ახალი მეთილენის ლურჯი და რეტიკულოციტების შეღებვა: განსხვავებული საღებავი და ცოცხალი უჯრედების მეთოდი

სტუდენტი რეტიკულოციტების დასათვლელად ემზადება, უკვეთავს მეთილენის ლურჯს, ურევს მას სისხლს და თითქმის ვერაფერს ხედავს. მისი თანაკურსელი იყენებს ბოთლს წარწერით „ახალი მეთილენის ლურჯი“ და ერითროციტების ნაწილში მკაფიო ლურჯ ძაფებს იღებს. პირველი სტუდენტი ფიქრობს, რომ მეორე ბოთლის შიგთავსი უფრო ახალი ან უფრო კონცენტრირებულია. არც ერთია და არც მეორე. ის განსხვავებულ მოლეკულას შეიცავს.

ამ სფეროში გაუგებრობების უმეტესობას სწორედ ეს მცდარი წარმოდგენა უდევს საფუძვლად. სახელწოდება გვაფიქრებინებს, რომ ახალი მეთილენის ლურჯი მეთილენის ლურჯის გაუმჯობესებული პარტიაა. ქიმიური თვალსაზრისით კი ასე არ არის. ახალი მეთილენის ლურჯი N დამოუკიდებელი ფენოთიაზინური საღებავია, რომელსაც აქვს საკუთარი Colour Index ნომერი, ჩამნაცვლებლების განლაგება და სტანდარტიზებული როლი ჰემატოლოგიაში. ამ განსხვავების გარკვევის შემდეგ მეთოდის დანარჩენი საკითხებიც გასაგები ხდება: რატომ უნდა იყოს უჯრედები ცოცხალი შეღებვისას, რა ითვლება რეტიკულოციტად, რა ადგილი უკავია ჰაინცის სხეულაკებს და როდის გამოიყენება ბრილიანტური კრეზილის ლურჯი.

მოკლე პასუხი

ახალი მეთილენის ლურჯი N, ჰემატოლოგიური რეაგენტი, ჩვეულებრივ იდენტიფიცირდება როგორც Basic Blue 24 ახალი მეთილენის ლურჯის PubChem ჩანაწერში, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, ფორმულა C18H22ClN3S. ჩვეულებრივი მეთილენის ლურჯი არის მეთილთიონინიუმის ქლორიდი, Basic Blue 9, მის PubChem ჩანაწერში, C.I. 52015, CAS 61-73-4, ფორმულა C16H18ClN3S. სტრუქტურულად, ახალ მეთილენის ლურჯს რგოლზე ორი მეთილის ჯგუფი და ეთილამინური გვერდითი ჯაჭვები აქვს, ხოლო მეთილენის ლურჯს — დიმეთილამინური ჯგუფები. ეს განსხვავება შეღებვის თავისებურებებს ცვლის. ჰემატოლოგიის სახელმძღვანელოებში ჩვეულებრივი მეთილენის ლურჯი აღწერილია როგორც რეტიკულოციტების შედარებით სუსტი საღებავი, ხოლო ახალი მეთილენის ლურჯი — როგორც უფრო ინტენსიური და თანაბარი შეღებვის საშუალება. ეს შედარება შეჯამებულია ScienceDirect-ის თემაში ახალი მეთილენის ლურჯის შესახებ.

დიახ, ახალი მეთილენის ლურჯი სუპრავიტალური საღებავია. სუპრავიტალური შეღებვა ნიშნავს ცოცხალი უჯრედების შეღებვას ორგანიზმიდან ამოღების შემდეგ და ფიქსაციამდე, როგორც ეს განსაზღვრულია NCBI-ის მიმოხილვაში სუპრავიტალური შეღებვის პრინციპების შესახებ. ამ კატეგორიას მიეკუთვნება როგორც ახალი მეთილენის ლურჯი, ისე ბრილიანტური კრეზილის ლურჯი, ხოლო რეტიკულოციტების CLSI სტანდარტში ახალი მეთილენის ლურჯი პირდაპირ არის განხილული როგორც სუპრავიტალური საღებავი. სტუდენტები ზოგჯერ ამ მეთოდს ფიქსირებული ნაცხების რომანოვსკის მეთოდით შეღებვას უკავშირებენ. აქ ეს წარმოდგენა არ გამოდგება. თუ ჯერ ფიქსაციას ჩაატარებთ, მეთოდი აღარ იმუშავებს.

მსგავსი სახელწოდების საღებავებით დაინტერესებული მკითხველებისთვის სტატია მეთილის ლურჯი და მეთილენის ლურჯი განიხილავს სხვა, უფრო ფართო გაუგებრობას ანიონურ ტრიარილმეთანურ საღებავსა და კათიონური ფენოთიაზინების ოჯახს შორის. ლაბორატორიული შეღებვის მიმოხილვა სუპრავიტალურ შეღებვას ფიქსირებული ნაცხების მეთოდების გვერდით განიხილავს, ხოლო სისხლის უჯრედების მორფოლოგიის გზამკვლევი აჩვენებს, რა ადგილი უკავია რეტიკულოციტების შეფასებას უფრო ფართო დიფერენციულ შეფასებაში.

ერთი საყურადღებო შენიშვნა კატალოგებისთვის: არსებობს ახალი მეთილენის ლურჯის ცალკე, თუთიის ქლორიდთან ორმაგი მარილის ფორმა, CAS 6586-05-6 ნომრით. ამიტომ მეთოდების განყოფილებაში უნდა მიეთითოს მარილის ფორმა და მომწოდებელი და არა მხოლოდ გავრცელებული სახელწოდება.

რას აკეთებს სინამდვილეში სუპრავიტალური შეღებვა

რეტიკულოციტი ახალგაზრდა ერითროციტია, რომელმაც ბირთვი დაკარგა, მაგრამ ნარჩენი რიბოსომული RNA ჯერ კიდევ აქვს. შეუღებავ სველ პრეპარატში ეს RNA უხილავია. სუპრავიტალური საღებავი ცოცხალ უჯრედში აღწევს და ამ RNA-ს ლურჯ გრანულებად და ძაფებად გამოალექავს ან აერთიანებს. სწორედ ეს რეტიკულოფილამენტური მასალა ჩანს ზეთოვანი იმერსიის პირობებში. ამგვარად, ბადე შეღებვის პროდუქტია და არა წინასწარ არსებული ჩონჩხი, რომელიც შეფერადებას ელოდება. ამიტომ პროტოკოლის ცვლადები — საღებავის კონცენტრაცია, ბუფერი, სისხლისა და საღებავის თანაფარდობა, ტემპერატურა და დრო — ისეთივე მნიშვნელოვანია, როგორც საღებავის სახელწოდება.

პრაქტიკულად ეს მოქმედებების მკაცრ თანმიმდევრობას ნიშნავს: ჯერ ანტიკოაგულანტით დამუშავებული სისხლი შეურიეთ საღებავს, ჩაატარეთ ინკუბაცია, შემდეგ მოამზადეთ ნაცხები და შეისწავლეთ ისინი ფიქსაციისა და დამატებითი შეღებვის გარეშე. შეღებვამდე ფიქსაცია ან ისეთი დამატებითი შეღებვა, რომელიც სუსტად გამოხატულ ძაფებს ფარავს, ანადგურებს ინფორმაციას, რომელსაც დათვლა ეფუძნება.

რეტიკულოციტების პრაქტიკული პროტოკოლი ახალი მეთილენის ლურჯით

ერთი უნივერსალური შემადგენლობა არ არსებობს, ამიტომ მიუთითეთ ის, რომელიც გამოიყენეთ. სამი დოკუმენტირებული ვარიანტი განსხვავებების დიაპაზონს აჩვენებს.

ბრეხერის ტიპის კლასიკურ პროცედურაში გამოიყენება დაახლოებით 0.5 პროცენტიანი ახალი მეთილენის ლურჯი კალიუმის ოქსალატთან ერთად. მას თანაბარი მოცულობით ურევენ კარგად შერეულ, EDTA-ით დამუშავებულ სისხლს და ოთახის ტემპერატურაზე დაახლოებით 10-დან 15 წუთამდე აყოვნებენ. ფრთხილად ხელახლა შერევის შემდეგ ამზადებენ თხელ სოლისებრ ნაცხებს, ჰაერზე აშრობენ და ფიქსაციის გარეშე იკვლევენ 100x ზეთოვანი იმერსიის ობიექტივით. NCBI-ის რეტიკულოციტების დათვლის პროცედურა აღწერს ამ სამუშაო თანმიმდევრობასა და მასთან გამოყენებულ დასათვლელ ჩარჩოს.

დეისისა და ლუისის ვარიანტში გამოიყენება 1.0 პროცენტიანი ახალი მეთილენის ლურჯი ციტრატიან მარილიან ხსნარში. მას ურევენ სისხლის 2-დან 4 მოცულობას და ნაცხების მომზადებამდე 37 C-ზე 15-დან 20 წუთამდე აყოვნებენ. CLSI H44 პროცედურის ჰარმონიზაციის ახლახან განხორციელებულ ვარიანტში გამოიყენეს უფრო დაბალი კონცენტრაციის, 0.1 პროცენტიანი ხსნარი ფოსფატით ბუფერირებულ მარილიან ხსნარში, pH 7.4-ზე, 20 C-ზე 10 წუთიანი ინკუბაციით და ფიქსაციის გარეშე, როგორც აღწერილია NMB-ის ჰარმონიზაციის 2026 წლის კვლევაში.

დათვლის წესები ყველა ვარიანტში საერთოა. უჯრედი რეტიკულოციტად ჩათვალეთ, თუ ის შეიცავს სულ მცირე ორ განცალკევებულ, ლურჯად შეღებილ გრანულას ან ძაფის სეგმენტს; ეს გამორიცხავს საღებავის ცალკეულ დანალექს. რუტინული მუშაობისას დაითვალეთ სულ მცირე 1,000 ერითროციტი და რეტიკულოციტების რაოდენობა პროცენტულად მიუთითეთ. დაბალი პროცენტული მაჩვენებლებისას სტატისტიკური სიზუსტე მეტი უჯრედის დათვლას მოითხოვს. CLSI H44 მეთოდოლოგიის მიმოხილვაში აღნიშნულია, რომ რეტიკულოციტების დაახლოებით 1 პროცენტიანი მაჩვენებლისას დათვლის ცვალებადობის 5 პროცენტამდე შესამცირებლად საჭიროა დაახლოებით 4,400 უჯრედი; იხილეთ CLSI H44-ის მიმოხილვა De Gruyter-ზე. მილერის ოკულარული დისკი დიდი რაოდენობის უჯრედების დათვლას პრაქტიკულად შესაძლებელს ხდის. გაფილტრეთ საღებავი ან ახლად მოამზადეთ, რადგან დანალექი გრანულოვან ჩანართებს ჰგავს.

ჰაინცის სხეულაკები იმავე პრეპარატში

იმავე სუპრავიტალურ ნაცხში შეიძლება ჰაინცის სხეულაკებიც გამოჩნდეს. ისინი დაჟანგული და დენატურირებული ჰემოგლობინის აგრეგატებია და არა ნარჩენი RNA. ახალი მეთილენის ლურჯით მომზადებულ პრეპარატებში ისინი მრგვალი სხეულაკების სახით ჩანს, ხშირად ერთეულად და მემბრანასთან ახლოს, და რეტიკულოფილამენტურ მასალაზე უფრო ღია ლურჯად იღებება. ფიქსაციისა და დამატებითი შეღებვის შემდეგ ისინი ცუდად ნარჩუნდება, ამიტომ შეისწავლეთ არაფიქსირებული ნაცხი. ახლახან აღწერილ პროტოკოლში 20 მიკროლიტრ EDTA-ით დამუშავებულ სისხლს ურევდნენ 20 მიკროლიტრ 1 პროცენტიან ახალ მეთილენის ლურჯს და 15 წუთიანი ინკუბაციის შემდეგ ჰაინცის სხეულაკების შემცველ უჯრედებს 250 ერითროციტს შორის ითვლიდნენ; იხილეთ PMC-ის კვლევა, რომელშიც ეს პროცედურაა აღწერილი.

ორი განსხვავების ცოდნა მცდარ ინტერპრეტაციას აგარიდებთ. პირველი: მეთილის იისფერი და კრისტალური იისფერი ჰაინცის სხეულაკებს უფრო ინტენსიურად ღებავს, ვიდრე ახალი მეთილენის ლურჯი, როგორც აღნიშნულია ScienceDirect-ის თემაში ჰაინცის სხეულაკების შესახებ. ახალი მეთილენის ლურჯი მოსახერხებელი არჩევანია რეტიკულოციტებისა და ჰაინცის სხეულაკების ერთდროული შეფასებისთვის, მაგრამ ჰაინცის სხეულაკების სპეციალურად შესაღებად ყველაზე ძლიერი საღებავი არ არის. მეორე: ალფა-თალასემიის მატარებლობისას HbH ჩანართები სუპრავიტალური შეღებვის შემდეგ მთელ უჯრედში მრავალ წვრილ წერტილად ჩანს, ხოლო კლასიკური ჰაინცის სხეულაკები უფრო მცირერიცხოვანი, უფრო დიდი და ხშირად მემბრანასთან დაკავშირებულია. მესამე მსგავსი წარმონაქმნი საღებავის დანალექია: ის უჯრედების ფოკალური სიბრტყის გარეთ მდებარეობს და სხვადასხვა მხედველობის ველში განსხვავდება.

ბრილიანტური კრეზილის ლურჯი და ახალი მეთილენის ლურჯი

ორივე საღებავი რეტიკულოციტების სუპრავიტალური შეღებვისთვის გამოიყენება, მაგრამ სტანდარტიზაცია უპირატესობას ერთ-ერთ მათგანს ანიჭებს. CLSI H44-A2 რეტიკულოციტების მეთოდი, რომელიც ჰემატოლოგიის სტანდარტიზაციის საერთაშორისო საბჭოსთან ერთად შემუშავდა და წარმოდგენილია CLSI H44 სტანდარტის გვერდზე, ხელით შესრულებულ შედარებით მეთოდად განსაზღვრავს EDTA-ით დამუშავებული სისხლის ახალი მეთილენის ლურჯით შეღებვას. კლასიკური ჰემატოლოგიური სწავლებაც იმავე ვიზუალურ განსხვავებას აღწერს: ახალი მეთილენის ლურჯი ძაფებს უფრო ინტენსიურად და თანაბრად ღებავს, ხოლო ბრილიანტური კრეზილის ლურჯით მიღებული შედეგი პარტიებსა და ნიმუშებს შორის უფრო მეტად მერყეობს.

ამ სტატუსს დაზუსტება სჭირდება. ICSH-ის ანალიზატორების შეფასების სახელმძღვანელო ახალი მეთილენის ლურჯით შეღებვისა და ხელით მიკროსკოპიის მეთოდს საცნობარო შედარების მიდგომად იღებს, თუმცა მას სუბიექტურსა და შედარებით არაზუსტს უწოდებს და, ხელმისაწვდომობის შემთხვევაში, უპირატესობას ნაკადური ციტომეტრიის საცნობარო პროცედურებს ანიჭებს. 2022 წელს ჩატარებულმა 100 ნიმუშის შედარებამ გამოყენებულ ანალიზატორთან მიმართებით ბრილიანტური კრეზილის ლურჯისთვის უფრო მცირე სისტემური გადახრა აჩვენა, ვიდრე ახალი მეთილენის ლურჯისთვის; შედეგები აღწერილია PMC-ის შეღებვის მეთოდების შედარებაში. სტუდენტებისთვის დასაბუთებული შეჯამება ასეთია: გამოიყენეთ ახალი მეთილენის ლურჯი სტანდარტიზებულ ხელით შესასრულებელ შედარებით მეთოდად, ბრილიანტური კრეზილის ლურჯის ნებისმიერი ადგილობრივი მეთოდი გადაამოწმეთ მასთან ან ავტომატიზებულ მეთოდთან შედარებით და ორივე შემთხვევაში ელოდეთ ხელით მიკროსკოპიის შედეგების უფრო ფართო გაფანტვას. სტანდარტიზაციის ადრინდელ ლიტერატურაში ასევე რეკომენდებული იყო გაწმენდილი Azure B, როგორც ქიმიურად უფრო სუფთა ალტერნატივა, რადგან კომერციული საღებავების პარტიები ერთმანეთისგან განსხვავდებოდა; იხილეთ მარშალის კვლევა Azure B-ის შესახებ. ეს ხსნის, რატომ განიხილება მეთოდების განხილვისას დღემდე რეაგენტის სისუფთავის ხარისხი.

გავრცელებული შეცდომების თავიდან აცილება

წარუმატებელი პრეპარატების უმეტესობას ოთხი შეცდომა განაპირობებს. ახალი მეთილენის ლურჯი N-ის ნაცვლად ჩვეულებრივი მეთილენის ლურჯის შეკვეთა სუსტ შეღებვას იწვევს ქიმიური თვისებების და არა ტექნიკის გამო. შეფასებამდე ფიქსაცია ან დამატებითი შეღებვა სუპრავიტალურ სიგნალს აქრობს. საღებავის დანალექის გრანულებად დათვლა შედეგს ხელოვნურად ზრდის; ამას ორი გრანულის წესი და გაფილტრული საღებავი თავიდან აგაცილებთ. რეტიკულოციტების დაბალი პროცენტული მაჩვენებლისას ძალიან ცოტა უჯრედის დათვლა გვაძლევს რიცხვს, რომელიც ზუსტი ჩანს, მაგრამ ფართო ნდობის საზღვრები აქვს. ყველა ამ შეცდომას ერთი საერთო ნიშანი აქვს: მიკროსკოპისტი მიკროსკოპს აბრალებს იმას, რაც რეაგენტთან მუშაობის ეტაპზე განისაზღვრა.