Metýlenblátt og Bartonella: niðurstöður á rannsóknarstofu og takmarkanir klínískra gagna

Ræktunarskál og sjúklingur eiga orðið sýking sameiginlegt, en ekki hugtakið. Í skálinni er sýking talning á þyrpingum á agar. Í sjúklingnum felur hún í sér bakteríur inni í frumum og æðum, lyf sem berast um blóð og vefi og ónæmiskerfi sem vinnur hluta verksins. Ef þessu tvennu er ruglað saman fer sláandi tala úr rannsóknarstofu að líta út eins og meðferð. Ef því er haldið aðskildu verður sama tala það sem hún er: ástæða til að gera næstu tilraun.

Þessi aðgreining er megintilgangur þessa yfirlits um metýlenblátt og Bartonella. Tvær rannsóknarstofurannsóknir frá sama rannsóknarhópi prófuðu metýlenblátt gegn Bartonella henselae í ástandi án vaxtar. Báðar greindu frá öflugri virkni í gleri og plasti. Hvorug prófaði efnið á manneskju.

Hvers vegna rannsakendur prófa kyrrstöðufasann

Flestar sýklalyfjaprófanir nota frumur í vexti. Það líkan nær ekki yfir erfiðara tilvik: frumur sem hafa hætt að skipta sér og þola lyf sem drepa systurfrumur þeirra í vexti.

Bartonella getur haldist í líkamanum, meðal annars inni í rauðkornum og æðaþelsfrumum. Hópurinn spurði því hvaða samþykktu lyf gætu drepið B. henselae eftir að bakterían væri komin í kyrrstöðufasa. Lágt MIC gegn frumum í vexti spáði ekki fyrir um dráp í kyrrstöðufasa. Rifampín hafði mjög lágt MIC en drap kyrrstöðufrumur illa, á meðan efnasambönd með hærri MIC-gildi drápu þær vel. Lesendur sem vilja almenna aðferð til að lesa greinar af þessu tagi finna hana í leiðbeiningunum um lestur rannsókna á metýlenbláu.

Fyrsta skimun: Li og samstarfsfólk, 2019

Skimunin á kyrrstöðufasa frá 2019 í Antibiotics notaði einn stofn, B. henselae JK53, sem var ræktaður í Schneider-æti með 10 prósent sermi úr nautgripafóstrum við 37 C og 5 prósent CO2. Eins dags ræktanir voru að mestu dreifðar frumur í skiptingu. Fimm daga ræktanir, með um 10 í 8. veldi þyrpingamyndandi einingar á mL, voru taldar vera í kyrrstöðufasa og innihéldu sýnilega kekki.

Prófunin notaði SYBR Green I ásamt própídíumjoðíði og var kvörðuð með blöndum lifandi frumna og frumna sem höfðu verið drepnar með ísóprópanóli. Þar sem metýlenblátt er mjög litað voru jákvæðar niðurstöður staðfestar með smásjárskoðun og síðan með þyrpingatalningu á blóðagar, sem var strangari lokamælikvarðinn.

Af 1,581 samþykktu lyfi við 50 míkrómólar styrk skildi metýlenblátt eftir 16 prósent lífvænleika samkvæmt plötulesara og 25 prósent samkvæmt smásjárskoðun. Daptómýsín mældist með 21 prósent, nokkur azól með 22 til 27 prósent, gentamísín með 32 prósent, erýtrómýsín með 66 prósent og síprófloxasín með 74 prósent. Pýrvíníumpamóat virtist öflugra samkvæmt plötulesaranum en ekki var hægt að meta það með smásjárskoðun vegna eigin flúrljómunar.

Gegn B. henselae í vexti var MIC metýlenblás 0.08 til 0.16 míkrógrömm á mL. Gegn fimm daga kyrrstöðufrumum við 5 míkrógrömm á mL féll þyrpingafjöldinn niður í engar greinanlegar þyrpingar eftir eins dags útsetningu, líkt og með daptómýsíni og pýrvíníumpamóati við þann styrk sem prófaður var fyrir hvort efni. Sérstök tímaháð drápstilraun notaði 10 míkrógrömm á mL. Þetta er útsetningarstyrkur á rannsóknarstofu, ekki skammtar, og greinin lýsir honum þannig. Tilvitnað hámarksgildi í blóðvökva hjá mönnum, nálægt 3.9 míkrógrömmum á mL, birtist í greininni aðeins sem bakgrunnsupplýsing. Yfirlitið um lyfjahvörf metýlenblás útskýrir hvers vegna ekki er hægt að túlka gildi í blóðvökva sem gildi í vefjum.

Tvær takmarkanir eru skýrt tilgreindar í greininni. Ekkert lífhimnulíkan var notað og engar samsetningar með metýlenbláu voru prófaðar. Fimm daga kekkirnir voru frumuklasar í vökvarækt í kyrrstöðufasa, ekki sannprófuð lífhimnutilraun. Höfundarnir kölluðu eftir dýrarannsóknum, rannsóknum á samsetningum og lífhimnum og prófunum á öðrum Bartonella-tegundum.

Samsetningar og frumur úr lífhimnum: Zheng og samstarfsfólk, 2020

Framhaldsrannsóknin frá 2020 í BMC Microbiology hélt sama stofni og æti en færði sig yfir í sex daga kyrrstöðuræktanir og bætti við tvennu sem vantaði í fyrri greinina: samsetningum tveggja lyfja og líkani með frumum úr lífhimnum.

Þegar einstök lyf voru prófuð við sama styrk, 5 míkrógrömm á mL í 24 klukkustundir, skildi metýlenblátt eftir 3.2 sinnum 10 í 4. veldi þyrpingamyndandi einingar á mL, samanborið við um 2.8 sinnum 10 í 10. veldi í viðmiðunarrækt. Síprófloxasín, gentamísín og nítrófúrantóín skildu eftir færri þyrpingar á sama tímapunkti. Þetta er ólíkt niðurstöðunni frá 2019, þar sem sami nafnstyrkur skilaði engum greinanlegum þyrpingum eftir einn dag. Aldur ræktana, þéttleiki og meðhöndlun voru mismunandi, þannig að drápsvirknin var endurtekanleg að stefnu til en ekki eins að umfangi. Þessi breytileiki milli tilrauna er ein ástæða þess að hefðbundnar athuganir á öryggi og milliverkunum greina á milli virkni á rannsóknarstofu og klínískra áhrifa.

Skimunin á samsetningum er sá hluti sem oftast er vitnað í. Styrkur hvers efnis var festur við 5 míkrógrömm á mL. Bæði azitrómýsín ásamt metýlenbláu og rifampín ásamt metýlenbláu skiluðu engum greinanlegum þyrpingum úr kyrrstöðufasa eftir 24 klukkustundir, rétt eins og báðar samsetningarnar með síprófloxasíni. Aðeins þessar fjórar samsetningar af 25 prófuðum skiluðu þeirri niðurstöðu. Engin formleg greining á samvirkni var gerð, svo rétta hugtakið er virk samsetning við þessar aðstæður, ekki sönnuð samvirkni.

Lífhimnutilraunin prófaði frumur sem fengnar voru úr ungri, sundraðri lífhimnu, ekki gegnumflæði inn í heila, þroskaða lífhimnu. Ræktanir voru látnar vaxa í fimm daga, þynntar í holuplötur til ræktunar í fimm daga til viðbótar, staðfestar með kristalfjólublárri litun og síðan skafnar upp fyrir útsetningu fyrir lyfjum. Við 5 míkrógrömm á mL lækkaði metýlenblátt eitt og sér fjöldann í 2.3 sinnum 10 í 2. veldi á degi 6. Það var meðal bestu einstöku efnanna, en fjöldinn náði ekki núlli. Báðar samsetningarnar með metýlenbláu náðu núlli á degi 6, rétt eins og báðar samsetningarnar með síprófloxasíni.

Höfundarnir bentu á sömu takmarkanir og vandvirkur lesandi myndi sjá: ung, uppskafin lífhimna fremur en gömul, heil lífhimna; einn hentugur styrkur fyrir öll lyfin í stað raunhæfs hámarksstyrks fyrir hvert lyf; aðeins valdar samsetningar með azitrómýsíni eða rifampíni; einn stofn; engin dýr; engir sjúklingar. Síðari rannsóknir á þriggja lyfja samsetningum voru lagðar til, en ekki var greint frá þeim.

Samanburður á rannsóknarsniði

Taflan dregur saman kjarna þessarar greinar. Allt vinstra megin við síðasta dálkinn eru ræktunarrannsóknir. Ekkert í hvorugri greininni fellur undir síðasta dálkinn.

Bartonella er ekki Borrelia

Báðar greinarnar nefna Borrelia burgdorferi, gormbakteríuna sem veldur Lyme-sjúkdómi, vegna þess að litarefnaprófunin kom úr fyrri rannsóknum á kyrrstöðufasa Borrelia á sömu rannsóknarstofu. Þar höfðu metýlenblátt og daptómýsín einnig sýnt virkni í skimun. Þessi forsaga er gagnlegt samhengi en einnig algeng uppspretta mistaka.

Engin tilraun í hvorugri Bartonella-greininni prófar Borrelia samhliða Bartonella. Lífverurnar eru ólíkar, ætin eru ólík, styrkurinn er ólíkur og tilgátan um áhrif metýlenblás á frumuhimnu Bartonella var sett fram sem ágiskun sem þyrfti að rannsaka frekar. Ekki ætti að yfirfæra niðurstöður milli tegunda, og hvorug greinin styður almennar fullyrðingar um sníkjudýr. Samanburðurinn á þrautseigum frumum Borrelia og Bartonella heldur rannsóknaritum um þessar tvær bakteríur aðskildum af þessari ástæðu.

Hvers vegna ræktanir verða ekki að meðferðaráætlun

Áhugi á að leita að meðferðaráætlun með metýlenbláu gegn Bartonella er skiljanlegur. Þessar greinar sýna hvers vegna líta ætti á það orðalag sem viðvörunarmerki fremur en innkaupalista.

Í fyrsta lagi eru 5 míkrógrömm á mL í holu ekki lyfseðill. Þeim fylgja engar upplýsingar um frásog, dreifingu, próteinbindingu, gegnumflæði inn í frumur eða þolanleika. Höfundarnir völdu þennan styrk sem gróft meðaltal hámarksstyrks sýklalyfja og sögðu að í framtíðarrannsóknum ætti að nota raunhæfan styrk fyrir hvert lyf.

Í öðru lagi merkja engar þyrpingar að engar þyrpingar hafi greinst við þær aðstæður sem notaðar voru við sáningu á plötur, ekki að vefur sé dauðhreinsaður. Þrautseigar bakteríufrumur, bakteríur innan frumna og takmarkanir sýnatöku falla allt utan þess sem agarplatan sýnir.

Í þriðja lagi geta samsetningar sem dauðhreinsa holu brugðist eða valdið skaða í líkama. Azitrómýsín ásamt metýlenbláu og rifampín ásamt metýlenbláu eru lyfjapör á rannsóknarstofu við útsetningu á rannsóknarstofu. Án upplýsinga um lyfjahvörf í dýrum og gagna úr samanburðarrannsóknum á mönnum er hvorki fyrir hendi skammtur, meðferðarlengd né hlutfall ávinnings og áhættu. Allir sem vega og meta valkosti ættu að ræða þá við lækni og kynna sér hvenær notkun metýlenblás krefst lækniseftirlits áður en þeir draga nokkra ályktun af gögnum úr ræktunarskálum.

Sú afmarkaða niðurstaða sem þessar greinar styðja er þessi: metýlenblátt hefur endurtekanlega virkni gegn B. henselae JK53 án vaxtar in vitro, meðal annars í samsetningum tveggja lyfja á rannsóknarstofu. Sterkustu niðurstöðurnar fyrir samsetningar og frumur úr lífhimnum koma úr rannsókninni frá 2020. Allt annað, þar á meðal hvort þessi virkni skipti máli fyrir bartonellusýkingu í mönnum, er enn óprófað.