Ngukur efek metilen biru ing mitokondria: oksigen, ATP, lan potensial membran

Upamane sawijining laboratorium nambahake metilen biru menyang mitokondria sing respirasine kaganggu lan ndeleng konsumsi oksigen mundhak. Ukara sing lumrah ditulis yaiku zat pewarna kasebut mulihake fungsi mitokondria. Ukara iku bisa wae salah. Fluks oksigen, sintesis ATP, lan potensial membran iku telung konsep sing beda. Katelune ana ing organel sing padha, kaya pencadangan, sinkronisasi, lan enggo bareng sing nggunakake folder awan sing padha: gegandhengan, nanging diatur dening paugeran sing beda. Yen siji dianggep padha karo liyane, interpretasine dadi salah, sanajan saben pangukuran kanthi teknis wis bener.

Metilen biru ndadekake kebingungan iki luwih gampang kedadeyan amarga zat iki melu ing sistem sing diukur. Zat iki ngalami siklus redoks kanthi nampa elektron ing bagean hulu lan nyumbangake ing bagean hilir, minangka kation lipofilik sing nglumpuk ing mitokondria kanthi energi, lan minangka senyawa biru pekat sing nyerep lan mancarake cahya ing pita sing padha karo probe umum. Siji asil pangukuran ora bisa njlentrehake kabeh iki. Pola sing bisa dipercaya, kaya sing dituduhake ing panaliten mitokondria Budapest, yaiku ngukur fluks oksigen ditambah laju sintesis ATP ditambah potensial membran ditambah pelepasan hidrogen peroksida, kanthi kontrol khusus kanggo zat pewarna ing saben langkah.

Respirometri ngukur fluks oksigen, dudu asil energi

Respirometri resolusi dhuwur, kanthi Oroboros Oxygraph utawa penganalisis fluks ekstraseluler Seahorse, nglaporake siji bab: sepira cepete oksigen direduksi. Cara iki ora nglaporake pira proton sing dipompa saben elektron, sepira gedhene gradien sing dipertahanke, utawa apa ATP sintase nggunakake gradien kasebut.

Istilah sing digunakake iku penting. Ing mitokondria terisolasi, substrat tanpa ADP menehi respirasi bocor, substrat kanthi ADP ing kadar jenuh menehi kapasitas fosforilasi oksidatif, lan titrasi agen pemutus gandhengan menehi kapasitas transfer elektron maksimal. Ing sel utuh, padanane ing Seahorse yaiku respirasi basal, respirasi sing gegandhengan karo ATP lan sensitif marang oligomisin, kebocoran proton, respirasi maksimal sing ditemtokake nganggo FCCP, lan konsumsi oksigen nonmitokondria sing tahan marang rotenon ditambah antimisin. Nyebut asil Seahorse minangka State 3 lan State 4 menehi kesan presisi sing ora didhukung dening preparasi kasebut, kaya sing dijlentrehake ing kerangka Agilent Mito Stress Test.

Metilen biru medhot gegayutan intuitif antarane oksigen luwih akeh lan energi luwih akeh. Ing mitokondria otak marmut terisolasi, zat pewarna 100 nM nganti 1 uM ningkatake konsumsi oksigen nalika istirahat kanthi substrat glutamat ditambah malat, suksinat, lan alfa-gliserofosfat, kanthi mundhak kira-kira 64 persen nalika nggunakake alfa-gliserofosfat. Nanging, respirasi sing dirangsang ADP ing mitokondria sehat meh ora owah, miturut panaliten mitokondria otak terisolasi. Amarga respirasi bocor mundhak nalika fluks sing dirangsang ADP tetep, rasio kontrol respirasi sing diitung mudhun. Penurunan iki ora ateges zat pewarna ngrusak mitokondria. Iki ateges zat pewarna nambah siklus redoks sing ngonsumsi oksigen saliyane respirasi normal. Uji konsumsi oksigen metilen biru sing mung nglaporake mundhake wis ngukur reaksi kimia sing nyata, nanging ora menehi katrangan apa-apa babagan konservasi energi.

Eksperimen pemulihan nuduhake bedane sing padha ing skala luwih gedhe. Nalika Kompleks I diblokir, fluks oksigen pulih kira-kira telung tikel, dene sintesis ATP mung pulih kira-kira 1.5 tikel. Luwih akeh oksigen tekan elektroda. Nanging luwih sithik saka oksigen kasebut sing digunakake kanggo ngasilake ATP. Saben pratelan babagan mundhake fosforilasi oksidatif mbutuhake data ATP minangka pasangane, saenake diandharake minangka rasio ATP saben oksigen kanthi konvensi panyebut sing dijlentrehake.

Uji ATP ngukur laju sintesis, sing ora bisa diganti nganggo pangukuran kandhungan

Uji ATP mangsuli pitakon sing beda: pira ATP sing diasilake saben satuan wektu. Pangukuran kinetik, kanthi luminesensi lusiferase kunang-kunang sing dilacak sajrone sawetara menit utawa uji gandhengan heksokinase ditambah glukosa-6-fosfat dehidrogenase sing diwaca ing 340 nm, ngasilake laju. Pangukuran ATP total ing siji titik pungkasan ngasilake kandhungan, sing nggambarake sintesis dikurangi konsumsi lan, yen mung dhewekan, menehi sethithik katrangan babagan fosforilasi oksidatif.

Klompok Budapest nggunakake cara enzimatik gandhengan kanthi adenilat kinase ditekan, lan nemokake yen metilen biru ing 1 nganti 2 uM ningkatake produksi ATP kanthi cilik nanging signifikan ing mitokondria sing diwenehi rotenon lan antimisin. Iki pancen pemulihan, nanging mung sebagean. Panaliten toksisitas TEGDMA entuk pola asil sing padha ing model liyane: monomer dental TEGDMA 5 mM nyuda banget respirasi sing gegandhengan karo Kompleks I saka kira-kira 286 dadi 28 satuan fluks, lan zat pewarna 2 uM mulihake dadi kira-kira 86.

Ana rong kontrol sing wajib kanggo senyawa redoks sing duwe warna. Kaping pisan, gunakake oligomisin kanggo nemtokake sepira akeh sintesis ATP sing diukur gumantung marang ATP sintase. Kaping pindho, tindakake uji perolehan maneh sawise nambah ATP kanthi jumlah sing dingerteni ing sistem tanpa sel, nganggo ATP kasebut ditambah reagen lengkap lan konsentrasi zat pewarna sing persis padha karo sing digunakake, paling ora 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM, lan 2 uM. Zat pewarna bisa nyerep cahya sing dipancarake, nyandhet enzim pelapor, utawa ngowahi kimia redoks reagen, lan pandhuan umum uji lusiferase nyaranake uji tandhing biokimia kanggo gangguan jinis iki. Aja nganggep 1 uM bebas artefak mung amarga pemadaman fluoresensi biasane luwih abot ing konsentrasi sing luwih dhuwur.

Probe potensial membran ngukur distribusi zat pewarna, dudu fluks

Safranin O, TMRM lan TMRE, rodamin 123, lan JC-1 kabeh minangka kation sing bisa ngliwati membran. Zat-zat kasebut nglumpuk ing matriks kanthi muatan negatif manut kesetimbangan elektrokimia, mula fluoresensi sakabehe nglaporake potensial kanthi ora langsung liwat panggonan probe kasebut. Ora ana siji-sijia sing ngukur ATP utawa fluks elektron.

Saben probe duwe preparasi sing paling cocog. Safranin O cocog kanggo mitokondria terisolasi lan sel sing digawe permeabel, biasane cedhak 2 uM kanthi eksitasi cedhak 495 nm lan emisi cedhak 585 nm, lan digunakake ing kahanan pemadaman fluoresensi nalika penyerapan probe ngowahi fluoresensi sakabehe. TMRM lan TMRE cocog kanggo sel utuh kanthi pemuatan ing konsentrasi nanomolar cilik ing mode tanpa pemadaman fluoresensi, nalika depolarisasi ngeculake zat pewarna lan fluoresensi mitokondria mudhun; ing pemuatan dhuwur, arah sinyal bisa malik amarga pemadaman fluoresensi dhewe. JC-1 menehi rasio ijo marang abang sing praktis, nanging gumantung marang pemuatan lan massa mitokondria, mula luwih ringkih kanggo pangukuran kuantitatif tinimbang TMRM sing dikontrol kanthi tliti. Kauntungan lan kekurangan iki diringkes ing tinjauan probe potensial membran mitokondria sing akeh digunakake.

Metilen biru nyebabake gangguan optik persis ing konsentrasi sing digunakake. Pita panyerepane cedhak 600 nganti 665 nm tumpang tindih karo emisi probe abang, mula efek filter internal, pemadaman fluoresensi, lan panyerepan cahya eksitasi kabeh bisa kedadeyan. Zat pewarna iki uga minangka kation lipofilik kapindho sing distribusine dhewe owah manut potensial sing lagi diukur. Cara ngreksa pangukuran yaiku nggunakake luwih saka siji probe ditambah blanko: probe wae, zat pewarna wae, probe ditambah saben konsentrasi zat pewarna, depolarisasi lengkap nganggo FCCP minangka acuan nol, lan saenake probe kapindho sing beda kanthi optik. Panaliten jalur alternatif Kompleks III menehi tuladha iki kanthi mbaleni pangukuran pemulihan potensial membran nganggo safranin O lan TMRM sawise inhibisi antimisin lan miksotiazol, lan entuk pemulihan kualitatif sing padha. Siji pelapor optik minangka pratandha. Rong pelapor sing mandhiri minangka bukti.

Telung preparasi, telung pitakon sing beda

Mitokondria terisolasi, sel sing digawe permeabel, lan sel utuh dudu setelan sensitivitas sing bisa diijolake ing siji uji. Katelune minangka konsep sing beda kanthi prinsip operasional sing beda.

Mitokondria terisolasi njaga rantai transport elektron, membran njero, lan piranti kerja matriks, nanging nyingkirake membran plasma, sitosol, lan arsitektur jejaring. Panyingkiran iku pancen tujuwane: substrat, ADP, inhibitor, lan konsentrasi zat pewarna ditemtokake kanthi pas, mula jalur bisa diidentifikasi. Nanging, pasokan substrat asli, pensinyalan, lan kabutuhan energi ilang.

Sel sing digawe permeabel tetep njaga mitokondria ing akeh bagean arsitektur sel, nanging ngidini substrat eksogen lan ADP mlebu liwat membran plasma sing dibukak. Preparasi iki minangka piranti sing pas kanggo ngenali cacat jalur substrat ing konteks sel. Permeabilisasi sing kakehan ngrusak membran njaba, lan regulasi sitosolik bisa kebilas metu.

Sel utuh njaga kabeh: alangan membran plasma, reduktan sitosolik, transport substrat endogen, jejaring mitokondria, lan kabutuhan ATP. Preparasi iki paling cedhak karo fisiologi lan paling adoh saka panjlentrehan mekanisme, amarga penyerapan, reduksi, lan panyekapan zat pewarna kabeh mbentuk paparan efektif ing mitokondria.

Panaliten TEGDMA kanthi sengaja nggunakake telung tataran kasebut: mitokondria otak terisolasi kanggo pemulihan oksidasi lan potensial dening zat pewarna, sel punca pulpa dental sing digawe permeabel utamane kanggo nemtokake yen gangguan dumunung ing oksidasi substrat sing gegandhengan karo Kompleks I, lan sel punca utuh kanggo ngukur efek neto fisiologis zat pewarna 2 uM marang konsumsi oksigen sing ditekan. Kanggo pamaca sing mbandhingake asil pangukuran mitokondria ing macem-macem preparasi, artikel panjlentreh pasangan babagan cara metilen biru mindhah elektron liwat rantai respirasi menehi latar mburi jalur, lan pandhuan maca panaliten respirasi metilen biru ngrembug logika dosis lan inhibitor.

Kontrol sing dibutuhake kanggo zat pewarna aktif redoks

Zat sing ngalami siklus redoks mbutuhake dhaptar kontrol sing luwih dawa tinimbang inhibitor biasa, amarga reaksi kimia saka zat pewarna wae bisa katon kaya proses biologis.

Kanggo respirometri, gunakake kamar sing mung isi larutan penyangga kanggo ngukur panyimpangan, kamar isi larutan penyangga ditambah zat pewarna tanpa bahan biologis, zat pewarna ditambah saben reduktan ekstraseluler sing ana ing uji, lan rotenon ditambah antimisin ing pungkasan kanggo nemtokake konsumsi oksigen nonmitokondria ing sel utuh. Elinga yen zat pewarna sing wis direduksi dioksidasi maneh kanthi mindhah elektron menyang oksigen kanggo mbentuk hidrogen peroksida, mula blanko zat pewarna wae tanpa donor elektron bakal ngira konsumsi oksigen tanpa sel luwih cilik tinimbang sing kedadeyan nalika NADH utawa NADPH wis kasedhiya.

Kanggo hidrogen peroksida, luwih becik nggunakake Amplex UltraRed sing dikalibrasi ditambah peroksidase lobak tinimbang zat pewarna DCFDA sing ora selektif, verifikasi nganggo katalase, lan uji pengaruhe panyinaran, amarga zat pewarna iki minangka fotosensitizer. Panaliten mitokondria otak nemokake yen beban peroksida mundhak luwih saka patang tikel ing konsentrasi zat pewarna mung 100 nM, dene eliminasi dadi luwih alon, kanthi peroksida kawangun langsung saka zat pewarna sing direduksi tanpa perantara superoksida. Rincian pamilihan probe lan kontrol cahya ana ing artikel pasangan babagan ngukur spesies oksigen reaktif ing eksperimen zat pewarna, lan pitakon sing luwih amba babagan kapan peroksida tumindak minangka sinyal utawa dadi beban dirembug bebarengan karo keseimbangan redoks seluler lan pratelan antioksidan.

Kanggo pratelan babagan jalur, uji loro situs inhibitor Kompleks III: antimisin A ing situs Qi lan miksotiazol ing situs Qo, ditambah pengujian titik pungkasan Kompleks IV nganggo sianida. Panaliten otak mencit sing luwih awal nglaporake pemulihan dening zat pewarna kanggo respirasi sing diblokir rotenon, nanging ora kanggo sing diblokir antimisin. Dene panaliten telung spesies sing luwih anyar nemokake pemulihan sebagean nganggo loro inhibitor kasebut lan bukti reduksi sitokrom c langsung. Anggep jalur alternatif iki cocog karo data sing luwih anyar, dudu minangka kesimpulan sing wis mesthi, amarga konsentrasi zat pewarna, situs inhibitor, kahanan substrat, lan distribusi zat pewarna kabeh ngowahi jalur sing diamati.

Matriks pamilihan uji

Gunakake tabel iki kanggo milih pangukuran adhedhasar pitakon, dudu kosok balene.

Pratelan minimal sing bisa ngyakinake kudu nggunakake konsentrasi zat pewarna sing padha, 100 nM, 300 nM, 1 uM, lan 2 uM, kanggo ngukur fluks oksigen ing kahanan bocor, ADP, oligomisin, lan agen pemutus gandhengan, laju sintesis ATP, potensial membran kanthi luwih becik nganggo rong probe, lan pelepasan peroksida sing dikalibrasi kanthi kontrol katalase lan tanpa sel. Laporake sakumpulan asil sing gegandhengan: fluks oksigen ditambah laju ATP ditambah ATP saben oksigen ditambah potensial ditambah peroksida. Saben angka kasebut, yen mung dhewekan, minangka pangukuran sing isih nggoleki makna.