Þýðir meiri súrefnisnotkun meira ATP? Lærdómur af rannsóknum á metýlenbláu

Einangraður hvatberi er í mæliklefa með eldsneyti en engu ADP. Hann notar súrefni hægt. Þegar ADP er bætt við eykst súrefnisnotkun margfalt. Þegar ADP klárast minnkar súrefnisnotkun aftur. Eldsneytið breyttist aldrei. Aðeins þörfin fyrir ATP breyttist.

Þessi litla atburðarás lýsir öllum þeim greinarmun sem greinin fjallar um. Súrefnisnotkun mælir hversu hratt rafeindir flæða um öndunarkeðjuna til súrefnis. ATP-framleiðsla mælir hversu mikið af orkunni í þessu flæði er bundið í nýtanlegu formi. Ferlin tvö eiga sameiginlegt milliskref, róteindastigulinn yfir innri himnu hvatberans. Allt sem breytir því hversu þétt þessi stigull er tengdur ATP-myndun getur breytt þessum tveimur mælistærðum í ólíkar áttir. Metýlenblátt er gagnlegt til að skýra þetta, því hvort tveggja hefur sést: aukin súrefnisnotkun samhliða auknu ATP í sumum sýnum og aukin súrefnisnotkun á meðan ATP stendur í stað eða minnkar í öðrum.

Lesendur sem vilja fyrst fá heildarmynd af rafeindaflutningnum geta byrjað á því hvernig metýlenblátt flytur rafeindir um öndunarkeðjuna. Þeir sem vilja kynna sér hugtökin úr fyrstu súrefnistilraununum geta lesið um það sem fyrstu öndunarmælingarnar sýndu í raun.

Öndun, ATP og stigullinn þar á milli

Rafeindir frá NADH og FADH2 koma inn í keðjuna við flóka I og II, fara um flóka III til cýtókróms c og síðan um flóka IV til súrefnis. Orkan sem losnar við flóka I, III og IV dælir róteindum úr hvatberafylkinu í bilið milli himnanna. Þessi aðskilnaður hleðslu og sýrustigs myndar róteindadrifkraftinn. Rafræni hluti hans, himnuspennan, er yfirleitt ráðandi.

ATP-syntasi hleypir róteindum aftur inn í fylkið og notar orkuna sem losnar til að sameina ADP og fosfat í ATP. Röðin er því:

súrefnisnotkun, síðan róteindadæling, síðan stigull, síðan ATP-myndun.

Hængurinn er sá að róteindir geta skilað sér til baka eftir öðrum leiðum. Allt bakflæði sem fer fram hjá ATP-syntasa er róteindaleki. Lekinn neyðir keðjuna til að dæla sömu róteindunum aftur til að halda himnuspennunni stöðugri. Það notar meira súrefni án þess að mynda meira ATP. Nægilega mikill leki leiðir til aftengingar: súrefnisnotkun eykst á meðan ATP stendur í stað eða minnkar og orkan sem nýtist ekki tapast sem varmi.

Ástand 3, ástand 4 og öndunarstýringarhlutfallið

Hefðbundin hugtök um þetta eiga uppruna sinn í rannsóknum á einangruðum hvatberum. Ástand 3 er öndun þegar bæði hvarfefni og ADP eru til staðar: ATP-syntasi gengur á stigulinn, himnuspennan lækkar, keðjan hraðar sér til að byggja hana upp aftur og súrefnisnotkun er mikil vegna þess að ATP er að myndast. Ástand 4 er öndun eftir að ADP klárast: ATP-syntasi er óvirkur, stigullinn eykst, há himnuspenna vinnur gegn frekari dælingu og súrefnisnotkun minnkar niður í það sem þarf til að vega upp lekann.

Öndunarstýringarhlutfallið, ástand 3 deilt með ástandi 4, gefur því til kynna hversu þétt öndun og ATP-myndun eru tengd í sýninu. Hátt hlutfall þýðir að ADP hefur sterk áhrif á öndunina. Lækkandi hlutfall samhliða aukinni öndun í ástandi 4 þýðir að lekinn er að verða ráðandi. Þetta er sjónarhornið sem gerir niðurstöðurnar um metýlenblátt hér að neðan skiljanlegar.

Eina hugmynd er vert að hafa í huga. Há himnuspenna hægir á keðjunni. Þegar spennan minnkar eykst hraðinn. Keðjan bregst við því hversu erfið dælingin er orðin, ekki beint við því hvort ATP sé að myndast.

Þegar mælistærðirnar fylgjast að

Skýrasta dæmið um tengingu kemur frá einangruðum hvatberum úr heila naggrísa með hamlaða öndunarkeðjuflóka. Við metýlenblástyrk frá 100 nanomolar til 1 micromolar jókst súrefnisnotkun í hvíld þegar glútamat ásamt malati, súksínat eða glýserófosfat var notað sem eldsneyti, en ADP-örvuð öndun var óbreytt. Í hvatberum þar sem flóki I eða flóki III hafði verið hamlaður með eitri jók litarefnið ATP-framleiðslu lítillega, endurheimti himnuspennu og bætti kalsíumupptöku. Leiðin sem lögð er til er hjáleið: litarefnið tekur við rafeindum áður en þær ná að hindruninni og afhendir þær cýtókrómi c, fram hjá skemmda flókanum.

Annað dæmi þar sem mælistærðirnar fylgjast að byggist á allt annarri uppsprettu ATP. Í einangruðum heilahvatberum með hamlaðan ATP-syntasa örvaði metýlenblátt enn öndun með öllum hvarfefnum sem voru prófuð. ATP-myndun jókst þó aðeins með alfa-ketóglútarati og glútamati, hvarfefnunum tveimur sem mynda súksínýl-CoA. Þegar ólígómýsín hamlaði ATP-syntasa kom viðbótar-ATP frá fosfórun á hvarfefnisstigi fyrir tilstilli súksínýl-CoA-lígasa í sítrónusýruhringnum, ekki frá oxunarfosfórun. Litarefnið endurheimti einnig himnuspennu þegar bæði flóki I og ATP-syntasi voru hamlaðir. Hér fylgdust súrefnisnotkun og ATP að, en aðeins þegar hvarfefnið leyfði seinni ATP-myndunarleiðina. Með súksínati eða malati jókst öndun án viðbótar-ATP. Sama litarefni, sami mæliklefi, annað eldsneyti, önnur niðurstaða.

Þegar mælistærðirnar fara hvor í sína áttina

Tilvikin þar sem mælistærðirnar skilja að hafa einnig verið birt og eru jafn lærdómsrík. Í rannsókn frá 1997 á einangruðum hvatberum úr rottulifur hraðaði metýlenblátt öndun í ástandi 4 í hvatberum með þétta tengingu sem notuðu súksínat við öndun. Það lækkaði öndunarstýringarhlutfallið. Áhrifin sáust frá 0.5 micromolar og voru mikil við 5 micromolar, styrk sem er nálægt styrk í blóðvökva eftir 100 milligram stakskammt í bláæð. Við 5 micromolar bólgnuðu hvatberarnir einnig, en truflun á tengingunni kom fyrst fram við lægri styrk. Það bendir til þess að lekinn hafi komið á undan skemmdum á byggingu þeirra fremur en að stafa af þeim. Í aftengdum hvatberum örvaði litarefnið öndun á styrkháðan hátt þar sem áhrifin náðu mettun. Súrefnisnotkun jókst í báðum sýnunum. ATP-myndun á hverja einingu súrefnis sem var notuð jókst ekki. Þetta er dæmigerð aftenging ásamt rafeindaflutningi, í sömu sameindinni.

Skýrasti munurinn kemur frá sjónhimnu. Í músum með AIF-skort og ljósnemafrumum sem voru meðhöndlaðar með rótenóni varðveitti metýlenblátt þykkt sjónhimnunnar, ljósnemamerki og byggingu hvatbera. Það lækkaði einnig hlutfall NADH og NAD og dró úr virkni streituferla, þar á meðal viðbragða við óbrotnum próteinum og sjálfsáts hvatbera. Þetta gerðist án þess að leiðrétta ATP-skortinn. Vernd án endurheimtrar orku þýðir að ávinningurinn byggðist á oxunar-afoxunarjafnvægi og heilleika hvatbera, ekki á auknu ATP. Sá sem legði að jöfnu lifun vefjarins og endurheimta orkuframleiðslu myndi mistúlka tilraunina algjörlega.

Rannsóknirnar á heilahvatberum bæta kostnaðarlið við sama bókhald. Sami lági styrkur og bætti líforkuvirkni jók einnig myndun vetnisperoxíðs við allar aðstæður sem voru prófaðar og hægði á brotthvarfi þess. Það var mælt með kvörðuðu Amplex-prófi fremur en ósértæku litarefni. Meira ATP og meira oxunarefni komu saman.

Hagnýtur gátlisti við lestur

Fjórar spurningar greina niðurstöðu með tengingu frá niðurstöðu með aftengingu.

Í fyrsta lagi, hvaða mælistærð var raunverulega mæld? Súrefnisnotkun ein og sér getur ekki sagt til um ATP. ATP-myndun, himnuspenna og öndunarstýringarhlutfallið bæta hvert við upplýsingum sem súrefnisrafskautið getur ekki gefið. Leiðarvísirinn um lestur fullyrðinga í rannsóknum á metýlenbláu fjallar ítarlega um þessa nákvæmni í meðferð mælistærða.

Í öðru lagi, hvaða hvarfefni nærði hvatberana? Niðurstaðan um súksínýl-CoA sýnir að val á eldsneyti getur ráðið því hvort aukin öndun geti yfirhöfuð orðið að auknu ATP.

Í þriðja lagi, hvaða styrkur var notaður? Metýlenblátt í styrk frá nanomolar upp í lágan micromolar styrk í heilahvatberum gaf hóflegan ávinning í líforkuvirkni en jók myndun oxunarefna; hálft micromolar og meira í lifrarhvatberum veikti tenginguna; 5 micromolar olli einnig bólgun. Styrkurinn er hluti af verkunarhættinum, ekki aukaatriði.

Í fjórða lagi, í hvaða rannsóknarlíkani fékkst niðurstaðan? Einangraðir hvatberar sýna hvernig kerfið er tengt, en í heilum frumum og vefjum bætast við flutningur, afoxun yfir í litlausa formið og samkeppni um viðtöku rafeinda. Rannsóknir á skömmtun á rannsóknarstofu, þar á meðal á því hvernig styrkur og framkvæmd tilrauna móta áhrif metýlenblás, eru brúin milli talna úr mæliklefa og hvers kyns fullyrðingar um manneskju.

Súrefnisnotkun sýnir rafeindaflæði. ATP sýnir hversu mikil orka úr því flæði var bundin. Metýlenblátt getur breytt hvoru tveggja og tilraunirnar hér að ofan sýna allar fjórar samsetningarnar sem af því leiða: hvort tveggja eykst, öndun eykst en ATP aðeins þar sem hvarfefnið leyfir, öndun eykst á meðan tengingin veikist og vefur varðveitist á meðan ATP stendur í stað. Talan á súrefnisrafskautinu er upphaf túlkunarinnar, ekki endir hennar.