Ịtụ mmetụta methylene blue na mitochondria: oksijin, ATP, na ọdịiche ike eletrik gafee akpụkpọ

Ka e were na ụlọ nyocha tinyere methylene blue na mitochondria iku ume ha nwere nsogbu, wee hụ oriri oksijin ka ọ na-arị elu. Ahịrịokwu mmadụ nwere ike ide ozugbo bụ na agba ahụ weghachiri ọrụ mitochondria. Ahịrịokwu ahụ nwere ike ịbụ nke na-ezighị ezi. Ọsọ eruba oksijin, mmepụta ATP, na ọdịiche ike eletrik gafee akpụkpọ bụ echiche atọ dị iche iche. Ha na-arụ n'otu akụkụ sel dịka idebe akwụkwọ ndabere, imekọrịta faịlụ, na ịkekọrịta faịlụ si eji otu nchekwa igwe ojii: ha nwere njikọ, ma iwu dị iche iche na-achị ha. Ọ bụrụ na e were otu dịka ibe ya, nkọwa nsonaazụ ga-ezighị ezi, ọbụna mgbe usoro e ji tụọ ihe ọ bụla ziri ezi.

Methylene blue na-eme ka mgbagwoju anya a dị mfe ime n'ihi na ọ na-ekere òkè na usoro a na-atụ. Ọ bụ ihe na-agbagharị n'etiti ọnọdụ redox, na-anabata elektrọn n'akụkụ mbụ nke usoro ma na-enye ha n'akụkụ na-esote; ọ bụkwa ion chajị dị mma nke nwere mmasị n'abụba ma na-agbakọta na mitochondria nwere ike; ọ bụkwa ihe na-acha anụnụ anụnụ nke ukwuu nke na-amịkọrọ ma na-ewepụta ìhè n'otu mpaghara ogologo ebili mmiri nke ihe nyocha a na-ejikarị. Otu ọgụgụ naanị enweghị ike ịkọwa ihe ndị a niile. Usoro a pụrụ ịdabere na ya, nke a hụrụ n'ọmụmụ mitochondria ndị Budapest, bụ ịtụ ọsọ eruba oksijin tinyere ọsọ mmepụta ATP tinyere ọdịiche ike eletrik gafee akpụkpọ tinyere ntọhapụ hydrogen peroxide, na-eji nnwale njikwa dabara kpọmkwem n'agba ahụ n'ọkwa ọ bụla.

Ntụ iku ume na-atụ ọsọ eruba oksijin, ọ bụghị ike a na-emepụta

Ntụ iku ume nwere nkọwa dị elu, ma e ji Oroboros Oxygraph ma ọ bụ Seahorse extracellular flux analyzer mee ya, na-akọ otu ihe: ọsọ a na-eji eme reduction nke oksijin. Ọ naghị akọ ọnụọgụ proton a kwagharịrị n'otu elektrọn, ókè ọdịiche ahụ e chekwara, ma ọ bụ ma ATP synthase jiri ya rụọ ọrụ.

Okwu ndị e ji akọwa ihe dị mkpa. Na mitochondria e kewapụrụ, itinye ihe e ji arụ ọrụ na-enweghị ADP na-enye iku ume ntapu, itinye ihe e ji arụ ọrụ na ADP zuru iji mejuo usoro ahụ na-enye ikike fosforileshọn site n'oksideshọn, ịgbakwunye ihe na-ekewapụ njikọ ike n'ogo na-abawanye na-enye ikike mbufe elektrọn kacha elu. N'ime sel zuru oke, ihe ndị kwekọrọ na ndị a na Seahorse bụ iku ume ntọala, iku ume jikọtara na ATP nke oligomycin na-egbochi, ntapu proton, iku ume kacha elu nke FCCP na-egosi, na oriri oksijin na-abụghị nke mitochondria nke rotenone tinyere antimycin anaghị egbochi. Ịkpọ nsonaazụ Seahorse State 3 na State 4 na-enye ha nkọwa kpọmkwem karịa nke ụdị ihe a kwadebere nwere ike ịkwado, dịka usoro Agilent Mito Stress Test na-eme ka o doo anya.

Methylene blue na-emebi njikọ mmadụ na-atụ anya n'etiti oksijin ka ukwuu na ike ka ukwuu. Na mitochondria ụbụrụ guinea pig e kewapụrụ, agba dị na 100 nM ruo 1 uM mụbara oriri oksijin n'ọnọdụ izu ike mgbe e ji glutamate tinyere malate, succinate, na alpha-glycerophosphate rụọ ọrụ, nke mmụba ya na alpha-glycerophosphate dị ihe dị ka 64 pasent. Ma iku ume ADP kpaliri na mitochondria dị mma agbanweghị nke ukwuu, dịka ọmụmụ mitochondria ụbụrụ e kewapụrụ si kwuo. N'ihi na ntapu rịrị elu ebe ọsọ eruba nke ADP kpaliri agbanweghị, nha njikwa iku ume a gbakọrọ na-ada. Ọdịda ahụ apụtaghị na agba ahụ mebiri mitochondria. Ọ pụtara na agba ahụ gbakwunyere okirikiri redox na-eri oksijin n'elu iku ume nkịtị. Nnwale oriri oksijin nke methylene blue nke na-akọ naanị mmụba ahụ atụla mmeghachi omume kemịkal dị adị, ma ọ kwughị ihe ọ bụla banyere ichekwa ike.

Nnwale iweghachi ọrụ na-egosi otu ọdịiche ahụ n'ogo ka ukwuu. Mgbe e gbochiri Complex I, ọsọ eruba oksijin laghachiri ihe dị ka okpukpu atọ ebe mmepụta ATP laghachiri naanị ihe dị ka okpukpu 1.5. Oksijin ka ukwuu rutere na elektrọd. Nke nta n'ime ya nyeere mmepụta ATP aka. Nkwupụta ọ bụla na fosforileshọn site n'oksideshọn ka mma chọrọ ka a tụlekwa akụkụ ATP, ọ kacha mma ka e gosipụta ya dịka nha ATP n'otu oksijin, ma kwuo usoro e ji kọwaa ọnụọgụ dị n'okpuru nha ahụ.

Nnwale ATP na-atụ ọsọ mmepụta, nke ngụkọta ATP dị adị enweghị ike ịnọchi anya ya

Nnwale ATP na-aza ajụjụ ọzọ: ókè ATP a na-emepụta n'otu oge. Ọgụgụ a na-esochi mgbanwe ka oge na-aga, ma ọ bụ ìhè luciferase nke firefly a na-esochi ruo ọtụtụ nkeji ma ọ bụ nnwale enzym jikọtara hexokinase na glucose-6-phosphate dehydrogenase nke a na-agụ na 340 nm, na-enye ọsọ mmepụta. Otu ntụ ngụkọta ATP n'oge njedebe na-enye ókè ATP dị adị, nke na-egosipụta mmepụta wepụ oriri, ma naanị ya anaghị agwa gị ọtụtụ ihe banyere fosforileshọn site n'oksideshọn.

Ndị otu Budapest jiri usoro enzym jikọtara ọnụ mgbe e gbochiri adenylate kinase, wee chọpụta na methylene blue na 1 ruo 2 uM mụbara mmepụta ATP ntakịrị ma n'ụzọ nwere mkpa na ọnụ ọgụgụ, n'ime mitochondria e ji rotenone na ndị e ji antimycin mee ihe. Nke ahụ bụ iweghachi ọrụ n'ezie, ma ọ bụ naanị akụkụ ụfọdụ ka e weghachiri. Ọmụmụ nsi TEGDMA nwetara ụdị azịza ahụ n'ụdị ihe nyocha ọzọ: 5 mM monomer ezé TEGDMA wedara iku ume jikọtara na Complex I site n'ihe dị ka 286 ruo 28 nkeji eruba, ebe 2 uM agba weghachiri ya ruo ihe dị ka 86.

Nnwale njikwa abụọ bụ ihe a na-apụghị ịhapụ mgbe a na-eji ihe redox nwere agba. Nke mbụ, jiri oligomycin chọpụta ókè mmepụta ATP a tụrụ dabere na ATP synthase. Nke abụọ, mee nnwale mgbake nke ATP a gbakwunyere n'ebe sel na-adịghị, jiri ATP nke a maara ókè ya tinyere ngwakọta ihe nnwale zuru ezu tinyere kpọmkwem ọkwa agba ndị e ji mee nnwale, ma ọ dịkarịa ala 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM, na 2 uM. Agba ahụ nwere ike ịmịkọrọ ìhè a na-ewepụta, gbochie enzym na-enye akara ọgụgụ, ma ọ bụ gbanwee mmeghachi omume redox nke ihe nnwale. Nduzi izugbe maka nnwale luciferase na-atụ aro nnwale biokemịkal ọzọ iji chọpụta kpọmkwem ụdị nnyonye anya a. Echela na 1 uM enweghị nsonaazụ ụgha naanị n'ihi na mbelata ìhè na-akawanye njọ n'ọkwa dị elu.

Ihe nyocha ọdịiche ike eletrik gafee akpụkpọ na-atụ nkesa agba, ọ bụghị ọsọ eruba

Safranine O, TMRM na TMRE, rhodamine 123, na JC-1 bụcha ion chajị dị mma nke nwere ike ịgafe akpụkpọ. Ha na-agbakọta n'ime matriks nwere chajị na-adịghị mma dịka nguzozi eletrọkemịkal si dị, ya mere ngụkọta ìhè fluorescence na-egosi ọdịiche ike eletrik n'ụzọ na-apụtaghị kpọmkwem, site n'ebe ihe nyocha ahụ nọ. Ọ dịghị nke ọ bụla n'ime ha na-atụ ATP ma ọ bụ ọsọ eruba elektrọn.

Ihe nyocha ọ bụla nwere ụdị nkwadebe kacha dabara ya. Safranine O dabara na mitochondria e kewapụrụ na sel e mere ka akpụkpọ ha nwee oghere, na-abụkarị ihe dị nso na 2 uM, na mkpali ìhè nso na 495 nm na mwepụta ìhè nso na 585 nm. Ọ na-arụ ọrụ n'ọnọdụ mbelata ìhè ebe ịbanye ya na-agbanwe ngụkọta fluorescence. TMRM na TMRE dabara na sel zuru oke mgbe e tinyere ha n'ogo nanomolar dị ala n'ọnọdụ na-enweghị mbelata ìhè, ebe ọdịda ọdịiche ike eletrik na-ahapụ agba ka ọ pụta, ìhè fluorescence mitochondria wee belata; mgbe agba dị ukwuu, ntụziaka akara ahụ nwere ike ịtụgharị n'ihi mbelata ìhè nke agba na-eme n'onwe ya. JC-1 na-enye nha akwụkwọ ndụ akwụkwọ ndụ na uhie nke dị mfe iji, ma ọ dabere na ókè agba e tinyere na ngụkọta mitochondria, nke na-eme ka ọ ghara ịdị mma maka ọrụ ntụ ọnụọgụ dịka TMRM a na-achịkwa nke ọma. A chịkọtara uru na ọghọm ndị a n'otu nyocha ihe nyocha ọdịiche ike eletrik gafee akpụkpọ mitochondria a na-ejikarị.

Methylene blue na-akpaghasị ntụ ìhè n'ọkwa ndị a na-eji arụ ọrụ kpọmkwem. Mpaghara ọ na-amịkọrọ ìhè nso na 600 ruo 665 nm na mpaghara ìhè uhie ihe nyocha na-ewepụta na-adakọ, ya mere mmetụta nzacha ime, mbelata ìhè, na ịmịkọrọ ìhè mkpali bụcha ihe nwere ike ime. Agba ahụ bụkwa ion chajị dị mma nke abụọ nwere mmasị n'abụba, nke nkesa nke ya na-agbanwe dịka ọdịiche ike eletrik a na-atụ si agbanwe. Ihe nchebe bụ iji ihe nyocha karịa otu na nnwale enweghị ihe a na-enyocha: ihe nyocha naanị, agba naanị, ihe nyocha tinyere ọkwa agba ọ bụla, iwepụ ọdịiche ike eletrik kpamkpam site na FCCP dịka ebe ntụaka efu, na, ọ bụrụ na o kwe omume, ihe nyocha nke abụọ nwere njirimara ìhè dị iche. Ọmụmụ ịgafe Complex III n'ụzọ ọzọ gosiri ihe atụ nke usoro ahụ site n'ịmegharị nnwale iweghachi ọdịiche ike eletrik gafee akpụkpọ na safranine O na TMRM mgbe antimycin na myxothiazol gbochiri ọrụ, wee nweta otu ụdị mgbake ahụ. Otu ihe na-enye akara ìhè bụ ntụnye. Ihe abụọ nọọrọ onwe ha na-enye akara bụ ihe akaebe.

Nkwadebe atọ, ajụjụ atọ dị iche iche

Mitochondria e kewapụrụ, sel e mere ka akpụkpọ ha nwee oghere, na sel zuru oke abụghị nhọrọ mmetụta dị iche iche a pụrụ ịgbanwe ibe ha n'otu nnwale. Ha bụ echiche dị iche iche nwere ụkpụrụ ọrụ dị iche iche.

Mitochondria e kewapụrụ na-echekwa agbụ mbufe elektrọn, akpụkpọ ime, na usoro ọrụ matriks, ebe e wepụrụ akpụkpọ sel, cytosol, na nhazi netwọkụ. Mwepụ ahụ bụ ihe e bu n'uche: a na-akọwa kpọmkwem ihe e ji arụ ọrụ, ADP, ihe mgbochi, na ọkwa agba, ka e nwee ike ịchọpụta ụzọ ọrụ metụtara. Ihe ọ na-efu bụ enweghị nnyefe ihe e ji arụ ọrụ n'ụzọ eke, nnyefe akara, na mkpa ike.

Sel e mere ka akpụkpọ ha nwee oghere na-edebe mitochondria n'ime ọtụtụ akụkụ nhazi sel ha, ma na-ahapụ ihe e ji arụ ọrụ sitere n'èzí na ADP ka ha gafee akpụkpọ sel e meghere. Ha bụ ihe kwesịrị ekwesị maka ịchọpụta ntụpọ n'ụzọ ọrụ nke ihe e ji arụ ọrụ n'ime ọnọdụ sel. Ime ka akpụkpọ nwee oghere karịa ókè na-emebi akpụkpọ mpụta, njikwa sitere na cytosol na-asachapụkwa.

Sel zuru oke na-echekwa ihe niile: ihe mgbochi akpụkpọ sel, ihe na-eme reduction n'ime cytosol, mbufe ihe e ji arụ ọrụ sitere n'ime sel, netwọkụ mitochondria, na mkpa ATP. Ha kacha nso na ọnọdụ ọrụ anụ ahụ, ma kacha anya n'ịkọwa usoro ọrụ kpọmkwem, n'ihi na ịbanye agba, reduction ya, na idobe ya n'akụkụ ụfọdụ na-emetụta ókè agba rutere mitochondria n'ezie.

Ọmụmụ TEGDMA ji ụma jiri ọkwa atọ ahụ niile: mitochondria ụbụrụ e kewapụrụ maka iweghachi oksideshọn na ọdịiche ike eletrik site n'agba, sel isi mmalite nke anụ ime ezé e mere ka akpụkpọ ha nwee oghere karịsịa iji chọpụta na ntụpọ ahụ dị n'oksideshọn ihe e ji arụ ọrụ jikọtara na Complex I, na sel isi mmalite zuru oke maka mmetụta mkpokọta nke 2 uM agba n'oriri oksijin e wedara n'ọnọdụ ọrụ anụ ahụ. Maka ndị na-agụ na-atụnyere ọgụgụ mitochondria n'ụdị nkwadebe dị iche iche, nkọwa ibe ya banyere otú methylene blue si ebugharị elektrọn n'agbụ iku ume na-enye ntọala banyere ụzọ ọrụ ahụ, nduzi ịgụ ọmụmụ iku ume methylene blue na-akọwakwa echiche dị n'azụ ọkwa e ji nnwale na ihe mgbochi.

Nnwale njikwa agba na-arụ ọrụ redox chọrọ

Ihe na-agbagharị n'etiti ọnọdụ redox chọrọ ndepụta nnwale njikwa dị ogologo karịa ihe mgbochi nkịtị, n'ihi na mmeghachi omume kemịkal nke agba naanị nwere ike ịdị ka ọrụ ndụ.

Maka ntụ iku ume, jiri ụlọ ntụ nwere naanị ngwọta nchekwa pH chọpụta mgbanwe ọgụgụ n'onwe ya, jiri ụlọ ntụ nwere ngwọta nchekwa pH na agba na-enweghị ihe sitere n'ihe dị ndụ, jiri agba tinyere ihe ọ bụla na-eme reduction n'èzí sel nke dị na nnwale ahụ, ma tinye rotenone na antimycin n'ikpeazụ iji kọwaa oriri oksijin na-abụghị nke mitochondria n'ime sel zuru oke. Rịba ama na agba e mere reduction na-enwetaghachi oksideshọn site n'inye oksijin elektrọn iji mepụta hydrogen peroxide. Ya mere nnwale nwere naanị agba na-enweghị ihe na-enye elektrọn na-egosi oriri oksijin n'ebe sel na-adịghị dị ka ihe dị ala karịa nke na-apụta mgbe NADH ma ọ bụ NADPH dị.

Maka hydrogen peroxide, họrọ Amplex UltraRed a haziri ntụ ya tinyere horseradish peroxidase karịa agba DCFDA na-anaghị ahọrọ kpọmkwem, jiri catalase nyochaa nsonaazụ, ma nwalee ókè nsonaazụ dabere na ìhè, n'ihi na agba ahụ bụ ihe ìhè na-akpalite mmeghachi omume ya. Ọmụmụ mitochondria ụbụrụ chọpụtara na ibu peroxide rịrị elu karịa okpukpu anọ na naanị 100 nM agba ebe iwepụ ya belatara ọsọ, na peroxide sitere kpọmkwem n'agba e mere reduction n'enweghị superoxide dị n'etiti usoro ahụ. Nkọwa nhọrọ ihe nyocha na nnwale njikwa ìhè dị n'edemede ibe ya banyere ịtụ ụdị oksijin na-arụ ọrụ mmeghachi omume na nnwale agba, a tụlekwara ajụjụ sara mbara banyere mgbe peroxide bụ akara na mgbe ọ bụ ibu n'akụkụ nguzozi redox n'ime sel na nkwupụta banyere ihe na-egbochi oksideshọn.

Maka nkwupụta banyere ụzọ ọrụ, nwalee ebe mgbochi abụọ nke Complex III: antimycin A n'ebe Qi na myxothiazol n'ebe Qo, tinyere ntụ njedebe Complex IV site na cyanide. Ọmụmụ ụbụrụ òké nke gara aga kọrọ na agba weghachiri iku ume rotenone gbochiri, ma ọ bụghị nke antimycin gbochiri, ebe ọmụmụ ụdị anụmanụ atọ nke mechara chọpụtara mgbake akụkụ ụfọdụ na ihe mgbochi abụọ ahụ na ihe akaebe nke reduction cytochrome c kpọmkwem. Were ụzọ ngafe ọzọ ahụ dịka ihe kwekọrọ na data ọhụrụ, ọ bụghị dịka ihe e kpebiela, n'ihi na ọkwa agba, ebe ihe mgbochi na-arụ ọrụ, ọnọdụ ihe e ji arụ ọrụ, na nkesa agba na-agbanwe ụzọ a na-ahụ.

Tebụl nhọrọ nnwale

Jiri tebụl a họrọ ntụ dabere n'ajụjụ ahụ, ọ bụghị ịhọrọ ajụjụ dabere na ntụ ahụ.

Nkwupụta kacha nta nke ga-eme ka mmadụ kwenye na-eji otu ọkwa agba ahụ, 100 nM, 300 nM, 1 uM, na 2 uM, tụọ ọsọ eruba oksijin n'ọnọdụ ntapu, ADP, oligomycin, na ihe na-ekewapụ njikọ ike; ọsọ mmepụta ATP; ọdịiche ike eletrik gafee akpụkpọ, ọ kacha mma site n'ihe nyocha abụọ; na ntọhapụ peroxide a haziri ntụ ya, na-eji catalase na nnwale njikwa na-enweghị sel. Kọọ otu ihe ndị ahụ jikọtara ọnụ: ọsọ eruba oksijin tinyere ọsọ ATP tinyere ATP n'otu oksijin tinyere ọdịiche ike eletrik tinyere peroxide. Otu ọnụọgụ ọ bụla n'ime ndị ahụ naanị bụ ntụ ka na-achọ ihe ọ pụtara.