New methylene blue lan pewarnaan retikulosit: zat warna kapisah lan metode sel urip

Sawijining siswa nyiapake pangitungan retikulosit, pesen methylene blue, nyampurake karo getih, lan meh ora weruh apa-apa. Kanca sakelase nggunakake botol kanthi label new methylene blue lan entuk filamen biru sing cetha ing njero sapérangan sel getih abang. Siswa kapisan ngira yen isi botol kapindho luwih anyar utawa luwih pekat. Dudu loro-lorone. Botol kasebut ngandhut molekul sing beda.

Iki kaluputan konsep sing njalari akeh kebingungan ing babagan iki. Jenenge menehi kesan yen new methylene blue iku methylene blue saka kumpulan produksi sing wis ditingkatake. Nanging, kimiane nuduhake bab liya. New methylene blue N yaiku zat warna fenotiazina sing kapisah, kanthi nomer Colour Index dhewe, pola substitusi dhewe, lan peran baku dhewe ing hematologi. Sawise bedane iki cetha, bagean metode liyane (kenapa sel kudu isih urip nalika diwarnani, apa sing dianggep retikulosit, ing ngendi badan Heinz kalebu, lan kapan brilliant cresyl blue digunakake) dadi gampang dimangerteni.

Wangsulan cekak

New methylene blue N, reagen hematologi, umume diidentifikasi minangka Basic Blue 24 ing cathetan PubChem kanggo new methylene blue, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, kanthi rumus C18H22ClN3S. Methylene blue biasa yaiku methylthioninium chloride, Basic Blue 9, ing cathetan PubChem, C.I. 52015, CAS 61-73-4, kanthi rumus C16H18ClN3S. Saka struktur, new methylene blue nduweni rong gugus metil ing cincin lan rantai sisih etilamino, dene methylene blue nduweni gugus dimetilamino. Bedane iki ngowahi sipat pewarnaane. Buku hematologi nggambarake methylene blue biasa minangka pewarna retikulosit sing relatif kurang apik, dene new methylene blue menehi warna luwih pekat lan luwih seragam. Perbandingan iki diringkes ing topik ScienceDirect babagan new methylene blue.

Ya, new methylene blue iku pewarna supravital. Pewarnaan supravital tegese menehi warna marang sel urip sawise dijupuk saka awak lan sadurunge fiksasi, kaya definisi ing tinjauan NCBI babagan prinsip pewarnaan supravital. New methylene blue lan brilliant cresyl blue kalebu kategori iki, lan standar retikulosit CLSI kanthi cetha nyakup new methylene blue minangka zat warna supravital. Siswa kadhang nggolongake metode iki bareng pewarnaan Romanowsky ing apusan sing wis difiksasi. Cara mangerteni kaya mangkono ora cocog ing kene. Yen difiksasi dhisik, metode iki ora bisa mlaku.

Kanggo pamaca sing nlusuri jeneng zat warna sing meh padha, methyl blue dibandhingake karo methylene blue ngrembug kebingungan liya sing luwih gedhe antarane zat warna triarilmetana anionik lan kulawarga fenotiazina kationik. Ringkesan pewarnaan laboratorium njlentrehake panggonane metode supravital ing antarane metode apusan sing difiksasi, lan pandhuan morfologi sel getih nuduhake panggonane pambiji retikulosit ing petungan diferensial sing luwih jembar.

Siji bab sing kudu digatekake ing katalog: ana wujud uyah rangkep seng klorida saka new methylene blue sing kapisah, kanthi CAS 6586-05-6. Mula, bagean metode kudu nyebutake wujud uyah lan pemasoke, ora mung jeneng umume.

Apa sing sejatine ditindakake pewarnaan supravital

Retikulosit yaiku sel getih abang enom sing wis ilang inti sele nanging isih nduweni sisa RNA ribosomal. Ing preparat teles tanpa pewarnaan, RNA kasebut ora katon. Zat warna supravital mlebu ing sel urip lan ngendhapake utawa nggumpalake RNA kasebut dadi granula lan filamen biru, yaiku bahan retikulofilamentosa sing katon kanthi imersi lenga. Mula, jaringan iki minangka asil pewarnaan, dudu kerangka sing wis ana lan mung ngenteni diwenehi warna. Iki sebabe variabel protokol (konsentrasi zat warna, larutan penyangga, rasio getih karo zat warna, suhu, wektu) padha pentinge karo jeneng zat warna.

Akibat praktise yaiku urutan langkah sing kudu dituruti kanthi ketat: campur getih sing wis diwenehi antikoagulan karo zat warna dhisik, inkubasi, banjur gawe apusan lan priksa tanpa fiksasi lan tanpa pewarna tandhing. Fiksasi sadurunge pewarnaan, utawa pewarna tandhing sing nutupi filamen samar, ngrusak informasi sing dadi dhasar pangitungan.

Protokol retikulosit praktis nganggo new methylene blue

Ora ana siji formulasi sing ditrapake sacara universal, mula laporake formulasi sing digunakake. Telung varian sing wis didokumentasikake nuduhake ragame.

Prosedur klasik jinis Brecher nggunakake kira-kira 0.5 persen new methylene blue kanthi kalium oksalat, dicampur ing volume sing padha karo getih EDTA sing wis dicampur kanthi rata, banjur diinkubasi watara 10 nganti 15 menit ing suhu kamar. Sawise dicampur maneh alon-alon, digawe apusan tipis awujud baji, digaringake ing hawa, lan dipriksa tanpa fiksasi nganggo lensa objektif imersi lenga 100x. Prosedur NCBI kanggo pangitungan retikulosit njlentrehake alur kerja iki lan kerangka pangitungan sing digunakake.

Varian Dacie lan Lewis nggunakake 1.0 persen new methylene blue ing larutan salin sitrat, dicampur karo 2 nganti 4 volume getih lan diinkubasi ing 37 C suwene 15 nganti 20 menit sadurunge digawe apusan. Implementasi harmonisasi paling anyar kanggo prosedur CLSI H44 nggunakake larutan sing luwih encer, yaiku 0.1 persen ing larutan salin kanthi penyangga fosfat ing pH 7.4, kanthi inkubasi ing 20 C suwene 10 menit lan tanpa fiksasi, kaya sing dilaporake ing panaliten harmonisasi NMB taun 2026.

Aturan pangitungan padha kanggo kabeh varian. Etung sawijining sel minangka retikulosit yen ngandhut paling ora rong granula utawa segmen filamen sing kapisah lan katon biru amarga pewarnaan, supaya endhapan pewarna tunggal ora kalebu. Ing pemeriksaan rutin, etung paling ora 1,000 sel getih abang lan laporake retikulosit minangka persentase. Ing persentase sing cilik, statistik mbutuhake luwih akeh sel. Tinjauan metodologi CLSI H44 nyathet yen ing retikulosit watara 1 persen, dibutuhake kira-kira 4,400 sel supaya variasi pangitungan mudhun dadi 5 persen, ing tinjauan CLSI H44 ing De Gruyter. Cakram okuler Miller nggampangake pangitungan kanthi cacah gedhe. Saring utawa gawe larutan zat warna sing anyar, amarga endhapan bisa katon kaya inklusi granular.

Badan Heinz ing preparat sing padha

Apusan supravital sing padha uga bisa nuduhake badan Heinz, yaiku gumpalan hemoglobin sing wis kaoksidasi lan kadenaturasi, dudu sisa RNA. Ing preparat new methylene blue, badan iki katon bunder, kerep mung siji lan cedhak membran, kanthi warna biru sing luwih pucet tinimbang bahan retikulofilamentosa. Badan iki ora lestari kanthi apik sajrone fiksasi lan pewarnaan tandhing, mula priksa apusan sing durung difiksasi. Protokol anyar sing nggunakake 20 mikroliter getih EDTA karo 20 mikroliter new methylene blue 1 persen lan inkubasi 15 menit ngetung sel positif badan Heinz ing antarane 250 eritrosit, ing panaliten PMC sing nglaporake prosedur kasebut.

Rong prabédan bisa nyegah salah maca. Kapisan, methyl violet lan crystal violet menehi warna badan Heinz luwih kuwat tinimbang new methylene blue, kaya sing dicathet ing topik ScienceDirect babagan badan Heinz. New methylene blue minangka pilihan sing praktis nalika retikulosit lan badan Heinz dibiji bebarengan, dudu zat warna khusus badan Heinz sing paling kuwat. Kapindho, inklusi HbH ing sipat talasemia alfa ngasilake akeh titik alus ing saindhenging sel sawise pewarnaan supravital, dene badan Heinz klasik luwih sithik, luwih gedhe, lan kerep gegayutan karo membran. Endhapan pewarna minangka barang katelu sing katon padha: dununge ing njaba bidang fokus sel lan beda-beda antarane lapangan pandang.

Brilliant cresyl blue dibandhingake karo new methylene blue

Loro zat warna iki minangka pewarna supravital kanggo retikulosit, nanging pambakuan luwih milih salah sijine. Metode retikulosit CLSI H44-A2, sing dikembangake bebarengan karo International Council for Standardization in Haematology lan kacathet ing kaca standar CLSI H44, netepake pewarnaan getih EDTA nganggo new methylene blue minangka metode pembanding manual. Piwulang hematologi klasik uga sarujuk babagan tampilane: new methylene blue menehi warna filamen luwih pekat lan luwih seragam, dene brilliant cresyl blue luwih beda-beda antarane kumpulan produksi lan sampel.

Status kasebut perlu diwenehi katrangan watesan. Pandhuan ICSH kanggo evaluasi alat analisis nampa mikroskopi manual nganggo new methylene blue minangka pendekatan pembanding rujukan, nanging nyebutake yen metode iki subyektif lan relatif kurang presisi, kanthi prosedur rujukan sitometri alir luwih dipilih yen kasedhiya. Perbandingan 100 spesimen ing taun 2022 nemokake bias sing luwih cilik tumrap alat analisise nalika nggunakake brilliant cresyl blue tinimbang new methylene blue, kaya sing dilaporake ing perbandingan metode pewarnaan ing PMC. Ringkesan sing bisa dipertanggungjawabake kanggo siswa yaiku: gunakake new methylene blue minangka pembanding manual sing wis dibakukake, verifikasi metode brilliant cresyl blue lokal marang metode kasebut utawa marang metode otomatis, lan elinga yen asil mikroskopi manual bakal nduweni variasi sing luwih amba ing loro-lorone. Literatur pambakuan lawas uga nyaranake Azure B sing wis dimurnekake minangka alternatif sing luwih murni sacara kimia amarga kumpulan produksi zat warna komersial beda-beda, ing panaliten Marshall babagan Azure B. Iki njlentrehake kenapa tingkat kemurnian reagen isih dirembug ing diskusi metode.

Nyingkiri kaluputan sing lumrah

Patang kaluputan njalari akeh preparat sing gagal. Pesen methylene blue biasa tinimbang new methylene blue N ngasilake pewarnaan sing ringkih amarga kimiane, dudu teknike. Fiksasi utawa pewarnaan tandhing sadurunge diwaca ngilangi sinyal supravital. Ngetung endhapan pewarna minangka granula nggawe asil luwih dhuwur tinimbang sing sejatine; aturan rong granula lan zat warna sing disaring bisa nyegah iki. Ngetung sel sing sithik banget nalika persentase retikulosit cilik ngasilake angka sing katon presisi nanging nduweni wates kapercayan sing amba. Saben kaluputan nduweni ciri sing padha: wong sing nindakake mikroskopi nyalahake mikroskop, sanajan asile wis ditemtokake ing langkah panggunaan reagen.