EMB-agar og MacConkey-agar: val og túlkun ætis

Nemandi strikar sama vatnssýnið á tvær skálar. Á annarri birtast dökkar þyrpingar með málmgrænum gljáa. Á hinni birtast skærbleikar þyrpingar með móðukenndum baug. Báðar skálarnar voru sáðar úr sama glasi, ræktaðar hlið við hlið og lesnar á sama tíma. Nemandinn spyr hvor skálin sé rétt.

Báðar skálarnar eru réttar. Þær svara ólíkum spurningum. Ruglingur verður þegar ætin tvö eru meðhöndluð sem jafngild skimunaræti fyrir þarmabakteríur. Þau hafa sameiginlegan tilgang, að velja Gram-neikvæðar þarmabakteríur og aðgreina laktósagerjendur frá ógerjendum, en ná því fram með ólíkri efnafræði og ólíkri sjónrænni túlkun. Þegar þessi tvö grundvallarhugtök eru skýr verður val á skál og lestur þyrpinga að venjubundnu ferli.

Stutta svarið

EMB-agar notar tvö litarefni, eosin Y og metýlenblátt, sem gegna tvöföldu hlutverki: þau bæla vöxt Gram-jákvæðra baktería og falla út í kringum öfluga sýruframleiðendur þannig að dökkar þyrpingar myndast, klassískt með málmgrænum gljáa hjá Escherichia coli. MacConkey-agar skiptir hlutverkunum upp: gallsölt ásamt kristalfjólubláu bæla Gram-jákvæðar bakteríur, laktósi er hvarfefni gerjunar og neutral red sýnir sýrumyndun sem bleikar eða rauðar þyrpingar. Ef verkefnið er áberandi forgreining á E. coli á EMB vel við. Ef verkefnið er skýr aðgreining bleikra laktósagerjenda frá litlausum ógerjendum, sérstaklega í verkferlum með saur- eða þvagsýni, er MacConkey yfirleitt einfaldara í aflestri. Hvorug skálin greinir lífveru til tegundar út frá lit einum saman.

EMB: litarefni sem bæði velja og gefa merki

Hugmyndin að baki EMB sameinar sértækni og vísun í sömu sameindunum. ASM-verklýsingin fyrir eosin methylene blue agar lýsir EMB sem bæði sértæku og aðgreinandi æti þar sem litarefnin tvö hamla mörgum Gram-jákvæðum lífverum á meðan laktósagerjun knýr upptöku og útfellingu litarefnanna. Hefðbundin Levine-samsetning inniheldur peptón, laktósa, fosfat, eosin Y, metýlenblátt og agar, eins og tilgreint er í FDA BAM-aðferðinni fyrir Levine EMB-agar. Athugaðu að í sumum eldri EMB-uppskriftum var súkrósa bætt við ásamt laktósa, en Levine EMB inniheldur laktósa án súkrósa, þannig að skrá skal hvaða samsetningu rannsóknarstofan notar.

Við lestur EMB er hegðun litarefnanna lesin. Öflug laktósagerjun framleiðir næga sýru til að valda mikilli útfellingu litarefna, sem gefur E. coli dökkblásvartar miðjur og, í klassíska tilvikinu, málmgrænan gljáa í endurköstuðu ljósi. Veikari gerjendur á borð við Enterobacter og Klebsiella vaxa yfirleitt sem bleikar til fjólubláar slímkenndar þyrpingar án þessa gljáa. Ógerjendur á borð við Salmonella, Shigella og Proteus vaxa almennt sem litlausar eða hálfgagnsæjar þyrpingar vegna þess að þeir framleiða ekki þá snöggu sýrumyndun sem veldur útfellingu litarefnanna. Gram-jákvæðar bakteríur eru yfirleitt bældar, þó bæling sé stigsbundin og breytileg eftir stofni og vöru. Ítarleg efnafræði litarefnablöndunnar, þar á meðal hvers vegna metýlenblátt hegðar sér sem katjónískt litarefni, tilheyrir sérstakri umfjöllun um litarefnasamsetningar, en almennt samhengi smásjárvinnu er að finna í yfirliti yfir litunaraðferðir. Hér er áherslan á val á skálum og túlkun þeirra.

Myndin hér að ofan er til skýringar. Hún sýnir það sjónræna mynstur sem búast má við: dökkar þyrpingar með gljáa, bleikar slímkenndar gerðir og ljósar gerðir á EMB, samanborið við bleikar og ljósar gerðir á MacConkey. Notaðu hana til að læra mynstrið en staðfestu síðan sérhvert mat með ljósmynduðum viðmiðum og fylgiseðli nákvæmlega þess ætis sem er á vinnubekknum.

MacConkey: aðskilin hlutverk, einfaldari sjónræn regla

Hugmyndin að baki MacConkey felur í sér að hvert hlutverk er falið sérstöku innihaldsefni. ASM-verklýsingin fyrir MacConkey-agar notar sömu flokkun sem sértækt og aðgreinandi æti og FDA BAM-aðferðin fyrir MacConkey-agar telur upp virku þættina: peptón, laktósa, gallsölt, salt, neutral red, kristalfjólublátt og agar. Gallsölt ásamt kristalfjólubláu velja gegn Gram-jákvæðum bakteríum. Laktósi veitir hvarfefni fyrir gerjun. Neutral red virkar sem pH-vísir og verður bleikt til rautt þar sem sýra myndast, stundum með útfellingu galls í kringum öfluga gerjendur.

Aflestrarreglan er viljandi einföld: bleikt merkir laktósagerjanda, litlaust eða fölt merkir ógerjanda. E. coli birtist bleik til rauð, oft með baug af gallútfellingu. Klebsiella og Enterobacter birtast bleikar og eru oft slímkenndar vegna hjúpsins. Salmonella, Shigella, Proteus og margar aðrar Gram-neikvæðar stafbakteríur birtast litlausar. Einn kostur skiptir máli í kennslurannsóknastofum: gallsölt draga almennt úr sveimvexti Proteus, þannig að auðveldara er að fá einangraðar þyrpingar á MacConkey en á ósértækum ætum, þó bælingin sé ekki algjör og saltlausir valkostir séu til þegar stjórnun sveimvaxtar er meginmarkmiðið.

Sameindafræðilega ástæðan fyrir þessari hegðun litarefnanna tengist hleðslu og byggingu. Metýlenblátt er katjónískt fenótíasínlitarefni og bygging þess og eiginleikar skýra sækni þess í súrt yfirborð baktería, sömu sækni og kemur við sögu þegar það fellur út á súrum svæðum á EMB.

Samanburður í hnotskurn

Lestu töfluna sem ákvörðunarferli. Þegar æfingin krefst þess að nemendur sjái stigmun á gerjunarstyrk með einum áberandi endapunkti sýnir EMB hann. Þegar æfingin krefst hraðrar tvískiptingar fyrir lífefnafræðilega staðfestingu sýnir MacConkey hana.

Hvaða æti fyrir hvaða sýni

Í vatnsæfingum sem miða að forgreiningu á saur-kólígerlum eða E. coli er EMB hentugt vegna þess að gljáinn er sjónrænt áberandi. MacConkey hentar einnig Gram-neikvæðum þarmabakteríum og hefur sögulega verið notað við vatnsrannsóknir, en hvorug skálin kemur í stað staðlaðrar eða lögbundinnar vatnsrannsóknaraðferðar, sem getur tilgreint æti á borð við modified mTEC eða MI eftir prófinu. Athugaðu hvaða aðferð rannsóknarstofunni er skylt að fylgja.

Fyrir aðgreiningu gerjenda frá ógerjendum í verkferlum sem líkja eftir saursýnum er MacConkey almennt gagnlegra þessara tveggja. Í verklegri vinnu með saursýni vegna Salmonella eða Shigella eru venjulega einnig notuð sértækari þarmaæti á borð við XLD eða Hektoen enteric í stað þess að reiða sig eingöngu á MacConkey.

Í kennslu með þvagsýnum sem líkir eftir klínísku verkflæði er MacConkey notað ásamt blóðagar. MacConkey veitir fyrstu aðgreiningu Gram-neikvæðra baktería en blóðagar endurheimtir lífverur sem MacConkey bælir. Þessari samsetningu er almennt lýst í klínískum verkferlum fyrir uppsetningu þvagræktunar.

Í kennslu sem beinist eingöngu að hugtökunum er gagnlegt að nota bæði ætin. EMB kennir að styrkur gerjunar skipti máli og að sama sameind geti gegnt tveimur hlutverkum. MacConkey kennir einingaskipta hönnun: valþáttur, hvarfefni og vísir eru aðskilin. Nemendur sem strika þekktan E. coli, þekktan Klebsiella aerogenes og þekktan Salmonella hlið við hlið á bæði æti rugla sjaldan þessum tveimur túlkunarkerfum saman aftur.

Túlkunarvillur sem endurtaka sig á hverju misseri

Algengasta mistökin eru að greina lífveru út frá lit einum saman. Bleikt á MacConkey getur verið E. coli, Klebsiella, Enterobacter eða annar gerjandi. Litlaust getur verið Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas eða annar ógerjandi. Litur er skimunarsvipgerð sem stýrir staðfestingarvinnu, svo sem Gram-litun, oxidasaprófi, lífefnafræðilegum prófunarsettum eða tækjagreiningu, en er ekki tegundarheiti.

Önnur algeng mistök eru að leggja of mikla áherslu á að gljáa vanti. Sumar raunverulegar E. coli-þyrpingar, sérstaklega einangraðar þyrpingar, mynda lítinn eða engan málmgljáa á EMB. Skortur á gljáa útilokar ekki E. coli og gljái sannar ekki að um E. coli sé að ræða. Líttu á gljáann sem vísbendingu til forgreiningar.

Þriðju mistökin eru að bera saman skálar af mismunandi aldri. Laktósagerjendur með seinkaða gerjun geta orðið bleikir á MacConkey eftir langa ræktun, sem óskýrir hreina aðgreiningu gerjenda frá ógerjendum. Lestu niðurstöðuna á þeim tíma sem rannsóknarstofan tilgreinir og skráðu ræktunartímann með niðurstöðunni.

Fjórðu mistökin eru að lesa blandaðan vöxt sem eina lífveru. Bleik þyrping við hlið litlausrar þyrpingar sýnir tvær svipgerðir, ekki millistig. Veldu vel einangraðar þyrpingar og vinndu með hverja útlitsgerð fyrir sig. Slímkennd áferð getur einnig leitt til villu: bæði Klebsiella og Enterobacter geta litið slímkennd út, þannig að hjúpur einn og sér ákvarðar aldrei heitið. Lífveran sem áður var kennd sem Enterobacter aerogenes er nú flokkuð sem Klebsiella aerogenes, sem skýrir hvers vegna eldri töflur og nýrri merkingar virðast stangast á.

Viðmið og lokaregla

Notaðu ljósmynduð eða fersk viðmið í hverri lotu: E. coli fyrir viðbrögð öflugs gerjanda, Klebsiella aerogenes fyrir slímkennda gerjun án klassíska gljáans, Salmonella-stofn fyrir litlaus viðbrögð ógerjanda og Staphylococcus aureus til að staðfesta bælingu Gram-jákvæðra baktería á nákvæmlega þeirri vöru sem notuð er. Láttu stofnnúmer og samþykkisviðmið samsvara fylgiseðli framleiðandans, því sértæknin breytist með magni galls, kristalfjólublás og litarefna.

Mundu eina setningu við vinnubekkinn. EMB notar litarefni sem bæði velja og gefa merki, sem veitir áberandi E. coli-merki en krefst fínlegri túlkunar. MacConkey aðskilur val frá vísun, sem veitir einfalda aðgreiningu bleiks frá fölu en sýnir minni upplýsingar um styrk gerjunar. Veldu ætið þar sem grundvallarhugmyndin samsvarar spurningunni, staðfestu litinn með viðeigandi prófum og þá hætta skálarnar tvær að keppa og fara að vinna saman.