მეთილენის ლურჯი და აუტოფაგია: AMPK, mTOR და ექსპერიმენტები ნეირონებზე

წარმოიდგინეთ, რომ უჯრედულ ექსპერიმენტს ატარებთ, ამატებთ მეთილენის ლურჯს და ხედავთ, როგორ მუქდება ბლოტზე ცილის ზოლი, რომელსაც LC3-II ეწოდება. მაცდურია, გამოაცხადოთ, რომ ნაერთი „აძლიერებს აუტოფაგიას“, და ამით დაკმაყოფილდეთ. ასეთი ინტერპრეტაცია ნაადრევია. უფრო მუქი LC3-II ზოლი შეიძლება ნიშნავდეს, რომ უჯრედი მეტ გამწმენდ ვეზიკულას ქმნის, ან იმას, რომ ვეზიკულები გროვდება, რადგან ნარჩენების დაშლის ეტაპი დაბლოკილია. ეს ორი ინტერპრეტაცია საპირისპირო მიმართულებებზე მიუთითებს, ხოლო მეთილენის ლურჯის ნეირონებზე მოქმედების შესახებ ლიტერატურაში ორივე ტიპის მტკიცებულების მაგალითები გვხვდება. ეს სტატია თითოეული ანალიზის მიხედვით განიხილავს, რა გაიზომა სინამდვილეში.

მაკროაუტოფაგია, რომლის ფორმაც აქ არის შესწავლილი, უჯრედის კომპონენტების მასობრივი გადამუშავების პროცესია. მემბრანული ტომარა, რომელსაც ფაგოფორი ეწოდება, გაცვეთილი ცილებისა და ორგანელების გარშემო იზრდება, იკეტება და აუტოფაგოსომად იქცევა, ერწყმის ლიზოსომას, რის შემდეგაც მისი შიგთავსი იშლება და ხელახალი გამოყენებისთვის გამოთავისუფლდება. ნეირონები ამ პროცესზე არიან დამოკიდებული, რადგან არ იყოფიან და გაყოფის გზით დაზიანებული კომპონენტების კონცენტრაციას ვერ ამცირებენ. როდესაც გადამუშავება ფერხდება, ნარჩენები გროვდება. როდესაც ის მიმდინარეობს, უჯრედი სტრესის პირობებში სამშენებლო კომპონენტებს აღიდგენს.

რა აჩვენა ერთმა ჰიპოკამპურ უჯრედებზე ჩატარებულმა ექსპერიმენტმა

ინდუქციის ძირითად კვლევაში გამოიყენეს თაგვის ჰიპოკამპის HT22 უჯრედები, რომლებიც 24 საათის განმავლობაში შრატის გარეშე დატოვებით სტრესს დაექვემდებარა. ამ პირობებში უჯრედებს აკლდება ზრდის ფაქტორები და ტროფიკული სიგნალები, რაც აპოპტოზსაც და აუტოფაგიასაც იწვევს. მკვლევრებმა განაცხადეს, რომ მეთილენის ლურჯი დოზაზე დამოკიდებულად ამცირებდა უჯრედების სიკვდილს და ამ დაცვას მაკროაუტოფაგიის ნიშნებიც ახლდა.

მარკერების ცვლილებები კონკრეტული იყო. დაახლოებით 20 nM მეთილენის ლურჯიდან დაწყებული, LC3B-ის დიფუზური შეღებვა ბირთვის ირგვლივ წერტილოვან კერებად გადანაწილდა; LC3-I-ისა და LC3-II-ის ყველაზე ძლიერი პასუხი დაახლოებით 1 μM-ზე გამოვლინდა. LC3B-I-იც და LC3B-II-იც დოზასა და დროზე დამოკიდებულად გაიზარდა. განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია, რომ ჯგუფი მხოლოდ სტატიკური LC3 ბლოტით არ შემოიფარგლა. მათ დაამატეს 10 μM ქლოროქინი, რომელიც ლიზოსომურ დაშლას ბლოკავს, და მეთილენის ლურჯით დამუშავებულ უჯრედებში აღმოაჩინეს უფრო მაღალი LC3-II და სტაბილიზებული p62. ეს სურათი ლიზოსომაზე დამოკიდებულ ბრუნვას უჭერს მხარს და არა მხოლოდ დაგროვებას. მათ ასევე აჩვენეს, რომ ქლოროქინმა ნაწილობრივ შეასუსტა ანტიაპოპტოზური ეფექტი, რაც ამ მოდელში დაცვას აუტოფაგიისა და ლიზოსომურ გზას უკავშირებს.

ყველაზე ხშირად არასწორად სწორედ სიგნალიზაციის შედეგს ციტირებენ. AMPK სიგნალიზაცია, რომელიც ფოსფორილირებული AMPK-ითა და მის ქვემოთ მოქმედი სამიზნით, ფოსფორილირებული ACC-ით შეფასდა, 12 და 24 საათზე დოზაზე დამოკიდებულად გაიზარდა. AMPK-ის ინჰიბიტორმა Compound C-მ, რომელიც ბოლო 4 საათის განმავლობაში 20 μM კონცენტრაციით გამოიყენეს, შეამცირა როგორც ACC-ის ფოსფორილირება, ისე LC3-ის აქტივაცია. ამის საპირისპიროდ, ფოსფორილირებული mTOR-ის შესამჩნევი დათრგუნვა არ გამოვლენილა. ამგვარად, სტრესის ქვეშ მყოფ ჰიპოკამპურ უჯრედებში შედეგი იყო AMPK-თან დაკავშირებული ინდუქცია, როგორც ჩანს, mTOR-ისგან დამოუკიდებელი გზით. იგივე სურათი გამოვლინდა ცოცხალ თაგვებშიც, რომლებშიც მეთილენის ლურჯით დამუშავებამ ქერქსა და ჰიპოკამპში მაკროაუტოფაგიის მარკერები გამოიწვია.

ინდუქცია არ ნიშნავს დასრულებულ აუტოფაგიურ ნაკადს

აქ ცნებებს შორის განსხვავება განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია. ინდუქცია ნიშნავს, რომ პროცესის საწყისი მექანიზმები მეტ აუტოფაგოსომას წარმოქმნის. ნაკადი ნიშნავს, რომ შიგთავსი მთელ გზას გადის: იზოლაციას, მომწიფებას, ლიზოსომასთან შერწყმას, დაშლასა და ხელახალ გამოყენებას. LC3-II-ის ყოველი ზრდა მხოლოდ ინდუქციის შესახებ დასკვნის საფუძველია, სანამ ნაკადის ტესტი გზის დანარჩენ ნაწილს არ დაადასტურებს.

ნაკადის სტანდარტული ტესტი ზომავს LC3-II-ს ლიზოსომური ფუნქციის ხანმოკლე ბლოკადის, მაგალითად, ბაფილომიცინ A1-ის ან ქლოროქინის, გამოყენებით და მის გარეშე. თუ დამუშავება მართლაც აჩქარებს წარმოქმნას, დაშლის ბლოკირებამ LC3-II კიდევ უფრო უნდა გაზარდოს. ტანდემური mCherry-GFP-LC3 რეპორტერი შეფასების მეორე გზას იძლევა: ლიზოსომასთან შერწყმამდე სტრუქტურები ყვითლად ანათებს, ხოლო მას შემდეგ, რაც მჟავე გარემო GFP-ის სიგნალს აქრობს, მხოლოდ წითლად. ამიტომ მხოლოდ წითელი წერტილოვანი კერების მატება მჟავე აუტოლიზოსომებში გადასვლას უჭერს მხარს. p62 ცილის შემცირებამ შეიძლება შიგთავსის ბრუნვა დაადასტუროს, თუმცა გასათვალისწინებელია, რომ p62-ის ტრანსკრიფციაც რეაგირებს სტრესზე და mRNA-ის დონეზე უნდა შემოწმდეს.

ქვემოთ მოცემული საკონტროლო სია ამ ლიტერატურაში გამოყენებულ თითოეულ ანალიზს უკავშირებს იმას, თუ რას ზომავს და რას ვერ ამტკიცებს დამოუკიდებლად. მკითხველებს შეუძლიათ ის გამოიყენონ მაკროაუტოფაგიის შესახებ ნებისმიერი მომავალი მტკიცების შესაფასებლად, მათ შორის შიმშილობასა და ხანგრძლივ სიცოცხლეზე მსჯელობისას, სადაც ამ მარკერებს ეყრდნობიან.

ყურადღება მიაქციეთ ერთ ტერმინოლოგიურ ხაფანგს, რომლის თავიდან აცილებაშიც ცხრილი გვეხმარება. ფოსფორილირებული ACC ფერმენტულად ინჰიბირებული ფორმაა. მისი მატება AMPK-ის მოქმედებას აჩვენებს და არა ACC-ის აქტივაციას.

გამოთქმა „მაკროაუტოფაგიის ინჰიბირებამ ნეიროპროტექცია გააქრო“ იმავე სიზუსტეს მოითხოვს. HT22 მოდელში ეს ნიშნავს, რომ აუტოფაგიისა და ლიზოსომური გზის შეფერხებამ შრატის გარეშე პირობებში მეთილენის ლურჯის მიერ უჯრედების გადარჩენისთვის შექმნილი უპირატესობა გააქრო. ეს ამ კულტურაში აუტოფაგიის აუცილებელ ან ხელშემწყობ როლს უჭერს მხარს. თუმცა არ ადგენს, რომ აუტოფაგია ნაერთის ერთადერთი დამცავი მექანიზმია, არ ამტკიცებს, რომ ქლოროქინი მხოლოდ აუტოფაგიის გზით მოქმედებს, ხოლო მიზეზობრივი დასკვნის გასამყარებლად საჭირო იქნებოდა ATG5-ის, ATG7-ის ან ULK1-ის გენეტიკური ცვლილება.

ორი გზა ერთსა და იმავე მექანიზმამდე

გამარტივებული სქემა გაგებაში გვეხმარება. ენერგეტიკული სტრესი AMPK-ის აქტივობას ზრდის, AMPK ააქტიურებს ULK1 კომპლექსს და აუტოფაგია იწყება. ზრდის ფაქტორები და საკვები ნივთიერებები mTORC1-ის აქტივობას ზრდის, mTORC1 თრგუნავს ULK1-ს და აუტოფაგია გამორთული რჩება. ULK1-ის ქვემოთ, Beclin-1-ისა და VPS34-ის კომპლექსი ფაგოფორის წარმოქმნას იწყებს, LC3-I ლიპიდაციით LC3-II-ად გარდაიქმნება, აუტოფაგოსომა იკეტება, ერწყმის ლიზოსომას და შიგთავსი იშლება, რასაც p62-ის ბრუნვაც ახლავს.

დიაგრამა მეთილენის ლურჯის თითოეულ შედეგს ამ სქემაზე ათავსებს: ჰიპოკამპური უჯრედების შედეგს — AMPK-ის განშტოებასთან, წინამორბედი უჯრედების შედეგს — mTOR-ის განშტოებასთან.

ასეთი ხედვა ხსნის თითქოსდა შეუსაბამობას Xie-ს მეორე კვლევასთან. ვირთაგვის პროლიფერირებად ნერვულ წინამორბედ უჯრედებში ცალკე ექსპერიმენტმა აჩვენა, რომ 5 μM მეთილენის ლურჯი თრგუნავდა პროლიფერაციას და ხელს უწყობდა მოსვენების მდგომარეობას: Ki67-დადებითი უჯრედები შემცირდა 1 და 3 დღეს, მაშინ როცა უკვე განსაზღვრული ნეირონული დიფერენცირება უცვლელი დარჩა. იქ მექანიზმი mTOR სიგნალიზაციის დათრგუნვით მოქმედებდა: საერთო mTOR-ისა და ფოსფორილირებული mTOR-ის შემცირებას თან ახლდა p70S6K-ისა და 4EBP1-ის დაბალი ექსპრესია, აგრეთვე E1, B1, D1 და D2 ციკლინების დაქვეითება. დომინანტური ფენოტიპი წინამორბედი უჯრედების მოსვენების მდგომარეობა იყო, რაც ავტორებმა უჯრედული დაბერების გადავადებას დაუკავშირეს და არა სტრესის ქვეშ მყოფი ჰიპოკამპური უჯრედების გადარჩენას.

ამ ორ ნაშრომს შორის წინააღმდეგობა არ არის. AMPK და mTOR კონტექსტზე მგრძნობიარე ინტეგრატორებია და არა უცვლელი ჩამრთველები. სტრესის ქვეშ მყოფ ნეირონის მსგავს უჯრედს შეუძლია AMPK ჩართოს mTOR-ის გაზომვადი ინჰიბირების გარეშე, ხოლო მიტოგენებით სტიმულირებულ წინამორბედ უჯრედს შეუძლია იმავე ნაერთს უპასუხოს mTOR-ზე დამოკიდებული ზრდის მექანიზმების შენელებით. უჯრედის ტიპი, სტრესის კონტექსტი, კონცენტრაცია და გაზომვის დრო განსაზღვრავს, რომელი განშტოება დომინირებს. სწორედ ამიტომ ეკუთვნის მეთილენის ლურჯის გავლენა მიტოქონდრიულ ენერგეტიკასა და ჟანგვა-აღდგენით პროცესებზე იმავე სურათს: როგორც ნეიროპროტექციის მექანიზმების მიმოხილვა აღწერს, ნაერთი მოქმედებს, როგორც ელექტრონების ალტერნატიული გადამტანი, რთავს ანტიოქსიდანტურ და ანტიაპოპტოზურ სიგნალიზაციას, თრგუნავს MAO-სა და NOS-ს და ბიოგენეზისა და აუტოფაგიის გზით უკავშირდება მიტოქონდრიულ განახლებას. აუტოფაგია მრავალმხრივი მოქმედების მხოლოდ ერთი განშტოებაა და არა მთელი სურათი.

რას არ აჩვენებს ექსპერიმენტები

შრატის გარეშე დატოვება კულტურაში ტროფიკულ და მეტაბოლურ სტრესს მოდელირებს. ის მთელი ორგანიზმის შიმშილობას არ მოდელირებს: გლუკოზა, ამინომჟავები და მარილები ბაზალურ გარემოში რჩება, კვებითი ქცევა კი საერთოდ არ არსებობს. კულტურაში გამოყენებული კონცენტრაციები, 20 nM-დან 5 μM-მდე, არითმეტიკული გზით ადამიანის დოზებად ვერ გადაითვლება, რადგან განსხვავდება შეწოვა, ცილებთან შეკავშირება, ჟანგვა-აღდგენითი მდგომარეობა, მეტაბოლიზმი, ქსოვილებში დაგროვება და ზემოქმედების ხანგრძლივობა.

ადამიანებზე არცერთი კვლევა არ დაგეგმილა პაციენტებში მეთილენის ლურჯით გამოწვეული აუტოფაგიური ნაკადის დასადასტურებლად. მექანისტური მტკიცებულებები კვლავ უჯრედულ, ex vivo და ცხოველებზე ჩატარებულ კვლევებს ეყრდნობა, ხოლო მიმოხილვები კლინიკურ გამოყენებაზე გადატანის მტკიცებულებებს ჯერ კიდევ წინასწარ ეტაპზე მყოფად აღწერს. შესაბამისად, ეს კვლევები არ აჩვენებს, რომ მეთილენის ლურჯი შიმშილობას იმეორებს, აუტოფაგიის გზით ადამიანის სიცოცხლეს ახანგრძლივებს ან ადამიანის ტვინში აუტოფაგიურ ნაკადს ასრულებს. შიმშილობის მიმბაძველ მოქმედებასა და ხანგრძლივ სიცოცხლეზე მტკიცებებს საკუთარი კლინიკური მტკიცებულებები სჭირდება, ხოლო ადამიანებში მეთილენის ლურჯის სხვა ჩვენებებისთვის ჩატარებული კვლევები მხოლოდ ასოციაციის გამო აუტოფაგიის კვლევებად არ იქცევა. საკვები ნივთიერებების დეფიციტით გამოწვეული სტრესისა და ხანგრძლივი სიცოცხლის მოდელების კვლევები ამ ზღვრის გათვალისწინებით უნდა წავიკითხოთ.

შემდეგი ნაშრომის კითხვისას საკონტროლო სია თანმიმდევრულად გამოიყენეთ. ჯერ იკითხეთ, რომელი განშტოება შეიცვალა: AMPK, mTOR თუ არცერთი. შემდეგ იკითხეთ, LC3-ის შედეგს ნაკადის ტესტიც ახლდა თუ ის დამოუკიდებლად იყო წარმოდგენილი. შემდეგ შეამოწმეთ, გააქრო თუ არა გზის ბლოკირებამ სარგებელი და რომელი მეთოდით. კვლევა, რომელიც სამივე კითხვას პასუხობს, ძლიერი მექანისტური დასკვნის საფუძველს იძლევა. კვლევამ, რომელიც მხოლოდ პირველს პასუხობს, ნებადამრთველი სიგნალი აჩვენა, გზის დანარჩენი ნაწილი კი ჯერ კიდევ შეუსწავლელია.