რატომ გამოიყენება მეთილენის ლურჯი მჟავაგამძლე შეღებვისას კონტრასტულ საღებავად

ტექნიკოსი შეღებვის სრული თანმიმდევრობის დასრულების შემდეგ ნახველის ნაცხს ათვალიერებს. ლურჯ ფონზე წითელი ჩხირები გამოიკვეთება და პასუხში იწერება, რომ მჟავაგამძლე ბაცილები დაფიქსირდა. მეორე დღეს სხვა სლაიდზე ერთგვაროვანი ლურჯი ველი ჩანს, წითელი ჩხირების გარეშე, და პასუხში იწერება, რომ ტუბერკულოზზე შედეგი უარყოფითია. ამ ორი პასუხიდან ერთ-ერთი იმაზე მეტს ამტკიცებს, ვიდრე სლაიდი გვიჩვენებს, და ეს პირველი პასუხი არ არის.

გაუგებრობა ცნების არასწორ გაგებაშია. ტექნიკოსმა ლურჯი საღებავი გამოვლენის ქიმიური პროცესის ნაწილად მიიჩნია, თითქოს მეთილენის ლურჯი მიკობაქტერიების აღმოჩენას უწყობდა ხელს. ასე არ ყოფილა. იმ მომენტისთვის, როცა მეთილენის ლურჯი სლაიდს ეხება, ტესტი უკვე დასრულებულია. საღებავი მხოლოდ ფონს ღებავს, რათა შედეგი წაკითხვადი გახდეს. ეს სტატია განმარტავს მეთილენის ლურჯის დანიშნულებას მჟავაგამძლე შეღებვისას, რატომ გამოიყენება სწორედ ლურჯი და არა სხვა ფერი და რა დასკვნის გამოტანის უფლებას გვაძლევს ლურჯ ფონზე წითელი ფერი.

მოკლე პასუხი

მჟავაგამძლე შეღებვა დიფერენციული ტესტია, რომელიც სამ პრინციპს ეფუძნება. კარბოლფუქსინი, პირველადი საღებავი, იძულებით აღწევს ყველა უჯრედში, მათ შორის ცვილისებრი გარსის მქონე მიკობაქტერიებში. მჟავა-სპირტი, გამაუფერულებელი, ჩვეულებრივი უჯრედებიდან წითელ საღებავს აშორებს, მაგრამ მჟავაგამძლე უჯრედებიდან მის ამოღებას ვერ ახერხებს. შემდეგ მეთილენის ლურჯი, კონტრასტული საღებავი, ღებავს ყველაფერს, რასაც გამაუფერულებელმა საღებავი მოაშორა. შედეგად, არამჟავაგამძლე უჯრედები, მასპინძლის უჯრედები და ნარჩენები ლურჯად ჩანს, მჟავაგამძლე ბაცილები კი წითლად რჩება. კონტრასტული საღებავი კონტრასტს ქმნის. ის არ მონაწილეობს იმ ქიმიურ პროცესში, რომელიც უჯრედის მჟავაგამძლეობას განაპირობებს.

რას აკეთებს თითოეული ეტაპი

ქვემოთ მოცემული სქემა ფუნქციების განაწილებას აჩვენებს. პროცედურის გასაგებად წაიკითხეთ მარცხნიდან მარჯვნივ, ქვედა ზოლი კი შეგახსენებთ, რომ შეღებვის მეთოდების თითოეული ჯგუფი განსხვავებულ კითხვას პასუხობს.

პირველი ეტაპი შეღწევაა. მიკობაქტერიები ჩვეულებრივ წყალხსნარ საღებავებს ეწინააღმდეგება, რადგან მათი გარსი უჩვეულოდ ჰიდროფობურია, ამიტომ პროტოკოლი საღებავის იძულებით შეღწევას უზრუნველყოფს. ცილ-ნილსენის მეთოდში გაცხელება ორთქლის წარმოქმნამდე ფენოლის შემცველ კარბოლფუქსინს ცვილისებრ კედელში შეღწევას აიძულებს. კინიონის ცივ მეთოდში გაცხელებას პირველადი საღებავის გაცილებით ძლიერი შემადგენლობა ანაცვლებს, ზოგი მოდიფიცირებული, გაუცხელებელი ვარიანტი კი ზედაპირულად აქტიურ ნივთიერებებსაც ამატებს. ამერიკის მიკრობიოლოგიის საზოგადოების მჟავაგამძლე შეღებვის პროტოკოლებში ორივე შემადგენლობა ერთმანეთის გვერდითაა აღწერილი და კონცენტრაციების სხვაობა თვალსაჩინოა: გაცხელების მეთოდისთვის დაახლოებით 0.3 g ფუძე ფუქსინი ყოველ 100 mL-ზე, ცივი მეთოდისთვის კი დაახლოებით 4 g.

მეორე ეტაპი დიფერენცირებაა. მჟავა-სპირტი, რომელიც ჩვეულებრივ შედგება 3 mL კონცენტრირებული მარილმჟავასგან 97 mL 95 პროცენტიან ეთანოლში, წითელ საღებავს გამორეცხავს ყველა უჯრედიდან, რომლის კედელიც განსაკუთრებულ წინააღმდეგობას არ ავლენს. მიკობაქტერიული ლიპიდური გარსის მთლიანობის მქონე უჯრედები საღებავს ინარჩუნებს. მთელი მეთოდი სწორედ ამ ეტაპს ეფუძნება და ის ტექნიკის მიმართ ყველაზე მგრძნობიარეა, როგორც ქვემოთ განვიხილავთ.

ბოლო ეტაპი კონტრასტის შექმნაა. სლაიდზე ახლა წითელი მჟავაგამძლე უჯრედებია თითქმის უფერო, საღებავისგან დაცლილი უჯრედების ფონზე. მეთილენის ლურჯი, 0.3 პროცენტი w/v კონცენტრაციით, ამ ფონს ხილულს ხდის წითლისგან მაქსიმალურად განსხვავებული ფერით. კონტრასტული შეღებვა ხანმოკლეა: გაცხელების მეთოდში ჩვეულებრივ 20-დან 30 წამამდე, ცივი მეთოდის ზოგ ვარიანტში კი რამდენიმე წუთამდე გრძელდება. ხანგრძლივობა პროტოკოლზეა დამოკიდებული და არა თავად საღებავის თვისებაზე.

რატომ ეს საღებავი და რატომ ლურჯი

მეთილენის ლურჯი კათიონური ფუძე საღებავია. ეს ნიშნავს, რომ მისი შეფერილი იონი დადებით მუხტს ატარებს და გაუფერულებული ბაქტერიების, მასპინძლის უჯრედებისა და ნარჩენების უარყოფითად დამუხტულ ზედაპირებს უკავშირდება. OpenStax-ის მიკრობიოლოგიის სახელმძღვანელო მუხტების ამ ურთიერთქმედებას ფუძე საღებავების მოქმედების ზოგად პრინციპად აღწერს. თუმცა ამ შემთხვევაში მეთილენის ლურჯი ქიმიურად უნიკალური არ არის. კრისტალური იისფერი და საფრანინიც ფუძე საღებავებია. არჩევანი ოპტიკურია და არა ქიმიური.

წითელ ჩხირებს კონტრასტული შეფერილობის ფონი სჭირდება, ლურჯი კი წითელს ნათელი ველის მიკროსკოპიისთვის ყველაზე ხელსაყრელად უპირისპირდება. საფრანინი ცუდი კონტრასტული საღებავი იქნებოდა, რადგან მისი საბოლოო ვარდისფერ-წითელი შეფერილობა შენარჩუნებული კარბოლფუქსინის ფერს მეტისმეტად ჰგავს და პროცედურით შექმნილ განსხვავებას აქრობს. კრისტალური იისფერი მუქ იისფერ ფონს შექმნიდა, რომელიც ყურადღების მიპყრობაში წვრილ წითელ ბაცილებს გაუწევდა კონკურენციას. იმის ყველაზე მყარი დასტური, რომ აქ მთავარი კონტრასტია და არა ქიმიური მოქმედება, ჩანაცვლების შესაძლებლობაა: ზოგ ვეტერინარულ და მოდიფიცირებულ პროტოკოლში გამოიყენება მწვანე კონტრასტული საღებავები, მაგალითად მალაქიტის მწვანე და ბრილიანტის მწვანე, და ტესტი მაინც მუშაობს, რადგან ნებისმიერი მკაფიოდ განსხვავებული შეფერილობა იმავე ფუნქციას ასრულებს.

აქედან ორი პრაქტიკული დასკვნა გამომდინარეობს. პირველი: სტანდარტული რეცეპტი pH-ის კორექციას არ ითვალისწინებს; ეს ჩვეულებრივი 0.3 პროცენტიანი წყალხსნარი არ აგერიოთ ტუტე შემადგენლობებში, როგორიცაა ლეფლერის მეთილენის ლურჯი, რომლებიც შეღებვის განსხვავებულ კონცეფციას მიეკუთვნება. მეორე: გადაჭარბება საზიანოა. ჰისტოლოგიური ლიტერატურა კონკრეტულად აფრთხილებს, რომ ზედმეტად ინტენსიურმა ლურჯმა ფონმა შეიძლება მცირე რაოდენობის ბაცილები დაფაროს. ამიტომ სლაიდზე საღებავის პროტოკოლით დაშვებულზე მეტხანს დატოვება წაკითხვადობას ამცირებს და სანაცვლოდ არაფერს იძლევა.

უჯრედის კედლის ქიმია, რომელიც ტესტს შესაძლებელს ხდის

მჟავა-სპირტის განმასხვავებელი მოქმედების მიზეზი მიკობაქტერიულ გარსშია. მისი სტრუქტურული ბირთვი მიკოლილ-არაბინოგალაქტან-პეპტიდოგლიკანის კომპლექსია: პეპტიდოგლიკანი უკავშირდება არაბინოგალაქტანს, რომლის გარე ბოლოებზე ძალიან გრძელი ჯაჭვის მქონე მიკოლის მჟავებია მიმაგრებული. ისინი ქმნის ლიპიდებით მდიდარ გარე მიკომემბრანას, რომელსაც უჩვეულოდ დაბალი გამტარობა აქვს. მიკობაქტერიული გარე მემბრანის მიმოხილვა ამ არქიტექტურას დეტალურად აღწერს. ბარიერი ორივე მიმართულებით მოქმედებს. ის ეწინააღმდეგება საღებავის შეღწევას, რის გამოც საჭიროა გაცხელება ან უფრო ძლიერი პირველადი საღებავი, და ეწინააღმდეგება საღებავის ამოღებასაც, რის გამოც მჟავა-სპირტი შიგნით უკვე შეღწეულ კარბოლფუქსინს ვერ აშორებს. ჩვეულებრივ ბაქტერიებს ასეთი გარსი არ აქვს და საღებავს კარგავს. ამიტომ მჟავაგამძლეობა უმჯობესია გავიგოთ, როგორც ლიპიდური ბარიერის ეფექტი და არა ფუქსინის მიკოლის მჟავასთან ქიმიური შეკავშირება.

ეს ქიმიური თავისებურება გავრცელებულ გაუგებრობასაც ხსნის: მიკობაქტერიები გრამის მეთოდით სუსტად და არაპროგნოზირებადად იღებება; ზოგჯერ ჩანს მკრთალი, მძივისებრი ფორმები ან შეუღებავი, აჩრდილის მსგავსი კონტურები. მათი ჰიდროფობური კედელი კრისტალური იისფერის შეღწევას ზღუდავს. მჟავაგამძლე შეღებვა გრამის შეღებვის მოდიფიკაცია არ არის. ეს განსხვავებული დიფერენციული პრინციპია, რომელიც კედლის სხვა თვისებას ეფუძნება, როგორც დანარჩენი ორი მეთოდისთვის მარტივი შეღებვისა და გრამის შეღებვის შედარება აჩვენებს.

სამი მეთოდი, სამი კითხვა

ბაქტერიების ერთი საღებავით შეღებვის მეთოდების უფრო ფართო ჯგუფის გასაცნობად იხილეთ მიკროსკოპიული შეღებვის ატლასი.

რას ვერ ადასტურებს წითელი ლურჯ ფონზე

წითელი ჩხირები ნიშნავს, რომ ორგანიზმებმა მჟავა-სპირტის ზემოქმედების შემდეგ კარბოლფუქსინი შეინარჩუნეს. ეს მიგნება Mycobacterium tuberculosis-ს შეესაბამება, მაგრამ CDC-ის ტუბერკულოზის დიაგნოსტიკის სახელმძღვანელო პირდაპირ აღნიშნავს, რომ სხვა მიკობაქტერიებიც მჟავაგამძლეა. ამიტომ სახეობის იდენტიფიკაციას კულტივირება და ნუკლეინის მჟავების ტესტირება სჭირდება და არა ფერის შეფასება.

ტექნიკური შეცდომები ძირითადად გამორეცხვის ორ ეტაპს უკავშირდება. არასაკმარისი გაუფერულება ფონის მასალას წითლად ტოვებს და ცრუ დადებითი ინტერპრეტაციის რისკს ქმნის. ჭარბი გაუფერულება სუსტად შენარჩუნებულ პირველად საღებავს აშორებს და ცრუ უარყოფით შედეგებს უწყობს ხელს. ზედმეტად ინტენსიურად გამოყენებული კონტრასტული საღებავი მცირე რაოდენობის ბაცილებს ლურჯ ფონში ფარავს. სქელი ნაცხები, დალექილი რეაგენტები და დაბინძურებული გასარეცხი წყალი დამატებით არტეფაქტებს ქმნის.

რაც უნდა სწორად შესრულდეს ტექნიკა, მგრძნობელობას ორგანიზმების რაოდენობა ზღუდავს. ჩვეულებრივი ნაცხის მიკროსკოპიისთვის საჭიროა დაახლოებით 5,000-დან 10,000 ბაცილამდე ნახველის ყოველ მილილიტრში. CDC-ის მტკიცებულებების ადრინდელ მიმოხილვებში კულტივირებით დადასტურებულ ფილტვის ტუბერკულოზის შემთხვევებში ნაცხის მგრძნობელობა დაახლოებით 45-დან 80 პროცენტამდე იყო. ამიტომ უარყოფითი ნაცხი ტუბერკულოზს არასოდეს გამორიცხავს. CDC-ის მოქმედი რეკომენდაციები თითოეული ნაცხის პარალელურად კულტივირებას ითვალისწინებს და სულ მცირე ერთ რესპირატორულ ნიმუშზე ნუკლეინის მჟავების ამპლიფიკაციის ტესტირებას რეკომენდაციას უწევს, როდესაც განიხილება ფილტვის ტუბერკულოზი და შედეგი მართვის ტაქტიკას შეცვლიდა.

პრაქტიკული სამუშაო ავტორიზებული პროტოკოლებით უნდა შესრულდეს

სასწავლო აღწერები, მათ შორის ეს სტატია, კლინიკური სამუშაოს შესრულების უფლებას არ იძლევა. ლაბორატორიული პრაქტიკისთვის მიჰყევით ლაბორატორიის ვალიდირებულ სტანდარტულ სამუშაო პროცედურას, რომელიც შეესაბამება CDC-ის, APHL-ის ან CLSI-ის მოქმედ დოკუმენტებს; CDC-ის მჟავაგამძლე შეღებვის საცნობარო დოკუმენტი მის Stacks არქივში აჩვენებს, როგორ განსაზღვრავს ასეთი პროცედურები რეაგენტებსა და შედეგების აღრიცხვას. ტუბერკულოზის ნიმუშებზე მუშაობა ბიოლოგიური საფრთხის შეკავებას მოითხოვს: ნაცხები მზადდება ბიოლოგიური უსაფრთხოების კაბინეტში, რადგან მომზადებისას წარმოიქმნება აეროზოლები და შხეფები. CDC-ის ლაბორატორიული უსაფრთხოების მითითებებში აღნიშნულია, რომ თერმულად ფიქსირებული ნაცხებიც კი შეიძლება შეიცავდეს სიცოცხლისუნარიან ტუბერკულოზის ბაცილებს და მათ კვლავ დაბინძურებულ მასალად უნდა მოეპყროთ. CDC-ის საზოგადოებრივი ჯანმრთელობის სურათების ბიბლიოთეკის ჩანაწერი კარბოლფუქსინითა და მეთილენის ლურჯით შეღებილ ნაცხზე, რომელიც M. leprae-ს გამოსავლენად შეისწავლეს, სასარგებლოდ გვახსენებს, რომ მეთოდის გამოყენება ტუბერკულოზით არ შემოიფარგლება: ლურჯ ფონზე წითლის იგივე კონტრასტი გამოიყენება ყველგან, სადაც მჟავაგამძლე ორგანიზმებს ეძებენ, ხოლო გულდასმით მიღებული უარყოფითი პასუხიც აღრიცხვის ღირსი შედეგია.

მზა სლაიდის შეფასება

კონტრასტული საღებავის მნიშვნელობა პირველადი დათვალიერებისას ვლინდება. მცირე გადიდებით დათვალიერებისას მიკროსკოპისტი ჯერ ლურჯ ფონს იყენებს ნაცხის ხარისხის შესაფასებლად: უჯრედების თანაბარი განაწილება, ფოკუსირებისთვის მასპინძლის დაუზიანებელი უჯრედები და უხვი ნალექის არარსებობა. შემდეგ წითელი სავარაუდო ბაცილები ყურადღებას სწორედ იმიტომ იპყრობს, რომ სლაიდზე სხვა არაფერი არის წითელი. დადასტურება ზეთოვანი იმერსიით ხდება, როდესაც ნამდვილი ბაცილები მოსალოდნელ წვრილ, ზოგჯერ ოდნავ მოხრილ ან მძივისებრ ჩხირებად ჩანს და არა საღებავის ერთგვაროვან ნარჩენებად.

ფონის შეღებვა პასუხის ფორმულირებასაც განსაზღვრავს. წითელი ბაცილების მქონე სლაიდის პასუხში იწერება, რომ მჟავაგამძლე ბაცილები დაფიქსირდა, ხშირად ლაბორატორიის სკალის შესაბამისი ნახევრად რაოდენობრივი შეფასებით. სლაიდისთვის, რომელზეც წითელი ორგანიზმები არ ჩანს, იწერება, რომ მჟავაგამძლე ბაცილები არ დაფიქსირდა და არასოდეს — რომ ტუბერკულოზზე შედეგი უარყოფითია. განსხვავება მნიშვნელოვანია: ლურჯი ველი ადასტურებს, რომ შეღებვა შესრულდა, უჯრედებმა კონტრასტული საღებავი შეითვისეს და ოპტიკური პირობები ადეკვატური იყო, მაგრამ არაფერს ამბობს გამოვლენის ზღვარს ქვემოთ არსებულ ორგანიზმებზე. წითელი ჩხირების გარეშე ლურჯი ველი სლაიდის შესახებ ვალიდური შედეგია და არა პაციენტის მდგომარეობაზე საბოლოო დასკვნა.

გახსოვდეთ ფუნქციების განაწილება და პასუხების ფორმულირება მარტივი გახდება. კარბოლფუქსინი სავარაუდო ბაცილებს გამოავლენს. მჟავა-სპირტი ტესტს ასრულებს. მეთილენის ლურჯი მხოლოდ პასუხს ხდის წაკითხვადს: წითელმა მჟავის ზემოქმედების მიუხედავად საღებავი შეინარჩუნა, ლურჯმა კი დაკარგა. ყველაფერი დანარჩენი — სახეობა, ორგანიზმების რაოდენობა და კლინიკური მნიშვნელობა — სლაიდის მიღმა ჩატარებული სამუშაოდან დგინდება.