავით როტენონით ბლოკირებული, მაგრამ არა ანტიმიცინით ბლოკირებული სუნთქვის აღდგენა. მოგვიანებით სამ სახეობაზე ჩატარებულმა კვლევამ კი ორივე ინჰიბიტორის შემთხვევაში ნაწილობრივი აღდგენა და ციტოქრომ c-ის უშუალო აღდგენის მტკიცებულება გამოავლინა. გვერდის ავლა განიხილეთ როგორც ახალ მონაცემებთან თავსებადი და არა საბოლოოდ დადასტურებული მექანიზმი, რადგან საღებავის კონცენტრაცია, ინჰიბიტორის მოქმედების უბანი, სუბსტრატის მდგომარეობა და საღებავის განაწილება დაკვირვებულ გზას ცვლის.

ანალიზის შერჩევის მატრიცა

ამ ცხრილით კითხვა გამოიყენეთ გაზომვის შესარჩევად და არა პირიქით.

დამაჯერებელი მტკიცების მინიმალური საფუძველია ერთი და იმავე საღებავის კონცენტრაციების — 100 nM, 300 nM, 1 uM და 2 uM — შემოწმება შემდეგი გაზომვებით: ჟანგბადის ნაკადი გაჟონვის, ADP-ის, ოლიგომიცინისა და განმაცალკევებლის პირობებში; ATP-ის სინთეზის სიჩქარე; მემბრანის პოტენციალი, სასურველია ორი ზონდით; და დაკალიბრებული ზეჟანგის გამოყოფა კატალაზისა და უჯრედების გარეშე კონტროლებით. წარმოადგინეთ ურთიერთდაკავშირებული მაჩვენებლების სრული ნაკრები: ჟანგბადის ნაკადი, ATP-ის წარმოქმნის სიჩქარე, ATP-ისა და ჟანგბადის თანაფარდობა, პოტენციალი და ზეჟანგი. ცალკე აღებული ნებისმიერი ეს რიცხვი გაზომვაა, რომლის მნიშვნელობაც ჯერ კიდევ დასადგენია.