Methylene blue maka ịgba DNA na RNA agba: ojiji na jel na membran

Nwa akwụkwọ mere nnwale jel agarose, jiri methylene blue gbaa ya agba, ma ọ hụghị ihe ọ bụla n’ebe ọ tụrụ anya ịhụ ahịrị na-enwu gbaa. N’ebe ọrụ dị nso, onye nchọpụta gụchara doctorate jiri otu karama ihe agba anụnụ anụnụ ahụ gbaa membran Northern agba ma nweta ahịrị ribosom doro anya n’ime nkeji atọ. Nwa akwụkwọ ahụ kwubiri na jel ahụ dara. Jel ahụ adaghị. Ọrụ abụọ ahụ dị iche, otu ihe agba ahụ na-azakwa ha site n’ikike nchọpụta dị iche, agba ndabere dị iche, na iwu dị iche maka ihe a ga-eme na-esote.

Ịgba DNA agba na methylene blue na ịgba RNA agba na methylene blue nwere otu kemistri, ma nzube ha abụghị otu. Na jel, ihe agba ahụ na-egosi ole asid nukleik dị n’ime ihe nwere obere oghere. N’elu membran, ọ na-egosi ma mbufe gara nke ọma na ma e tinyere ihe n’ụzọ jel niile n’otu nha. Ozugbo ọdịiche ahụ doro anya, usoro, oke nchọpụta, na oke ndakọrịta na-adị mfe nghọta.

Azịza dị mkpirikpi

Methylene blue bụ ihe agba dị larịị nke nwere chaji dị mma, nke na-ejikọta na asid nukleik n’enweghị njikọ kovalent, a pụkwara ịtụgharị njikọ ahụ azụ. Ọ na-eme nke a site na ngwakọta nke ndọta chaji eletrik n’ebe phosphate dị, ịbanye n’etiti ụzọ abụọ nke ntọala, na njikọ n’obere oghere DNA. Ikike ịtụgharị njikọ ahụ azụ bụ isi ihe. A pụrụ ịgba ahịrị agba, jiri ìhè a na-ahụ anya hụ ha, dekọọ ha, wee wepụ agba ahụ ma ọ bụ sachaa ha maka klonin, njikọ ngwakọ, ma ọ bụ iji ihe nyocha ọzọ nyochaa ha.

Maka ịgba DNA nwere ụdọ abụọ agba na jel agarose site na methylene blue, ntụziaka ngwa ngwa a na-ejikarị bụ 0.02 percent w/v (200 micrograms kwa mL) n’ime mmiri, ihe dị ka nkeji 15 ịgba agba tinyere ihe dị ka nkeji 15 iwepụ agba na mmiri, wee lee ya n’elu igbe ìhè ọcha. Maka membran, ntụziaka Northern blot ọdịnala bụ ihe agba 0.02 ruo 0.04 percent n’ime sodium acetate dị nso na pH 5.2, ịgba agba ruo nkeji ole na ole mgbe mbufe na ịkwado ihe n’ebe ya gasịrị, wee jiri mmiri sachapụ ya ma wepụ agba niile tupu njikọ ngwakọ. Ikike nchọpụta ya adịghị elu: ọtụtụ iri ruo ọtụtụ narị nanograms n’ahịrị jel ọ bụla mgbe ọnọdụ dị mma, akwụkwọ nduzi ndị na-eji atụmatụ akpachapụrụ anya na-edekwa 0.5 ruo 1 microgram. Nke ahụ ji ọtụtụ ọkwa iri karịa ihe ethidium bromide na ihe agba SYBR chọrọ iji chọpụta ihe. N’elu membran, enweghị otu oke nchọpụta bara uru maka otu transkript, n’ihi na ihe agba ahụ na-egosikarị RNA ribosom nke dị ukwuu na mkpokọta ihe e tinyere. Ejila mmiri mgbakwunye a na-ere n’ụlọ ahịa dochie ihe dị n’otu n’ime ntụziaka ndị a. Usoro ndị a kwadoro na-adabere n’ihe agba ruru ọkwa nyocha, mmiri nchekwa pH akọwapụtara, na njikwa na-enweghị RNase ebe RNA dị.

Otu njikọ si arụ ọrụ, na ebe ọ pụrụ iduhie

Ụdị nkọwa bara uru nwere akụkụ atọ. Nke mbụ, usoro mgbanaka nke nwere chaji dị mma na-adọta n’ọkpụkpụ azụ phosphate nke nwere chaji na-adịghị mma. Nnyocha spektroskopi chọpụtara na ndọta chaji eletrik a na-achị mgbe nnu dị ntakịrị, ebe imepụta ụdị na nyocha mmegharị molekul na-egosi na ịbanye n’etiti ntọala na ijikọ n’obere oghere bụ ụzọ njikọ kwụsiri ike maka DNA nwere ụdọ abụọ, dị ka a chịkọtara na nyocha spektroskopi banyere njikọ methylene blue na DNA. Nke abụọ, enwere ntakịrị mmasị maka GC, ebe ụdị kọmputa na-akwado usoro CpG na GpC, nnwale na-akọkwa na njikọ na-aka eme na ụdọ abụọ nwere GC dị ukwuu n’ọrụ gbasara ebe methylene blue na-ahọrọ ịbanye n’etiti ntọala, ma ụdọ abụọ AT na-ejikọtakwa. Ịgba agba a na-eme mgbe niile anaghị ahọrọ otu usoro ntọala kpọmkwem. Nke atọ, DNA nwere otu ụdọ na RNA na-ejikọkarị site na ndọta chaji eletrik na ịdọkọ ọnụ na ntọala ndị a pụrụ iru na mpaghara ụdọ abụọ; nke a bụ ihe mere ike agba ji agbanwe dabere n’ogologo, usoro ntọala, na nhazi nke abụọ.

Ihe abụọ na-esite na nke a. N’ihi na njikọ ahụ abụghị kovalent, mmiri na-asachapụ ihe agba ahụ. Ahịrị polyacrylamide na-achapụ ngwa ngwa ma ọ bụrụ na a kpachaghị anya mee ka ha kwụsie ike, enwerekwa ụdị usoro pụrụ iche maka ịkwado agba ruo mgbe ebighị ebi kpọmkwem n’ihi na ịgba agba nkịtị bụ nke nwa oge, dị ka Soto na Draper kọwara maka jel PAGE. N’ihi na ihe agba ahụ na-eme ka ihe meghachi omume n’ìhè, ịwụkwasị ìhè siri ike ruo ogologo oge n’elu DNA a gbara agba mgbe oxygen dị nwere ike ịkpata oksideshọn nke guanine ma mechaa mee obere mgbaji n’ụdọ, usoro a kọwara nke ọma n’ọrụ banyere oksideshọn guanine nke methylene blue na-akwalite site n’ìhè. Iji ìhè ọcha lelee ihe obere oge na-ezere mmebi UV a maara nke ọma na usoro ethidium bromide ọdịnala, uru ahụ dịkwa adị maka iweghachite ihe a ga-eji rụọ ọrụ ọzọ. Ìhè a na-ahụ anya dị nro karịa, ọ bụghị na ọ naghị emebi ihe. Mee ka oge ìhè dị mkpirikpi mgbe a ga-eji DNA mee klonin. Maka kemistri ìhè sara mbara nke kpatara ịkpachara anya ahụ, hụ ụzọ abụọ dị na kemistri ìhè methylene blue. Maka ụzọ abụọ redox na ọnọdụ chaji na-akọwa ihe mere ụdị oksideshọn ji ejikọ ebe ụdị redọkshọn anaghị ejikọ, hụ kemistri nke nhazi na njirimara methylene blue.

Ọrụ nke mbụ: ịgba agba n’ime jel

Ịgba jel agba na-aza otu ajụjụ: asid nukleik dị n’ahịrị a ọ zuru ezu ka anya hụ ya? DNA nwere ụdọ abụọ n’ime agarose bụ ọnọdụ a nyochara nke ọma karịa ndị ọzọ. Usoro mbụ Flores na ndị otu ya ji methylene blue gbaa jel agba kwadoro usoro ngwa ngwa 0.02 percent na agarose 1 percent ma gosipụta na e nwere ike iweghachite DNA ma mee klonin nke ọma mgbe nke ahụ gasịrị. Otu usoro onye na-eweta ngwaahịa ahụ dị na ibe ngwaahịa methylene blue nke IBI Scientific, nke depụtara ntụziaka membran 0.04 percent na ụdị jel ngwa ngwa n’akụkụ ibe ha.

Usoro ọrụ a na-eme eme:

1. Mee ka jel gaa dịka a na-emebu. Gbaa agba mgbe electrophoresis gasịrị, ọ bụghị mgbe ọ na-aga, ma ọ bụrụ na akwadobeghị mbufe ma ọ bụ ikike ikewapụ ihe maka usoro a gbanwere.
2. Tinye ya n’ime methylene blue 0.02 percent w/v n’ime mmiri a sachara site na distillation, jiri nwayọọ mee ka ọ na-agagharị, ruo ihe dị ka nkeji 15.
3. Wepụ agba site n’ịgbanwe mmiri ọtụtụ ugboro, ruo ihe dị ka nkeji 15 n’ozuzu, ruo mgbe agba ndabere nke jel belatara, ahịrị ndị ahụ wee pụta ìhè.
4. See foto ozugbo n’elu ngwaọrụ ìhè ọcha.

Agarose na polyacrylamide na-akpa àgwà dị iche. Agarose na-ejide ihe agba n’ime jel, ya mere iwepụ agba bụ akụkụ na-ewe oge. Jel polyacrylamide dị gịrịgịrị na-anata agba ngwa ngwa ma na-atụfukwa ya ngwa ngwa; nke a na-enyere ịkpụpụta ihe maka ọrụ ọzọ aka ma na-emebi ndekọ a chọrọ idobe ogologo oge. A pụrụ ịchọta oligonukliotaịd e mepụtara n’ime polyacrylamide site n’otu ntụziaka 0.02 percent ahụ n’ime nkeji 20 ruo 30, na-asacha ya na mmiri ugboro ugboro, na-agbaso usoro PAGE a kwadoro nke ụdị Current Protocols. A kọọrọ ụdị ndị nwere ntinye dị nnọọ ala, nso na 0.0002 percent n’ime TBE a gwakọtara ka ọ dị obere, maka oligo a ga-eji rụọ ọrụ ọzọ, nke na-ewe ọtụtụ awa, ma ihe akaebe na-akwado ha adịghị ike otú ahụ.

Ọ dị mkpa ma ihe ahụ bụ DNA ma ọ bụ RNA. DNA nwere ụdọ abụọ na-enye njikọ ahaziri ahazi kacha sie ike. RNA na DNA nwere otu ụdọ na-anata agba, ma ọ naghị esi ike otú ahụ, a naghịkwa ebu amụma ya nke ọma. Maka jel RNA agarose nwere formaldehyde, ọtụtụ ụlọ nyocha anaghị agba agba anụnụ anụnụ n’ime jel; ha na-ebufe RNA n’elu membran tupu ha agbaa ya agba n’ebe ahụ. Mgbanwe ahụ na-eji ihe ngosi membran doro anya karị na ndekọ ihe e tinyere dochie ihe ngosi jel na-adịghị ike.

Ọrụ nke abụọ: ịgba agba n’elu membran

Ịgba membran agba na-aza ajụjụ ọzọ: mbufe ahụ ọ gara nke ọma, ụzọ jel ndị ahụ ọ bụ ihe a pụrụ ịtụnyere? Ojiji ọdịnala bụ usoro Herrin na Schmidt nke ịgba Northern blot agba a pụrụ iwepụ. Na mbụ, ọ bụ ihe agba 0.04 percent n’ime sodium acetate 50 mM na pH 5.0 ruo nkeji 2 ruo 3, wee jiri mmiri sachapụ ya; a pụrụ iwepụ ya na SDS nwere ntinye dị ala n’ime SSPE tupu njikọ ngwakọ.

Ụdị nke oge a nke a na-ejikarị na-aga otu a:

1. Bufee RNA ma ọ bụ DNA e kewapụrụ ụdọ ya n’elu nylon ma ọ bụ nitrocellulose, wee jiri njikọ obe UV ma ọ bụ ikpo ọkụ kwado ya n’ebe ahụ ka ihe nnwale ahụ ghara ịla n’iyi mgbe a na-agba agba.
2. Ọ bụghị iwu, ma a na-eme ya ọtụtụ mgbe: jiri acetic acid 5 percent mee ka membran ahụ dee mmiri ruo ihe dị ka nkeji 15.
3. Gbaa agba ruo nkeji 5 ruo 10 n’ime methylene blue 0.02 ruo 0.04 percent n’ime sodium acetate 0.3 ruo 0.5 M dị nso na pH 5.2.
4. Sachapụ ma wepụ agba n’ime mmiri ruo nkeji 5 ruo 15, dekọọ ya, wee wepụ ihe agba fọdụrụ tupu njikọ ngwakọ.

Nylon nwere chaji dị mma bụ ihe a na-ejikarị n’ọrụ Northern. Nitrocellulose na-arụkwa ọrụ na otu usoro acetic acid tinyere acetate ahụ. A na-eji onyonyo ahụ kwado na mbufe gara nke ọma, tụnyere ahịrị 28S na 18S (ma ọ bụ 23S na 16S maka RNA nje bacteria), kaa akara n’ihe atụ nha na ụkpụrụ ntụnyere, ma debe ndekọ ntule nke ime ka mkpokọta RNA bụrụ nha ntụnyere. Usoro Northern ndị e bipụtara na-atụ ahịrị ribosom a gbara agba iji nyochaa ihe e tinyere, gụnyere ọrụ sayensị mmiri ara ehi nke ji ahịrị ribosom a gbara agba na methylene blue mee ka nha bụrụ nke a pụrụ ịtụnyere. A pụrụ ịhụ membran Southern n’otu ụzọ ahụ, ma ojiji ihe agba ahụ dị ka ụzọ ịlele ihe e tinyere na mbufe Northern bụ nke a kwadoro nke ukwuu karịa. A na-ekewapụkwa ụdọ DNA Southern tupu mbufe, ya mere ọnụọgụ ikike nchọpụta jel anaghị emetụta ya ozugbo.

Oke nchọpụta na agba ndabere: ebe anụnụ anụnụ na-adịghị eru

E mere ntụnyere dị n’okpuru ka ọ bụrụ nke atụmatụ. Ọrụ ihe agba na-adabere na percent jel, obosara ahịrị, ngwaọrụ anya, na ịdị uchu n’iwepụ agba. Were ọnụọgụ ọ bụla dịka ọkwa nha, ọ bụghị nkọwa arụmọrụ a ga-enwerịrị.

Njikwa agba ndabere na-ekpebi ma ihe ngosi na-adịghị ike ahụ ọ bara uru. Ihe agba nke na-ejikọghị na ihe nwere agba siri ike, ya mere ọdịiche a na-ahụ anya na-esite n’iwepụ ihe agba na-ejikọghị na ihe n’enweghị iwepụ nke jikọtara. Ihe agba nwere ntinye dị elu anaghị agbakwụnye ikike nchọpụta ọtụtụ mgbe. Ihe ọ na-agbakwụnye bụkarị oge iwepụ agba. Mee usoro nnwale ntinye na-agbadata n’otu jel, membran, na igwefoto ahụ kpọmkwem, ma jiri naanị mpaghara nke nchikota ike agba ka na-adaba n’ogo ihe e tinyere. Methylene blue na-akwado ime ka nha ihe e tinyere bụrụ nke a pụrụ ịtụnyere site na ntule ọnụọgụ. Ọ bụghị nnwale ọnụọgụ nke na-atụ ọtụtụ ọkwa nha n’ụzọ ziri ezi, n’ihi na ikike membran ijide ihe, arụmọrụ mbufe, njupụta, na iwepụ agba na-agbanwe site n’otu ụzọ jel gaa n’ọzọ.

Oke ndakọrịta: ihe ka na-arụ ọrụ mgbe ịgba agba gasịrị

E gosipụtala klonin mgbe ịgba agba anụnụ anụnụ gasịrị. Flores na ndị otu ya bepụrụ ahịrị agarose a gbara agba, weghachite DNA, jikọta ya ma tinye ya n’ime sel, wee kọọrọ klonin ka mma karịa mgbe ejiri ethidium bromide na UV. Ihe kpatara ya nwere ike ịbụ mmebi ìhè dị ntakịrị, ọ bụghị uru sitere n’ihe agba n’onwe ya. Mee ka oge ikpughe n’ìhè ọcha dị mkpirikpi, wee jiri usoro nhicha DNA a na-ejikarị ewepụta ihe na jel sachaa DNA a weghachitere.

Ihe akaebe maka PCR na ịgụ usoro ntọala pere mpe karịa. Ihe agba fọdụrụ na-ejikọta na asid nukleik, ya mere wepụ agba ma sachaa ihe ahụ tupu usoro ndị na-eji enzaịm. A na-atụ anya na DNA a sachara nke ọma site na jel anụnụ anụnụ ga-arụ ọrụ, ma a tụbeghị nke ọma ole ihe agba fọdụrụ polymerase dị iche iche na kemistri ịgụ usoro ntọala nwere ike ịnagide. Echela na ha ga-anagide ya.

Njikọ ngwakọ blot na-adakọ mgbe a gbasoro usoro n’usoro siri ike: bufere, kwado n’ebe ya, gbaa agba, dekọọ, wepụ agba, mee njikọ ngwakọ. Usoro ahụ bụ nhazi Herrin na Schmidt. Ịgba agba tupu mbufe, ma ọ bụ ịhapụ iwepụ agba, bụ usoro ọzọ nke chọrọ nkwado nke ya. Mgbe e wepụchara ihe agba, iwepụ ihe nyocha na iji ihe nyocha ọzọ emegharị nyocha na-aga dịka a na-emebu. Maka ịgba agba n’ogo sel na otu ezinụlọ ihe agba ahụ, na ihe mere echiche usoro akwa a kwadoro anaghị emetụta usoro sel dị ndụ, hụ atlas ịgba agba maka mikroskopi.

Ịkpụpụta ahịrị na-arụ ọrụ maka agarose a ga-eji weghachite ihe maka ọrụ ọzọ na maka oligo PAGE a chọtara site n’anụnụ anụnụ, ma ọ bụrụ na a zere ụdị ịkwado agba ruo mgbe ebighị ebi. Iji eletrik wepụta ihe mgbe iwepụ agba gasịrị bụ ihe kwekọrọ na kemistri maka ihe njikọ a pụrụ ịtụgharị azụ, ma data a chịkwara nke ọma banyere ọnụọgụ ihe a na-enweta kpọmkwem na methylene blue pere mpe. Wepụ nnu ma ọ bụ mee ka ihe ahụ dapụta n’ime mmiri mgbe ewepụtachara ya.

Nsogbu ndị na-eme ugboro ugboro

Ahịrị jel na-adịghị acha nke ọma na-apụtakarị na ibu ihe dị obere maka ihe agba a na-ahụ site na agba ya, karịsịa maka ihe a na-achọ nke nwere otu ụdọ dị mkpụmkpụ ma ọ bụ RNA. Tinye ihe karịa, jiri ihe agba ọhụrụ, mee ka oge ịgba agba dị ogologo tupu ịbawanye ntinye, ma kwụsị iwepụ agba n’oge mbụ. Jel nke na-acha anụnụ anụnụ niile n’enweghị ọdịiche na-apụtakarị na e tinyere agba karịa ka o kwesịrị ma ọ bụ na a gbanweghị mmiri ugboro zuru ezu. Ahịrị PAGE na-achapụ bụ kemistri a tụrụ anya ya, ọ bụghị ịgba agba dara. See foto ngwa ngwa. Agba ndabere membran na-adaghị n’otu na-egosi mpịachi, afụ ikuku, akara mkpịsị aka, mmegharị na-adaghị n’otu, ma ọ bụ mbufe na-emeghị n’ebe niile. Akọwala nke ahụ dịka ihe e tinyere na-adaghị n’otu ma ọ bụrụ na enweghị nnwale njikwa njikọ ngwakọ. Ụdị ahịrị ribosom na-adịghị ike ma gbasasịa nwere ike igosi nbibi, ma ọ nwekwara ike ịbụ mbufe ezughị ezu, mkpokọta RNA dị ntakịrị (ụzọ jel a na-ejikarị na-ebu ọtụtụ micrograms ruo ọtụtụ iri micrograms), ma ọ bụ iwepụ agba karịa ka o kwesịrị. Ihe agba ahụ na-egosi RNA ribosom nke dị ukwuu. Ọ naghị egosi otu transkript kpọmkwem. Ọrụ ahụ bụ nke ihe nyocha.

Nchekwa na njikwa na-enweghị ikwu karịa ihe akaebe

Methylene blue dị mfe ijikwa karịa ethidium bromide, ma ọ bụghị ihe na-enweghị ihe ize ndụ. Akwụkwọ data nchekwa MilliporeSigma nke dị ugbu a na-ekewa ihe agba ahụ dịka nsí siri ike mgbe e loro ya, Category 4, nke na-emerụ ahụ ma e loo ya. A ga-ekpofu ya site n’ụzọ mkpofu a kwadoro, dịka SDS methylene blue nke Sigma-Aldrich si kwuo. Ethidium bromide nwere ịdọ aka ná ntị siri ike karịa banyere imebi mkpụrụ ndụ ihe nketa, gụnyere mmetụta a na-enyo na ọ nwere na sel ọmụmụ na SDS ethidium bromide nke Sigma-Aldrich. A na-ekewakarị jel na mmiri ngwakọta ya dịka mkpofu kemikal dị ize ndụ, dị ka e kwuru na akwụkwọ nduzi ihe agba asid nukleik nke Thermo Fisher. Soro SDS na iwu ụlọ ọrụ maka ha abụọ. Debe ihe agba akọrọ n’ime ihe emechiri nke ọma, mee ka ọ nọgide kpọrọ nkụ; jiri ihe agba a kwadebere rụọ ọrụ ọzọ naanị dịka usoro si kwere; debe membran a gbara agba ka ọ kpọrọ nkụ n’etiti mpempe akwụkwọ nzacha; ma see foto jel tupu ahịrị ndị ahụ agbasasịa.

Cheta ahịrịokwu a maka tebụl ọrụ. Jel na-anwale ma a pụrụ ịhụ ihe mgbe e tinyere ya n’ogo dị elu n’okpuru ìhè ọcha. Membran na-anwale mbufe na ihe e tinyere tupu ihe nyocha arụ ọrụ nchọpụta dị elu. Otu ihe agba na-arụ ọrụ abụọ ahụ, nwere ikike nchọpụta na-adịghị elu, njikọ a pụrụ ịtụgharị azụ, na usoro ọrụ a ga-esoro n’usoro siri ike.