Biru metilena lan nitrogen monoksida: NOS, cGMP, lan panyaluran sinyal vaskular

Pitakon iki katon prasaja: apa biru metilena nyandhet nitrogen monoksida? Ing laboratorium, wangsulane kabagi dadi patang pitakon kapisah, lan saben pitakon duwe uji eksperimen sing beda. Nyampurake pitakon-pitakon mau dadi sebab utama tulisan bab biru metilena lan nitrogen monoksida katon yakin nanging ora cetha.

Bayangna sinyal nitrogen monoksida minangka rantai kanthi patang mata rantai. Sawijining gen ditranskripsi kanggo ngasilake sintase nitrogen monoksida. Enzim iki ngowahi arginin dadi nitrogen monoksida. Gas kasebut nyebar menyang sasarane sadurunge bereaksi karo zat liyane. Guanilat siklase larut ndeteksi gas kasebut lan ngasilake GMP siklik. Efek biru metilena ing saben mata rantai wis dilapurake ing publikasi, nanging buktine asale saka preparat, konsentrasi, lan isoform sing beda-beda. Asil ing siji mata rantai ora mbuktekake tumindak ing mata rantai liyane.

Rantai kanonik, diterangake kanthi prasaja

Ing tembok pembuluh getih, urutan baku lumaku kaya mangkene. Sawijining rangsangan mengaruhi sel endotel. Sintase nitrogen monoksida endotel, sing diarani eNOS utawa NOS3, ngasilake nitrogen monoksida sithik sajrone wektu cekak. Gas kasebut nyebar menyang sel otot polos ing sacedhake, kaiket ing heme wesi tereduksi saka guanilat siklase larut, lan nyepetake pangowahan GTP dadi GMP siklik. GMP siklik ngaktifake protein kinase G, pangaturan kalsium owah, lan otot dadi kendho.

Ana rantai kapindho sing kudu tetep dibedakake. Nalika ana infeksi utawa paparan sitokin, sel nindakake transkripsi kanggo ngasilake enzim liyane, yaiku sintase nitrogen monoksida sing bisa diinduksi utawa iNOS, uga diarani NOS2. Enzim iki ngasilake fluks nitrogen monoksida sing luwih gedhe lan luwih suwe tinimbang eNOS. Isoform katelu, NOS neuronal utawa nNOS, ana ing konteks liyane maneh. Nalika sawijining makalah nyebut sintase nitrogen monoksida tanpa nemtokake isoforme, mandhega lan priksa endi sing diukur. Ringkesan bab carane biru metilena mindhah elektron uga negesake bab sing padha kanggo sasaran redoks umume: perantara kasebut ora bisa tumindak dhewe, lan pasangan ing saben pucuk nemtokake asile.

GMP siklik sing diukur uga minangka ukuran gabungan, dudu uji enzim langsung. Kadare nggambarake sintesis dening siklase dikurangi panguraian dening fosfodiesterase, utamane PDE5 ing otot polos vaskular. Mula, mudhune GMP siklik ateges sinyal sing tekan detektor luwih sithik. Asil iki dhewe ora nemtokake mata rantai endi sing gagal.

Mata rantai 1: enzim iNOS sing diasilake luwih sithik

Ing makrofag mencit sing dirangsang nganggo lipopolisakarida bakteri, interferon gamma, utawa loro-lorone, biru metilena nyegah mundhake protein iNOS sing diarepake lan banget nyandhet RNA utusan iNOS ing eksperimen transkripsi makrofag. Bab sing menehi katrangan penting yaiku apa sing ora owah. Degradasi inhibitor I kappa B alpha, fosforilasi NF kappa B lan STAT1, lan pamindhahan faktor-faktor kasebut menyang inti sel umume tetep lumaku. Sing mudhun yaiku pangikete marang DNA, dikonfirmasi nganggo imunopresipitasi kromatin sing nuduhake suda anggone faktor-faktor kasebut manggoni promotor iNOS.

Iki minangka efek pangaturan gen ing tahap sadurunge jumlah enzim ditemtokake, dudu pamblokiran akut marang enzim sing wis ana. Efek iki ana ing panyaluran sinyal inflamasi, nalika faktor transkripsi kudu kaiket ing promotor sadurunge protein katon. Asil iki ora menehi katrangan langsung bab eNOS konstitutif ing pembuluh sing lagi ngaso, lan kudu diterangake kanthi watesan kasebut.

Mata rantai 2: enzim NOS sing wis ana makarya luwih alon

Sawijining panaliten ing tikus nguji tataran sing beda. Tikus lanang sing sadar diwenehi lipopolisakarida kanthi intravena, banjur telung jam sabanjure diwenehi larutan salin utawa biru metilena kanthi 3 mg saben kg kanthi intravena. Aktivitas sintase nitrogen monoksida ing hipotalamus basal medial diukur liwat pangowahan arginin berlabel dadi sitrulin ing panaliten aktivitas NOS hipotalamus. Stres ditambah salin wae nginduksi sawetara aktivitas sing ora gumantung marang kalsium, lan lipopolisakarida ngunggahake aktivitas kasebut nganti kira-kira sepuluh kaping tingkat kontrol. Biru metilena ngilangi loro komponen sing diinduksi kasebut. Aktivitas konstitutif sing gumantung marang kalsium ora owah ing jaringan kasebut ing dosis lan titik wektu mau.

Wacanen asil kasebut persis miturut sing ditulis: aktivitas jinis iNOS sing diukur kasandhet ing kahanan kasebut. Iki dudu pangukuran ekspresi gen, lan dudu bukti selektivitas tetep marang iNOS tinimbang eNOS utawa nNOS. Panaliten nganggo enzim sing dimurnekake luwih negesake perlune ngati-ati. Ing uji langsung sintase nitrogen monoksida sing dimurnekake, biru metilena mblokir pembentukan sitrulin kanthi tuntas ing 30 mikromolar, kanthi konsentrasi kanggo nyandhet separo cedhak 5.3 mikromolar tanpa superoksida dismutase lan 9.2 mikromolar kanthi enzim kasebut, kaya sing dilapurake ing perbandhingan NOS lan guanilat siklase sing dimurnekake. Panaliten kapisah nganggo nNOS sing dimurnekake nuduhake keterlibatan oksidasi heme sing kaiket ing enzim. Piwulang praktise yaiku panyandhetan NOS kanthi langsung pancen ana ing sistem terisolasi, nanging asil saka hipotalamus ora bisa digedhekake dadi pratelan umum yen biru metilena ora mengaruhi kabeh NOS konstitutif ing ngendi wae.

Mata rantai 3: nitrogen monoksida ilang sadurunge tekan sasaran

Bukti paling cetha yen perkara saliyane pamblokiran enzim bisa nerangake mudhune GMP siklik asale saka sel otot polos arteri pulmonalis terwelu sing dikultur. Rancangan eksperimen iki ngliwati NOS endogen kanthi nambahake donor nitrogen monoksida langsung, banjur nguji apa biru metilena isih nyandhet respons GMP siklik ing panaliten superoksida ing otot polos vaskular.

Telung donor diuji saka 1 nganti 100 mikromolar: S nitroso L sistein, natrium nitroprusida, lan analog stabil sing wis ngalami deaminasi, diarani MPANO. Kabeh ngunggahake GMP siklik watara 1.5 kaping nganti 12 kaping. Biru metilena ing 10 mikromolar nyandhet loro donor pisanan kanthi 51 nganti 100 persen lan ora ngowahi respons MPANO. Yen biru metilena mung mblokir situs katalitik siklase, selektivitas marang donor kasebut bakal angel diterangake, amarga telu-telune tumuju marang enzim sing padha ing tahap sabanjure.

Banjur telung kontrol mesthekake yen mekanisme kasebut gegandhengan karo superoksida. Kapisan, ngasilake superoksida ekstraseluler nganggo xantin ditambah xantin oksidase ngasilake pola sing padha: CYSNO lan nitroprusida diblokir, dene MPANO ora kena pengaruh. Kapindho, biru metilena nyebabake produksi superoksida saka sel otot polos sing gumantung marang dosis lan wektu, diukur liwat reduksi sitokrom c. Katelu, superoksida dismutase nyegah panyandhetan kasebut kanthi tuntas, dene katalase ora, sing nuduhake superoksida tinimbang hidrogen peroksida minangka spesies sing langsung nyebabake efek kasebut ing preparat mau.

Versi kokultur saka eksperimen iki perlu diterangake amarga nuduhake panggonane efek kasebut. Sel endotel ing kaca panutup dikokultur sedhela karo sel otot polos, saengga faktor endotel sing dibebasake kanthi basal ngunggahake GMP siklik otot polos telu nganti wolung kaping. Perlakuan awal nganggo biru metilena ing salah siji kompartemen ngurangi sinyal kasebut, lan superoksida dismutase mbalekake sapérangan efek saka perlakuan awal ing endotel. Tegese, biru metilena ora kudu tumindak ing njero sel otot polos sing dadi detektor. Zat iki bisa ngurangi sinyal kanthi nyingkirake zat utusan nalika isih ing dalan. Pandhuan maca riset biru metilena nganggep iki minangka paugeran umum: sebutna kompartemen sing nampa intervensi sadurunge nyebut sasaran molekuler.

Nyebut iki minangka panyandhetan NOS iku kliru. Donor-donor kasebut ora mbutuhake tahap sintase supaya bisa makarya, nanging sinyale tetep mudhun.

Mata rantai 4: detektore dhewe menehi respons luwih sithik

Efek langsung marang guanilat siklase larut pancen ana, nanging konsentrasine penting. Ing perbandhingan enzim sing dimurnekake sing dirujuk ing ndhuwur, siklase sing dirangsang nitrogen monoksida mbutuhake kira-kira 60 mikromolar biru metilena kanggo panyandhetan separo, dibandhingake karo panyandhetan separo NOS ing cedhak 5 nganti 9 mikromolar, lan malah 1 milimolar mung ngasilake pamblokiran maksimal sapérangan. Bedane kira-kira enem nganti sewelas kaping. Mula, eksperimen sel ing konsentrasi mikromolar sing endhek lan ngurangi GMP siklik ora bisa diarani panyandhetan siklase selektif mung adhedhasar angka GMP siklik kasebut.

Panaliten redoks sing luwih anyar nambahake pangeling kapindho: biru metilena mateni aktivitas siklase sing diaktifake nitrogen monoksida kanthi mekanisme sing beda karo oksidasi prasaja wesi heme dening hawa. Dadi, detektor bisa keganggu, nanging kimiane durung dipesthekake, lan bedane konsentrasi ateges efek superoksida lan NOS kudu disingkirake luwih dhisik minangka panjelasan ing paparan mikromolar sing endhek. Ing kene uga kontrol fosfodiesterase perlu ditrapake. Yen panguraian ora diukur utawa diblokir, suda akumulasi GMP siklik bisa cocog karo sintesis sing luwih sithik, degradasi sing luwih cepet, utawa loro-lorone.

Apa sebabe iki ora bisa diringkes dadi siji pratelan bab tekanan getih

Saben mata rantai dibuktekake ing sistem sing beda. Transkripsi makrofag ora padha karo aktivitas enzim hipotalamus. Aktivitas hipotalamus sawise lipopolisakarida ora padha karo tonus endotel nalika ngaso. Faktor endotel sing dibebasake kanthi basal ing kokultur ora padha karo vasodilatasi sing dirangsang agonis. Sel arteri pulmonalis sing dikultur kanthi biru metilena 10 mikromolar ora padha karo sirkulasi manungsa. Nggabungake kabeh dadi pratelan kaya biru metilena ngunggahake tekanan getih kanthi mblokir nitrogen monoksida malah mbuwang prabédan sing pancen arep dijaga dening kontrol-kontrol kasebut.

Telung pamriksa njaga katrangan iki tetep jujur. Kapisan, sebutna isoforme: eNOS kanggo tonus vaskular nalika ngaso, iNOS kanggo fluks inflamasi sing diinduksi, nNOS kanggo konteks neuronal lan sawetara konteks enzim sing dimurnekake. Kapindho, sebutna carane sinyal nitrogen monoksida diwenehake: sintesis endogen, pelepasan basal saka endotel, utawa donor tartamtu kayata CYSNO, nitroprusida, utawa MPANO, amarga donor sing stabil tahan marang biru metilena, dene donor sing labil ora. Katelu, sebutna konsentrasi lan pamulihane: pamulihan dening superoksida dismutase nuduhake keterlibatan superoksida, kegagalan katalase dadi bukti sing ora ndhukung hidrogen peroksida ing preparat kasebut, peniruan dening xantin oksidase nuduhake yen mekanisme iku cukup kanggo ngasilake efek kasebut, lan uji enzim sing dimurnekake misahake efek katalisis langsung saka ilange sinyal nalika isih ing dalan.

Ringkesane mangkene. Biru metilena luwih trep dianggep minangka zat sing ngganggu panyaluran sinyal nitrogen monoksida menyang GMP siklik ing pirang-pirang situs, tinimbang minangka pamblokir siklase selektif. Gumantung marang preparat lan konsentrasi, zat iki bisa ngurangi pangiketan faktor transkripsi iNOS, nyandhet enzim NOS kanthi langsung, ngurangi kasedhiyan nitrogen monoksida liwat pambentukan superoksida, lan ngganggu siklase sing diaktifake nitrogen monoksida. Peran panyaluran sinyal GMP siklik ing panaliten vaskular lan perbandhingan donor nitrogen monoksida sing digunakake ing uji sel saben-saben ngrembug salah siji cabang kasebut kanthi luwih rinci, lan metode kanggo misahake efek redoks saka efek enzim nerangake apa sebabe superoksida dismutase ditambah katalase ditambah kontrol donor stabil kerep banget katon ing literatur iki.

Nilai GMP siklik sing endhek sawise biru metilena nuduhake rantai sing pedhot. Mung kontrol sing bisa nuduhake mata rantai endi sing pedhot.