Gleypniróf og mólgleypnistuðull metýlenblás: viðmið með tilgreindum mæliaðstæðum

Róf metýlenblás virðist einfalt þar til reynt er að endurnýta tölugildi úr því. Ein rannsóknarstofa tilgreinir móldeyfingarstuðul nálægt 82,000. Önnur tilgreinir 67,000. Sú þriðja tilgreinir yfir 100,000. Öll þrjú gildin geta lýst mælingum viðkomandi rannsóknarstofu rétt, en ekkert þeirra er algildur fasti fyrir litarefnið.

Ruglingurinn stafar af því að tveimur ólíkum hugtökum er blandað saman. Gleypni er mæld í tiltekinni lausn í tilteknu mælikeri. Mólgleypnistuðull, oft táknaður með epsilon, er stiki í líkani af þeirri lausn. Þegar samloðunarástand metýlenblás breytist, breytist líkanið og þar með stikinn. Góð vinnuregla er að líta á hvern stuðul sem gildi með tilgreindum aðstæðum: bylgjulengd, leysir, pH eða stuðpúði, hitastig, styrkbil og ljósvegalengd fylgja tölunni.

Einliðubandið í þynntri vatnslausn

Í þynntri vatnslausn er ríkjandi band metýlenblá-katjónarinnar nálægt 664 til 665 nm. Algengt er að það sé tilgreint á bilinu 664 til 668 nm, eftir tækjum og kvörðunaraðferðum. Þetta band hentar til magngreiningar þegar lausnin er nógu þynnt til þess að stærstur hluti litarefnisins sé á einliðuformi.

Þrjú gildi úr fræðiritum sýna hvers vegna aðstæðurnar skipta meira máli en talan ein og sér. Vísindamenn sem rannsökuðu leir og héldu vatnssýnum undir um 7 micromolar í 1 cm mælikerum tilgreindu epsilon um 82,000 M-1 cm-1 við 665 nm. Þetta gildi er óvenju vel skjalfest sem mæld hallatala kvörðunar fyrir mjög þynnt vatnssýni. Síðar gaf frumrannsókn á kvörðun í afjónuðu vatni, þar sem notuð voru 2.34 til 37.52 micromolar og 1 cm ljósvegalengd, um 67,100 M-1 cm-1 við 665 nm fyrir heildarmagn litarefnis. Lægri niðurstaðan er eðlileg og ekki í mótsögn við fyrra gildið, því efri helmingur þessa kvörðunarbils inniheldur þegar umtalsvert magn tvíliðu. Þriðja gildið, um 73,460 M-1 cm-1 við 664 nm, kemur úr rannsókn við pH 6.86 og 293 K þar sem mælda rófið var aðgreint í einliðu- og tvíliðuþætti, eins og tekið er saman í nýlegri gagnrýninni yfirlitsgrein um ljóseðlisfræði metýlenblás. Sú tala lýsir aðgreindum einliðuþætti, ekki beinni hallatölu gleypni sem falls af heildarmagni litarefnis.

Hagnýta niðurstaðan er þessi: veldu stuðul sem var ákvarðaður við aðstæður sem samsvara sýnunum þínum, eða gerðu eigin kvörðun. Ekki nota 82,000 í mælingu í 30 micromolar fosfatstuðpúðalausn og gera ráð fyrir að sambandið sé enn línulegt.

Öxlin við styttri bylgjulengdir er blanda

Þegar styrkur eykst verður öxl nálægt 600 til 615 nm meira áberandi miðað við toppinn við 664 nm. Í nýrri rannsóknum er framlag tvíliðu af H-gerð yfirleitt staðsett nálægt 605 til 610 nm. Heildargreining á rófum metýlenblás í vatni aðgreinir tvíliðuhámark við 607 nm og hámark stærri samloðna við 600 nm, ásamt einliðuresónansþáttum við 664 og 650 nm. Heildartextinn er aðgengilegur í gegnum færsluna með opnum aðgangi fyrir PMID 33251415.

Þessa öxl ætti ekki að merkja sem hreina tvíliðugleypni. Titrings- og rafeindabygging einliðunnar leggur einnig til gleypni á sama svæði, svo mæld hæð er samanlagt framlag. Ein heildaraðlögun sýndi að líkan með einliðu og tvíliðu dugði ekki yfir allt bilið frá 1.1 micromolar til 3.4 millimolar. Með því að bæta við fjórliðu fékkst besta aðlögunin, og merki frá fjórliðu var þegar greinanlegt undir 34 micromolar. Styrkleikar aðgreindu þáttanna voru miklir: um 107,800 M-1 cm-1 við 664 nm fyrir aðaleinliðuþáttinn, um 101,400 fyrir tvíliðuna við 607 nm og um 138,500 fyrir fjórliðuna við 600 nm, í afjónuðu vatni án stuðpúða, með natríumklóríði frá 0 til 0.15 M og hitastigi frá 282 til 333 K. Þetta eru þættir sem hafa verið aðgreindir með líkani og því má ekki nota þá í stað mældrar Beer Lambert-hallatölu.

Tvíliðun hefur verið magngreind með beinum hætti. Við pH 6.86 og 293 K fékk ein rannsókn tvíliðunarfastann nálægt 3,900 M-1. Sú stærðargráða skýrir hvers vegna 5 micromolar vinnulausn sýnir nær línulegt samband en 50 micromolar stofnlausn gerir það ekki. Gagnleg athugun við þróun aðferðar er hlutfall gleypni nálægt 610 nm og gleypni nálægt 665 nm. Þegar þetta hlutfall hækkar með styrk lýsir epsilon við 664 nm ekki lengur einni óbreyttri efnaeind.

Á styrkbili þar sem eitt par efnaeinda sem umbreytast hvor í aðra er ríkjandi geta rófin haft sameiginlegan ísósbestískan punkt, sem hefur mælst nálægt 625 nm í vatnslausnaröðum. Skýr, óhreyfanlegur skurðpunktur samræmist því að tvær efnaeindir séu ríkjandi. Þegar punkturinn færist eða hverfur með auknum styrk skal líta á það sem viðvörun um að stærri samloðanir eða breytt jafnvægi séu komin til sögunnar, ekki sem tækjavillu.

Leysir, pH og hitastig breyta rófinu

Vatn stuðlar að samloðun. Viðbót dímetýlsúlfoxíðs dregur úr tvíliðun, færir gleypni- og flúrljómunarhámörk að lengri bylgjulengdum og eykur skammtaheimtur flúrljómunar um það bil fjórfalt, samkvæmt rannsókn á áhrifum leysis á metýlenblátt í vatns- og DMSO-blöndum, sem er skráð sem PMID 30933781. Í þeirri rannsókn er litið á róf í vatnslausn sem einliðu–tvíliðu-jafnvægi með einliðugleypni nálægt 650 til 670 nm og tvíliðugleypni nálægt 580 til 615 nm, og tvíliðunarfastar eru leiddir út frá rófunum við 293.15 K.

Alkóhól breyta bæði staðsetningu og sýnilegum styrkleika, en koma ekki í veg fyrir samloðun. Í einum samanburði í frumrannsókn við 31.3 micromolar og stofuhita, sem greint var frá í rannsókn á áhrifum leysis á metýlenblátt, var hámarkið við lengri bylgjulengd 665 nm í vatni en 655 nm í metanóli. Sýnileg gildi fyrir lausnina í heild voru nálægt 37,100 í vatni og 60,800 í metanóli. Sérstök sannprófun í vatnsfríu etanóli við 298 K gaf hámark við 655 nm og epsilon nálægt 68,000.

Venjulegar pH-breytingar færa rófið minna en margar verklýsingar gera ráð fyrir. Gagnrýna yfirlitsgreinin sem vísað er til hér að ofan greinir frá því að frá um pH 2 til pH 12 hafi hámarkið haldist nálægt 665 nm, með aðeins litlum breytingum á styrkleika allt að pH 11. Gerð stuðpúða og jónastyrkur geta breytt niðurstöðum jafn mikið og skráð pH-gildi. Skráðu því hvaða stuðpúði og salt voru notuð, ekki aðeins aflestur pH-mælisins. Sterk sýra eða sterkur basi er sérstakt tilvik, þar sem litarefnið getur tekið efnafræðilegum breytingum í stað afturkræfrar samloðunar. Hitastig og salt breyta einnig jafnvæginu og þess vegna var hvoru tveggja breytt markvisst í vatnsrannsókninni frá 2020.

Mælingar sem tryggja að gildið haldi gildi sínu

Magngreining byggist á Beer Lambert-sambandinu, þar sem gleypni er jöfn epsilon sinnum styrkur sinnum ljósvegalengd, ásamt staðfestingu á því að línulegt samband haldist í raun á viðkomandi bili við þínar aðstæður.

Notaðu 1 cm mæliker við lágan styrk á micromolar-sviðinu. Með epsilon nálægt 82,000 gefa 5 micromolar gleypni nálægt 0.41 og 10 micromolar um 0.82. Fyrir mælingar sem beinast að einliðu í hreinu vatni er öruggara að halda styrk nálægt eða undir um 5 til 7 micromolar en að kvarða langt upp í tugi micromolar. Fyrir þéttar stofnlausnir skal stytta ljósvegalengdina frekar en að sætta sig við gleypni langt yfir 1.

Núllstilltu með sams konar lausnargrunni: sama vatnsgæðaflokki, sama hlutfalli meðleysis, sama stuðpúða og söltum, en án litarefnis. Útbúðu kvörðunarlausnir í sama lausnargrunni við sama hitastig. Við þróun aðferðar skal skanna allt sýnilega sviðið, helst um 550 til 750 nm, frekar en að mæla aðeins við eina bylgjulengd. Fylgstu með löguninni, ekki aðeins hæðinni. Ef raðþynning breytir stöðluðu lögun rófsins er kerfið efnafræðilega háð styrk. Stöðugt hámark og stöðugt gleypnihlutfall við 610 og 665 nm eru sterkari vísbendingar um viðunandi bil en hátt R í öðru veldi eitt og sér.

Skráðu á hvaða formi hvarfefnið er. Efni á markaði getur verið vatnsfrítt metýltíóníníumklóríð eða hýdrat, svo sem þríhýdrat. Mólmassinn sem notaður er við útreikninga á stofnlausnum verður því að samsvara efninu í flöskunni. Þetta skref eitt og sér skýrir hluta af ósamræminu milli uppgefinna mólstyrkja á rannsóknarstofum. Sama nákvæmni á við þegar niðurstöður eru notaðar í útreikningum magngreininga, þegar róf styðja stöðugleikaathuganir efnablandna og þegar óhreinindasnið kalla á yfirferð hreinleika og gæðaforskrifta.

Samantekt með tilgreindum aðstæðum

Notaðu þessa töflu sem upphafssnið fyrir rannsóknarskráningu, ekki sem safn fasta sem hægt er að nota hvern í annars stað.

Svarið við því hver gleypnibylgjulengd metýlenblás sé er því stutt en með langri neðanmálsgrein. Tilgreindu toppinn sem þú mældir, í lausninni sem þú mældir, við styrkinn sem þú mældir. Sú vinnuregla kemur í veg fyrir að eitt gildi nálægt 664 nm úr þynntri vatnslausn verði að fölskum algildum fasta.