Ngukur spesies oksigen reaktif ing eksperimen metilena biru

Rong laboratorium nindakake eksperimen sing saben-saben diarani eksperimen antioksidan metilena biru. Siji nglaporake yen zat pewarna iki nyuda spesies oksigen reaktif. Sijine nglaporake yen zat iki ngasilake spesies kasebut. Loro-lorone nuduhake kurva respons dosis sing cetha. Loro-lorone nglaporake kanthi jujur. Bedane dudu amarga penipuan utawa ora trampil. Bedane yaiku rong kelompok kasebut ngukur bab sing beda ing cahya sing beda, nganggo probe sing mangsuli pitakon sing beda, banjur nggambarake loro wangsulan kasebut nganggo tembung sing padha: ROS.

Metilena biru minangka molekul sing angel diukur kanthi tliti amarga melu ing reaksi kimia sing kudune diamati. Ing peteng, molekul iki mindhah elektron ing antarane donor lan akseptor, banjur bali menyang wujud wiwitane, siap mbaleni siklus. Nalika kena cahya, molekul iki dadi fotosensitiser, tekan kahanan triplet tereksitasi sing bisa mindhah energi menyang oksigen kanggo ngasilake oksigen singlet utawa mindhah elektron kanggo ngasilake radikal lan hidrogen peroksida. Saben probe sing dilebokake ing sistem kasebut bisa dioksidasi, direduksi, dilunturake, utawa ketutupan kanthi optis dening zat pewarna kasebut dhewe. Mula, pitakon kapisan kanggo saben asil pangukuran ROS ora tau bab pira angkane. Pitakon kasebut yaiku apa sing sejatine dideteksi dening uji, lan apa pengaruhe zat pewarna marang uji kasebut.

Amplex Red: uji hidrogen peroksida sing dikalibrasi

Kombinasi metilena biru lan Amplex Red minangka pasangan sing paling bisa dipertanggungjawabake ing literatur iki, yen disiyapake kanthi bener. Reaksi kimiane spesifik: peroksidase saka horseradish nggunakake hidrogen peroksida kanggo ngoksidasi substrat Amplex dadi produk fluoresen, resorufin, kanthi stoikiometri kira-kira siji bandhing siji. Peroksida saka sampel dadi fluoresensi ing detektor. Ora ana spesies liyane ing kelompok ROS sing umum diakoni sing langsung nyurung reaksi kasebut.

Kauntungan sing nemtokake yaiku kalibrasi. Peneliti sing tliti nguji standar peroksida sing wis dingerteni ing larutan penyangga sing padha, kanthi konsentrasi peroksidase lan substrat sing padha, wektu inkubasi sing padha, lan setelan optis sing padha, banjur maca asil sampel adhedhasar kurva kasebut. Ing panaliten mitokondria otak sing diisolasi sing dadi dhasar cara iki, para panulis nindakake persis kaya mangkono, nambahake peroksida kanthi jumlah sing wis dingerteni ing pungkasan saben pangukuran. Angkane dilaporake minangka laju ing pikomol saben menit saben miligram protein, dudu unit fluoresensi arbitrer. Iki sing ngowahi pendar dadi pangukuran.

Telung rincian saka panaliten kasebut pantes ditiru. Kapisan, para panulis mriksa sinyal nganggo katalase, sing ngrusak peroksida. Mundhake fluoresensi sing dipicu metilena biru mandheg nalika katalase ditambahake, saengga negesake yen sinyal kasebut saka peroksida, dudu artefak optis. Kapindho, dheweke nguji panyinaran kanthi langsung, nggunakake rana kanggo mbatesi berkas eksitasi supaya sampel mung nampa saprawolu dosis cahya normal, lan sinyale mung mudhun sangang persen. Luwih saka sangang puluh persen peroksida sing dilaporake ora gumantung marang cahya pangukuran. Katelu, dheweke ngukur panyingkiran peroksida kanthi kapisah nganggo elektroda lan nemokake yen zat pewarna kasebut nambah produksi lan alonake panyingkirane. Probe sing mung nglaporake fluoresensi neto bakal nyampurake rong efek kasebut.

Uji iki isih nduweni sawetara sebab sing bisa nggawe asil ora bener, lan metilena biru bisa micu sawetara ing antarane. Zat pewarna iki nyerep cahya ing rentang amba ing wilayah abang sing padha karo wilayah emisi resorufin, mula ing konsentrasi zat pewarna sing dhuwur, sampel bisa nutupi sinyale dhewe liwat efek filter internal. Mula, standar kudu ngemot konsentrasi zat pewarna sing padha karo sampel. Amplex Red uga bisa ngalami fotooksidasi dhewe, lan produke, resorufin, bisa mlebu siklus fotoredoks sing ngasilake superoksida lan peroksida. Bab iki nduweni pengaruh gedhe nalika eksperimen uga nyinari fotosensitiser. Cara praktis kanggo ngatasi yaiku nyinari sampel metilena biru dhisik, banjur nguji alikuote nganggo reagen Amplex ing peteng, tinimbang nyinari zat pewarna lan probe bebarengan. Pungkasan, superoksida dismutase ora mung nyuda sinyal Amplex: ngowahi superoksida dadi peroksida bisa nambah sinyal kasebut. Kontrol SOD sing nambah fluoresensi ora ateges gagal. Kontrol kasebut wis ngenali superoksida minangka spesies ing tahap sadurunge.

DCFDA: indikator oksidasi sing ora spesifik

Pasangan metilena biru lan DCFDA minangka sumber saka akeh kebingungan. DCFH-DA minangka prekursor sing dilebokake menyang sel. Esterase ing njero sel ngilangi gugus asetate supaya kari DCFH sing ora fluoresen, lan oksidasi DCFH ngasilake DCF sing fluoresen. Ana akeh zat sing bisa ngoksidasi: radikal hidroksil, zat antara peroksidase lan heme, nitrogen dioksida, asam hipoklorit, lan radikal sing asale saka peroksinitrit. Hidrogen peroksida dhewe ora langsung ngoksidasi kanthi laju sing migunani; fluoresensi sing gumantung marang peroksida umume mbutuhake wesi, protein heme, utawa reaksi kimia peroksidase ing proses kasebut.

Kritik sing kudune dirujuk dening saben bagean metode asale saka analisis DCFH minangka probe dening Kalyanaraman lan kanca-kancane, kaya sing diringkes ing panaliten mitokondria otak sing nolak DCFDA amarga sebab iki. Analisis kasebut nuduhake yen zat pewarna iki bereaksi alon, kanthi stoikiometri sing durung dikarakterisasi, tanpa kalibrasi sing sah, lan uga bereaksi karo senyawa sing dudu ROS. Probe kasebut uga nggedhekake apa sing diukur: oksidasi DCFH kanthi siji elektron ngasilake radikal DCF sing bereaksi karo oksigen kanggo ngasilake superoksida, sing banjur ngalami dismutasi dadi peroksida tambahan. Pangukuran kasebut sebagian ngasilake reaksi kimia sing dilaporake dhewe.

Kabeh iki ora ndadekake DCFDA tanpa guna. Iki ndadekake DCFDA minangka uji skrining, dudu identifikasi. Mundhake fluoresensi DCF ateges oksidasi probe sing gumantung marang oksidan mundhak. Iki ora ateges peroksida mundhak, lan mesthi ora ateges ROS total mundhak, amarga ora ana siji probe sing bisa ngukur jumlah kasebut. Panaliten metilena biru sadurunge sing gumantung marang oksidasi DCF ing konsentrasi luwih saka siji mikromolar nglaporake efek prooksidan, dene sistem liyane ing jaman sing padha nglaporake perlindungan saka pati sel sing dipicu peroksida. Loro pengamatan kasebut bisa bener kanggo zat pewarna sing padha ing konteks redoks sing beda, lan asil DCF dhewe ora bisa nemtokake oksidan endi sing ngasilake sinyal kasebut. Wigatine panaliten mitokondria otak sadurunge yaiku ngganti uji skrining iki nganggo pangukuran peroksida sing dikalibrasi lan langsung nemokake bebane: zat pewarna kanthi konsentrasi satus nanomolar wae nambah pelepasan peroksida nganti kaping pirang-pirang ing saben substrat lan kahanan respirasi sing diuji.

DCFDA nduweni siji jebakan maneh sing khusus gegayutan karo metilena biru. Zat pewarna iki nduweni warna pekat lan aktif sacara redoks, mula bisa nglunturake fluoresensi, nyuda emisi, utawa ngoksidasi sistem kimia probe tanpa gumantung marang ROS seluler. Kontrol tanpa sel sing ngemot zat pewarna lan probe ora mung tambahan opsional. Eksperimen iki sing nuduhake apa zat pewarna sesambungan karo probe.

Penangkapan spin lan panyerapan oksigen: identitas lan fluks

Nalika probe fluoresen nglaporake yen ana zat sing bisa dioksidasi, resonansi spin elektron nganggo penangkap spin menehi informasi sing luwih cedhak karo identitas zat kasebut. Panaliten klasik fotokimia metilena biru nggunakake ESR kanggo ndeteksi radikal askorbat saka zat pewarna, askorbat lan cahya, banjur nuduhake pambentukan peroksida ing eksperimen panyerapan oksigen lan pambentukan radikal hidroksil sing dikatalisis wesi ing pangukuran penangkapan spin. Saben teknik mangsuli pitakon sing ora bisa dijawab teknik liyane: ESR menehi identitas radikal, panyerapan oksigen menehi fluks reaksi tanpa gumantung marang probe fluoresen apa wae, lan kombinasi kasebut nuduhake yen jalur oksigen singlet lan jalur radikal padha-padha lumaku ing sistem sing disinari sing padha.

Asil taun 1984 kasebut isih pantes diwaca minangka peringatan. Nalika ana panyinaran lan agen pereduksi, zat pewarna iki ngasilake peroksida, lan nalika ana wesi, sistem kasebut ngasilake radikal hidroksil, spesies sing paling reaktif ing kelompok kasebut. Para panulis nggandhengake iki karo askorbat ing mripat lan mangu-mangu marang panggunaan kanggo mripat tanpa pertimbangan sing cukup. Pamaca saiki kudu nggatekake kahanane: cahya ditambah reduktan ditambah wesi. Yen salah siji diilangi, jalur kasebut dadi luwih ringkih utawa ilang.

Elektroda oksigen migunani kanthi cara sing beda. Elektroda jinis Clark ngukur konsumsi oksigen neto, sing negesake yen reaksi kimia redoks sing didorong zat pewarna ngonsumsi oksigen molekuler lan menehi data kinetika sing ora bisa dipalsokake dening artefak fluoresensi. Elektroda iki ora ngenali produke. Peroksida, superoksida, banyu, lan proses peluruhan oksigen singlet kabeh ngonsumsi oksigen. Fluks tanpa identitas padha ora jangkepe karo identitas tanpa fluks, mula makalah sing kuwat masangake elektroda karo uji peroksida sing dikalibrasi utawa penangkap.

Apa sebabe asil antioksidan sulaya

Yen telung jinis asil pangukuran iki dibandhingake, kontradiksi sing katon ing literatur metilena biru bisa diterangake minangka bedane metode ditambah telung kasunyatan biologis.

Kapisan, zat pewarna iki minangka pamindhah elektron lan uga sumber peroksida. Kanthi ngalihake elektron saka papan respirasi sing kudune ndadekake oksigen dadi superoksida, zat iki bisa nyuda siji ROS, dene wujud sing direduksi langsung ngreduksi oksigen dadi peroksida, saengga nambah ROS liyane. Mula, laboratorium sing ngadhepi reaksi kimia redoks mitokondria lan perane minangka jalur pintas kudu ngarepake wangsulan sing gumantung marang probe: asil pangukuran sing peka marang superoksida mudhun, dene asil pangukuran peroksida mundhak ing kuvet sing padha.

Kapindho, peroksida ing dosis cilik minangka sinyal, ora mung panyebab karusakan. Panaliten mitokondria otak mencit sing nerusake panaliten sadurunge nemokake pambentukan peroksida saka zat pewarna kanthi konsentrasi mung seket nanomolar tanpa lesi DNA mitokondria ing tingkat terapeutik, kanthi perlindungan saka lesi sing dipicu rotenon sawise perlakuan awal. Mung ing konsentrasi satus mikromolar, adoh ing ndhuwur rentang terapeutik, zat pewarna iki ngrusak fragmen DNA tartamtu, lan cahya abang ditambah zat pewarna rong puluh mikromolar ngasilake oksigen singlet sing ngrusak kabeh fragmen sing diuji. Mekanisme sing diajokake yaiku hormesis: produksi peroksida sing entheng micu pertahanan antioksidan sing gegayutan karo Nrf2 lan biogenesis mitokondria, mula asil pangukuran prooksidan ing wektu cekak ndhisiki asil antioksidan ing wektu luwih dawa. Uji sing diwaca sawise sakjam lan uji sing diwaca sawise sedina bisa menehi asil sing beda amarga kahanan biologis owah ing antarane wektu kasebut.

Katelu, cahya nemtokake molekul apa sing ana. Panyinaran nyebabake demetilasi zat pewarna dadi Azure B lan produk sing gegayutan, lan lampu mikroskop ing ndhuwur cawan wis cukup kanggo ngaktifake fotosensitisasine. Eksperimen ing peteng lan eksperimen kanthi panyinaran iku eksperimen sing beda, lan bagean kontrol panyinaran lan penanganan zat pewarna ing saben protokol kudu nganggep loro kasebut kaya mangkono.

Kontrol minimal, lan cara maca saben pratelan

Pambandhing ing ngisor iki minangka bahan rujukan asli kanggo artikel iki. Sadurunge nampa asil ROS metilena biru apa wae, priksa baris endi sing ditindakake para panulis lan endi sing dilewati.

Saka kene ana paugeran praktis kanggo maca asil. Amplex nganggo peroksidase, dikalibrasi, lan dipriksa nganggo katalase, minangka bukti babagan peroksida. DCFDA minangka bukti babagan oksidasi probe sing ora spesifik, lan mung kuwi. Penangkapan spin nganggo kontrol agen penangkap radikal minangka bukti babagan identitas radikal. Panyerapan oksigen minangka bukti babagan fluks. Ukara sing nyatakake luwih saka sing bisa didhukung ujine, sanajan ditulis kanthi yakin banget, iku ukara babagan probe, dudu babagan zat pewarna. Rembugan sing gegayutan babagan katergantungan marang dosis lan rentang hormesis, aliran elektron mitokondria, gangguan uji ing sampel sing diwenehi pewarna, lan artefak panyinaran mikroskop njlentrehake saben bab kasebut luwih lanjut, lan saben bab tetep sah sawise rujukan placeholder diganti.