ლეფლერის ტუტე და პოლიქრომული მეთილენის ლურჯი საღებავების განმარტება

შეღებვის სამუშაო მაგიდაზე შეიძლება სამი ბოთლი იდგეს გვერდიგვერდ და თითოეულზე მეთილენის ლურჯის რომელიმე ვარიანტი იყოს მითითებული. ერთს აწერია მეთილენის ლურჯის 1%-იანი წყალხსნარი. მეორეს — ლეფლერის ტუტე მეთილენის ლურჯი. მესამეს — პოლიქრომული მეთილენის ლურჯი. საქმით დატვირთული თანამშრომელი ხელს უახლოეს ბოთლს წაავლებს. შემდეგ ნაცხი ზედმეტად მკრთალად, ზედმეტად ერთგვაროვან ლურჯად ან იისფრის მოულოდნელი ელფერებით იღებება, შედეგი კი ნიმუშს ბრალდება.

ეს ფორმულაციის პრობლემაა და არა ნიმუშის. სამი ხსნარი მონათესავე საღებავებს შეიცავს, მაგრამ შეღებვის განსხვავებულ კონცეფციებს ეფუძნება. ერთი უბრალო კათიონური საღებავია თითქმის ნეიტრალური pH-ით. მეორე იგივე საღებავია, რომლის მოქმედებაც ტუტითაა გაძლიერებული. მესამე კი უკვე აღარც არის ერთი საღებავი — ის მიზანმიმართულად დაჟანგული ნარევია. არასწორი ვარიანტის გამოყენებით შეღებვის პრინციპს ცვლით.

მოკლე პასუხი

მეთილენის ლურჯის ჩვეულებრივი წყალხსნარი საბაზისო ვარიანტია: დაახლოებით 1% საღებავი წყალში, მარტივი კათიონური საღებავი ბაქტერიების მორფოლოგიის შესასწავლად და ზოგადი მიკროსკოპიისთვის. ლეფლერის ტუტე მეთილენის ლურჯის მისაღებად წყლით განზავებულ სპირტოვან საწყის ხსნარს ემატება განზავებული ტუტის მცირე, ზუსტად გაზომილი რაოდენობა. ეს ზრდის pH-ს და აძლიერებს კათიონური საღებავის შეკავშირებას ბაქტერიების მჟავურ სტრუქტურებთან. პოლიქრომული მეთილენის ლურჯი ტუტე გარემოში დაჟანგვით მიზანმიმართულად მომწიფებული მეთილენის ლურჯია. ამიტომ ბოთლი ნარჩენ მეთილენის ლურჯთან ერთად შეიცავს დემეთილირებული ჰომოლოგების (azure A, azure B, azure C), თიონინისა და მეთილენის იისფრის ნარევს, რომელიც სხვადასხვა სტრუქტურას სხვადასხვა ელფერით ღებავს.

თუ მხოლოდ ერთი წინადადება უნდა დაიმახსოვროთ: გატუტიანება შეღებვის ინტენსივობას ცვლის, პოლიქრომირება კი — შეღებვის ფერებს.

მეთილენის ლურჯის ჩვეულებრივი წყალხსნარი: შედარების საწყისი წერტილი

უმარტივესი ფორმულაცია წყალში გახსნილი მეთილენის ლურჯია, ჩვეულებრივ 1% w/v კონცენტრაციით, ტუტის დამატებისა და დაჟანგვის გარეშე. ფერადი ნაწილაკი მეთილთიონინიუმის კათიონია ქლორიდის საწინააღმდეგო იონით — მცირე ზომის ბრტყელი ფენოთიაზინური საღებავი, რომელიც PubChem-ის მეთილენის ლურჯის ჩანაწერში მეთილთიონინიუმის ქლორიდადაა აღწერილი. როგორც კათიონი, ის უკავშირდება ნუკლეინის მჟავების ფოსფატურ ჩონჩხსა და ბაქტერიული უჯრედის კედლის მჟავურ ჯგუფებს და ღია ფონზე უჯრედებს ლურჯად ღებავს.

მისი უპირატესობა პროგნოზირებადობაა. ბირთვები და ბაქტერიები ლურჯად ჩანს. კონტრასტი ზომიერია. ძნელად შესამჩნევი ორგანიზმები შეიძლება სუსტად შეიღებოს — სწორედ ამ შეზღუდვის გამოსწორებას ცდილობდა ლეფლერი. მარტივი ბაქტერიული საღებავების უფრო ფართო ჯგუფის შესახებ, რომელსაც ეს ხსნარი მიეკუთვნება, იხილეთ ბაქტერიების მარტივი შეღებვის მიმოხილვა. აქაც მნიშვნელოვანია ნივთიერების ზუსტი იდენტიფიცირება: მეთილის ლურჯი სრულიად სხვა მოლეკულაა, როგორც ეს განმარტებულია სტატიაში მეთილის ლურჯისა და მეთილენის ლურჯის შედარება. ამიტომ კატალოგში მხოლოდ ფერის სახელით ძიებამ შეიძლება საღებავის არასწორ კლასამდე მიგიყვანოთ.

ლეფლერის ტუტე მეთილენის ლურჯი: იგივე საღებავი, გაძლიერებული მოქმედებით

ლეფლერის კლასიკური რეცეპტი აერთიანებს მეთილენის ლურჯის სპირტოვან საწყის ხსნარსა და წყალში განზავებულ ტუტეს. სახელმძღვანელოებში მოცემული ვარიანტები მოითხოვს 0.3 g საღებავს 30 mL 95%-იან ეთანოლში და 100 mL კალიუმის ჰიდროქსიდის 0.01%-იან წყალხსნარს (ან ეკვივალენტურად, 30 mL მეთილენის ლურჯის გაჯერებულ სპირტოვან ხსნარს, 100 mL გამოხდილ წყალსა და 1 mL 1%-იან KOH-ს). შედეგად მიიღება სამუშაო ხსნარი დაახლოებით 0.3% საღებავით და მკვეთრად ტუტე pH-ით. კომერციული ვარიანტებიც იმავე პრინციპს ეფუძნება, ხოლო Thermo Fisher-ის მიკრობიოლოგიური საღებავების კატალოგში ლეფლერის ტუტე მეთილენის ლურჯი პოლიქრომულ და წყალხსნარის ვარიანტებთან ერთად ცალკე პროდუქტადაა ჩამოთვლილი, თავისი განსხვავებული დანიშნულებით.

მთავარი მოქმედი ფაქტორი ტუტეა. pH-ის მატება ნიმუშზე არსებული კარბოქსილისა და ფოსფატის ჯგუფების დეპროტონაციას იწვევს და უარყოფითად დამუხტული უბნების სიმჭიდროვეს ზრდის. ამასთან, ეთანოლის საწყისი ხსნარი საღებავს სრულად გახსნილ მდგომარეობაში ინარჩუნებს, რათა ამ უბნებს მონომერული ფორმით მიაღწიოს. შედეგად ბაქტერიები უფრო სწრაფად და ინტენსიურად იღებება, ვიდრე ნეიტრალური წყალხსნარით; რუტინულ ბაქტერიოლოგიურ ნაცხში მიიღება ნაცნობი მუქი ლურჯი ჩხირები და კოკები. შეღებვას ჩვეულებრივ ერთიდან სამ წუთამდე სჭირდება, რის შემდეგაც ნიმუშს წყლით ავლებენ.

კლასიკური გამოყენების მაგალითია ლეფლერის შრატის საკვებ არეზე გაზრდილი Corynebacterium diphtheriae: წვრილი, ხშირად კომბლისებრი ჩხირები ძლიერად შეღებილი მეტაქრომატული ბაბეშ-ერნსტის გრანულებით, რომლებიც დაგროვილ პოლიფოსფატს შეიცავს. საკვები არისა და საღებავის ეს შეხამება ისტორიულია — ორივე იმავე ბაქტერიოლოგს მიეწერება, ხოლო გრანულების კონტრასტი დიაგნოსტიკური სარგებელია. დიფთერიასთან დაკავშირებული სამუშაოს გარდა, ეს საღებავი გამოიყენება კულტურებიდან მომზადებული ნაცხების ზოგადი ბაქტერიოლოგიური შეღებვისთვის, კლინიკურ ნაცხებში Neisseria-ს მორფოლოგიის შესასწავლად და ყველგან, სადაც გრამის წესით შეღებვა საჭირო არ არის, მაგრამ ჩვეულებრივი წყალხსნარის ლურჯი მეტისმეტად მკრთალ შედეგს იძლევა. ეს მონოქრომული საღებავია. ყველა მჟავური სტრუქტურა ლურჯის რომელიმე ელფერით იღებება. როცა პროტოკოლი ფერით დიფერენცირებას მოითხოვს, მხოლოდ ტუტე ამას ვერ უზრუნველყოფს.

ერთი პრაქტიკული გაფრთხილება: შენახვისა და ნახშირორჟანგის შთანთქმისას საღებავის ტუტე ხსნარები ფუჭდება და ნალექს წარმოქმნის. ამიტომ ლაბორატორიები ან მცირე მოცულობებს ამზადებენ, ან კატალოგიდან მზა ხსნარს ყიდულობენ და მის ვარგისიანობის ვადას იცავენ, ნაცვლად იმისა, რომ ძველი ბოთლის გამოყენება გააგრძელონ, რომელიც უკვე ყოველ სასაგნე მინაზე ნალექს ტოვებს.

პოლიქრომული მეთილენის ლურჯი: ერთი სახელი, რამდენიმე საღებავი

პოლიქრომული მეთილენის ლურჯის მისაღებად იმავე საღებავს ტუტე გარემოში კონტროლირებადად ჟანგავენ; ისტორიულად ამ პროცესს მომწიფებას ან პოლიქრომირებას უწოდებდნენ. ტუტე გარემოში დაძველება, კარბონატთან ერთად გაცხელება ან ისეთი აგენტებით დაჟანგვა, როგორიცაა დიქრომატი, დიმეთილამინო ჩამნაცვლებლებს მეთილის ჯგუფებს ეტაპობრივად აშორებს. პროდუქტი ნარევია: ნარჩენი მეთილენის ლურჯი და azure B (ერთი მეთილის ჯგუფის დაკარგვით), azure A და azure C (შემდგომი დემეთილირებით), თიონინი (სრულად დემეთილირებული) და მეთილენის იისფრის ოჯახის ჟანგვითი გვერდითი პროდუქტები. თითოეულ კომპონენტს თავისი ელფერი და ქსოვილებისადმი აფინობა აქვს, ამიტომ ნარევი მეტაქრომატულად ღებავს: ბირთვები, გრანულები, მუცინები და ხრტილი ლურჯიდან წითელ-იისფრამდე განსხვავებულ ტონებს იღებს.

ცნობილი სისხლის საღებავებიც იმავე ქიმიას ეფუძნება. ადრეულმა მკვლევრებმა აღმოაჩინეს, რომ გატუტიანებული მეთილენის ლურჯი მალარიის პარაზიტების ბირთვებს იისფრის სხვადასხვა ელფერით ღებავდა, თუმცა მათი მომწიფებული წყალხსნარები არასტაბილური იყო და რამდენიმე დღეში ნალექს წარმოქმნიდა. მიმოხილვა იმის შესახებ, თუ როგორ შეიქმნა სისხლის იისფერი საღებავი, აღწერს, როგორ გამოიყენეს მალახოვსკიმ და რომანოვსკიმ ერთმანეთისგან დამოუკიდებლად ეს ეფექტი 1891 წელს; როგორ შემოიღეს მეთანოლი საღებავის ნალექის სტაბილიზაციისა და ნაცხების გაცხელების გარეშე ფიქსაციისთვის; და როგორ მოახდინა მოგვიანებით გიმზამ ნარევის სტანდარტიზაცია გაზომილი რაოდენობის azure B-სა და ეოზინის საფუძველზე, გლიცეროლით სტაბილიზაციით. თანამედროვე გიმზას ტიპის საღებავები უშუალოდ პოლიქრომული მეთილენის ლურჯისა და ეოზინისგან მომდინარეობს — კომბინაციისგან, რომელიც რომანოვსკის ეფექტს წარმოქმნის. ეოზინთან შეხამებისა და azure B კომპონენტის შესახებ დაწვრილებით იხილეთ რომანოვსკის ტიპის საღებავები და azure B-სა და ეოზინის ურთიერთქმედება.

რადგან ნარევია, პოლიქრომული მეთილენის ლურჯი თავისი ბუნებით ამ სამიდან ყველაზე ნაკლებად სტანდარტიზებულია. მისი ელფერების ზუსტი ბალანსი დაჟანგვის გზასა და ხარისხზეა დამოკიდებული. ამიტომ ჰისტოლოგიის მომწოდებლები მას ყიდიან არა როგორც დაძველებულ ლეფლერის ხსნარს, არამედ ცალკე პროდუქტად, რომლის სამუშაო მახასიათებლებიც დამოუკიდებლად მოწმდება. ტიპური გამოყენებები მოიცავს პოხიერი უჯრედების გრანულების, მუცინებისა და ხრტილის მეტაქრომატულ გამოვლენას, პლაზმური უჯრედების დეტალების წარმოჩენას და ქსოვილის ანათლებში Helicobacter pylori-ს გამოვლენას გუდპასჩერის ტიპის პოლიქრომული მეთოდებით. ეს სწორი არჩევანია, როცა ამოცანა ფერით დიფერენცირებაა, და არასწორია, როცა პროტოკოლი მკაფიო მონოქრომულ ბაქტერიულ სილუეტს მოითხოვს.

ფორმულაციებისა და დანიშნულებების შედარება

ცხრილი გადაწყვეტილების მიღების გზამკვლევად გამოიყენეთ. თუ ნიმუში მეტისმეტად მკრთალად იღებება, შეცვალეთ pH-ზე დაფუძნებული მიდგომა და ლეფლერის ხსნარი აირჩიეთ. თუ ყველაფერი იღებება, მაგრამ ერთმანეთისგან არაფერი გამოირჩევა, შეცვალეთ საღებავზე დაფუძნებული მიდგომა და პოლიქრომული ვარიანტი აირჩიეთ. თუ ლეფლერით შეღებილ ნაცხში გრანულები შესანიშნავად ჩანს, მაგრამ ხელმძღვანელი კითხულობს, რატომ არის ბირთვებიც და ციტოპლაზმაც ერთნაირად ლურჯი, პასუხი ასეთია: ვერცერთი ტუტე მონოქრომული საღებავი ამ დიფერენცირებას ვერ უზრუნველყოფს. ეს ამოცანა პოლიქრომულ ოჯახსა და მისგან წარმოებულ სისხლის საღებავებს ეკუთვნის.

გავრცელებული აღრევების თავიდან აცილება

დაბნეულობის უმეტესობას ორი შეცდომა იწვევს. პირველი — ლეფლერის ხსნარის ჩვეულებრივ მეთილენის ლურჯთან ურთიერთჩანაცვლებად მიჩნევა, რადგან ბოთლში ორივე ლურჯად გამოიყურება. ისინი pH-ითა და ინტენსივობით განსხვავდება. იქ, სადაც ლეფლერის ხსნარია მითითებული, ნეიტრალური საღებავის ჩანაცვლებით სწორედ ის გრანულების კონტრასტი იკარგება, რომლისთვისაც პროტოკოლი შეიქმნა. მეორე შეცდომაა ნებისმიერი ძველი ან შემთხვევით დაძველებული ტუტე ლურჯი ხსნარის პოლიქრომულად მიჩნევა. უკონტროლო დაძველება უცნობი კონცენტრაციის უცნობ ნარევს წარმოქმნის, მაშინ როდესაც ნამდვილი პოლიქრომული ხსნარები დაჟანგვის განსაზღვრული მეთოდებით მზადდება და, სისხლის საღებავების განვითარების ხაზში, ეოზინის გაზომილ რაოდენობასთან ერთიანდება. ამ მხრივ ისტორია საყურადღებოა: 1890-იანი წლების არასტაბილური მომწიფებული წყალხსნარები მეთანოლით სტაბილიზებულმა ფორმულაციებმა სწორედ იმიტომ ჩაანაცვლა, რომ უკონტროლო ნარევების გამეორებით მიღება შეუძლებელი იყო. ეს გაკვეთილი ღირს გაიხსენოთ, სანამ დიაგნოსტიკურ პრეპარატს უცნობი ასაკის ბოთლიდან შეღებავთ.

სახელწოდების ზუსტი შემოწმება ამ პროცესს ასრულებს. ეტიკეტზე გადაამოწმეთ კატალოგის პროდუქტი (წყალხსნარი, ლეფლერის თუ პოლიქრომული), საღებავის შემცველობა და დანიშნულება, ნაცვლად იმისა, რომ დასკვნა ფერით გამოიტანოთ. სამივე ფორმულაციას საერთო ქრომოფორული წინაპარი ჰყავს. დანიშნულება კი საერთო არ აქვთ.