Թթվածնի ռեակտիվ ձևերի չափումը մեթիլեն կապույտի փորձերում

Երկու լաբորատորիաներ կատարում են փորձեր, որոնք երկուսն էլ անվանում են մեթիլեն կապույտի հակաօքսիդանտային փորձ։ Մեկը հայտնում է, որ ներկանյութը ճնշում է թթվածնի ռեակտիվ ձևերը։ Մյուսը հայտնում է, որ այն առաջացնում է դրանք։ Երկուսն էլ ներկայացնում են դոզա–արձագանք հստակ կորեր։ Երկուսն էլ անկեղծ են։ Տարբերությունը խարդախության կամ անիրազեկության մեջ չէ։ Պատճառն այն է, որ երկու խմբերը տարբեր լուսավորման պայմաններում չափել են տարբեր բաներ՝ տարբեր հարցերի պատասխանող զոնդերով, ապա երկու պատասխաններն էլ նկարագրել նույն բառով՝ ROS։

Մեթիլեն կապույտը դժվար է ճշգրիտ չափել հենց այն պատճառով, որ այն մասնակցում է այն քիմիական գործընթացներին, որոնք պետք է դիտարկեր։ Մթության մեջ այն էլեկտրոններ է տեղափոխում դոնորների և ակցեպտորների միջև ու վերադառնում իր սկզբնական ձևին՝ պատրաստ կրկին անցնելու նույն ցիկլը։ Լույսի ներքո այն դառնում է լուսազգայունացուցիչ՝ անցնելով գրգռված տրիպլետային վիճակի, որից կարող է էներգիա փոխանցել թթվածնին՝ առաջացնելով սինգլետային թթվածին, կամ փոխանցել էլեկտրոններ՝ առաջացնելով ռադիկալներ և ջրածնի պերօքսիդ։ Այդ համակարգում տեղադրված ցանկացած զոնդ կարող է օքսիդացվել, վերականգնվել, գունազրկվել կամ օպտիկապես քողարկվել հենց ներկանյութի կողմից։ Ուստի ROS-ի ցանկացած ցուցմունքի դեպքում առաջին հարցը երբեք այն չէ, թե որքան է թիվը։ Հարցն այն է, թե անալիզն իրականում ինչ է հայտնաբերում, և ներկանյութն ինչպես է ազդում անալիզի վրա։

Amplex Red․ ջրածնի պերօքսիդի տրամաչափված անալիզ

Մեթիլեն կապույտի և Amplex Red-ի համակցությունն այս գրականության մեջ ամենահիմնավորված զուգակցումն է, եթե փորձը ճիշտ է կազմակերպված։ Քիմիական գործընթացը սպեցիֆիկ է․ ծովաբողկի պերօքսիդազն օգտագործում է ջրածնի պերօքսիդը՝ Amplex սուբստրատը ֆլուորեսցենտ արտադրանքի՝ ռեզորուֆինի օքսիդացնելու համար, մոտավորապես մեկին մեկ ստեքիոմետրիկ հարաբերակցությամբ։ Նմուշի պերօքսիդը դետեկտորում վերածվում է ֆլուորեսցենտ ազդանշանի։ ROS-ի ընդունված խմբի որևէ այլ անդամ ուղղակիորեն չի առաջացնում այդ ռեակցիան։

Վճռորոշ առավելությունը տրամաչափումն է։ Բարեխիղճ հետազոտողը չափում է պերօքսիդի հայտնի ստանդարտները նույն բուֆերում, պերօքսիդազի և սուբստրատի նույն կոնցենտրացիաներով, նույն ինկուբացիոն ժամանակով և նույն օպտիկական կարգավորումներով, ապա նմուշների ցուցմունքները համեմատում այդ կորի հետ։ Ուղեղի մեկուսացված միտոքոնդրիաների հետազոտությունում, որի վրա հիմնվում է այս մեթոդը, հեղինակները հենց այդպես են վարվել՝ յուրաքանչյուր փորձի վերջում ավելացնելով պերօքսիդի հայտնի քանակներ։ Արդյունքները ներկայացված են որպես արագություններ՝ պիկոմոլներով մեկ րոպեում մեկ միլիգրամ սպիտակուցի հաշվով, այլ ոչ թե ֆլուորեսցենցիայի պայմանական միավորներով։ Հենց սա է լուսարձակումը դարձնում չափում։

Այդ հետազոտության երեք մանրամասն արժե ընդօրինակել։ Նախ՝ հեղինակները ազդանշանը ստուգել են կատալազով, որը քայքայում է պերօքսիդը։ Մեթիլեն կապույտով պայմանավորված ֆլուորեսցենցիայի աճը դադարել է կատալազն ավելացնելուց հետո՝ հաստատելով, որ ազդանշանը պայմանավորված էր պերօքսիդով, ոչ թե օպտիկական արտեֆակտով։ Երկրորդ՝ նրանք անմիջականորեն ստուգել են լուսավորման ազդեցությունը՝ փականով ընդհատելով գրգռող ճառագայթը, որպեսզի նմուշները ստանան սովորական լուսային դոզայի մեկ ութերորդը։ Ազդանշանը նվազել է ընդամենը ինը տոկոսով։ Նրանց արձանագրած պերօքսիդի ավելի քան իննսուն տոկոսը կախված չէր չափման համար օգտագործվող լույսից։ Երրորդ՝ նրանք էլեկտրոդով առանձին չափել են պերօքսիդի հեռացումը և պարզել, որ ներկանյութը և՛ ավելացնում է դրա առաջացումը, և՛ դանդաղեցնում հեռացումը։ Միայն ֆլուորեսցենցիայի զուտ արդյունքը ցույց տվող զոնդը կխառներ այդ երկու ազդեցությունները։

Անալիզը, այնուամենայնիվ, ունի խափանման հնարավորություններ, որոնցից մի քանիսը դրսևորվում են մեթիլեն կապույտի դեպքում։ Ներկանյութը լայնորեն կլանում է նույն կարմիր սպեկտրային տիրույթում, որտեղ ռեզորուֆինը ճառագայթում է, ուստի ներկանյութի բարձր կոնցենտրացիաների դեպքում նմուշը ներքին ֆիլտրի ազդեցությունների պատճառով կարող է քողարկել սեփական ազդանշանը։ Հետևաբար ստանդարտներում ներկանյութի կոնցենտրացիան պետք է լինի նույնը, ինչ նմուշներում։ Amplex Red-ը կարող է նաև ինքնուրույն ֆոտոօքսիդացվել, իսկ դրա արտադրանքը՝ ռեզորուֆինը, կարող է մտնել ֆոտոռեդօքս ցիկլի մեջ՝ առաջացնելով սուպերօքսիդ և պերօքսիդ։ Սա հատկապես կարևոր է, երբ փորձի ընթացքում լուսավորվում է նաև լուսազգայունացուցիչը։ Գործնական լուծումը նախ մեթիլեն կապույտի նմուշները ճառագայթելն է, ապա դրանց առանձին բաժնեմասերը մթության մեջ Amplex ռեագենտներով վերլուծելը՝ ներկանյութն ու զոնդը միասին լուսավորելու փոխարեն։ Վերջապես, սուպերօքսիդ դիսմուտազը պարզապես չի ճնշում Amplex-ի ազդանշանը․ սուպերօքսիդը պերօքսիդի վերածելը կարող է այն բարձրացնել։ Ֆլուորեսցենցիան բարձրացնող SOD-ով ստուգիչ փորձը չի ձախողվել։ Այն ցույց է տվել, որ սուպերօքսիդը մասնակցում է նախորդող փուլին։

DCFDA․ օքսիդացման ոչ սպեցիֆիկ ցուցիչ

Մեթիլեն կապույտի և DCFDA-ի զուգակցումը շփոթության մեծ մասի աղբյուրն է։ DCFH-DA-ն բջջի մեջ ներմուծվող նախանյութ է։ Բջջի ներսում էսթերազները հեռացնում են դրա ացետատային խմբերը՝ թողնելով չֆլուորեսցենտ DCFH, իսկ DCFH-ի օքսիդացումից ստացվում է ֆլուորեսցենտ DCF։ Այն օքսիդացնող նյութերի ցանկը երկար է՝ հիդրօքսիլային ռադիկալներ, պերօքսիդազի և հեմի միջանկյալ միացություններ, ազոտի երկօքսիդ, հիպոքլորային թթու և պերօքսինիտրիտից առաջացած ռադիկալներ։ Միայն ջրածնի պերօքսիդն այն ուղղակիորեն չի օքսիդացնում գործնականորեն օգտակար արագությամբ․ պերօքսիդից կախված ֆլուորեսցենցիայի համար սովորաբար անհրաժեշտ է գործընթացում երկաթի, հեմային սպիտակուցների կամ պերօքսիդազային քիմիայի մասնակցությունը։

Քննադատությունը, որին պետք է հղում անի մեթոդների յուրաքանչյուր բաժին, բխում է Կալյանարամանի և գործընկերների՝ DCFH-ը որպես զոնդ վերլուծելու աշխատանքից։ Ինչպես ամփոփված է ուղեղի միտոքոնդրիաների հետազոտությունում, որն այդ պատճառով մերժել է DCFDA-ն, նրանք ցույց են տվել, որ զոնդը դանդաղ է արձագանքում, ունի չբնութագրված ստեքիոմետրիա, չունի վավեր տրամաչափում և արձագանքում է նաև ROS չհանդիսացող միացությունների հետ։ Զոնդը նաև ուժեղացնում է այն, ինչ չափում է․ DCFH-ի մեկէլեկտրոնային օքսիդացումն առաջացնում է DCF ռադիկալ, որը թթվածնի հետ արձագանքելով առաջացնում է սուպերօքսիդ, իսկ վերջինիս դիսմուտացիայից ստացվում է լրացուցիչ պերօքսիդ։ Չափումն ինքն էլ մասամբ առաջացնում է այն քիմիական գործընթացը, որի մասին հաղորդում է։

Այս ամենը DCFDA-ն անօգուտ չի դարձնում։ Այն դարձնում է նախնական ստուգման, ոչ թե նույնականացման միջոց։ DCF-ի ֆլուորեսցենցիայի աճը նշանակում է, որ մեծացել է օքսիդանտներից կախված զոնդի օքսիդացումը։ Դա չի նշանակում, որ պերօքսիդն ավելացել է, և առավել ևս չի նշանակում, որ ավելացել է ընդհանուր ROS-ը՝ մի մեծություն, որը ոչ մի առանձին զոնդ չի չափում։ Մեթիլեն կապույտի ավելի վաղ աշխատանքները, որոնք հիմնվում էին DCF-ի օքսիդացման վրա մեկ միկրոմոլարից բարձր կոնցենտրացիաներում, հաղորդում էին պրոօքսիդանտային ազդեցությունների մասին, մինչդեռ նույն ժամանակաշրջանի այլ համակարգերում հաղորդվում էր պերօքսիդով հարուցված բջջային մահից պաշտպանության մասին։ Երկու դիտարկումներն էլ կարող են ճշմարիտ լինել նույն ներկանյութի համար՝ տարբեր ռեդօքս պայմաններում, իսկ միայն DCF-ի արդյունքը չի կարող ասել, թե որ օքսիդանտն է պայմանավորել ազդանշանը։ Ուղեղի միտոքոնդրիաների ավելի վաղ աշխատանքի կարևորությունն այն է, որ այն այս նախնական ստուգումը փոխարինել է պերօքսիդի տրամաչափված չափմամբ և անմիջապես հայտնաբերել բեռնվածությունը․ նույնիսկ հարյուր նանոմոլար ներկանյութը մի քանի անգամ ավելացրել է պերօքսիդի արտազատումը փորձարկված բոլոր սուբստրատների և շնչառական վիճակների դեպքում։

DCFDA-ն ունի ևս մեկ՝ մեթիլեն կապույտին հատուկ թակարդ։ Ներկանյութն ինտենսիվ գունավորված է և ռեդօքս ակտիվ, ուստի կարող է գունազրկել ֆլուորեսցենտ նյութը, մարել ճառագայթումը կամ օքսիդացնել զոնդը՝ բջջային ROS-ից անկախ։ Ներկանյութով և զոնդով, բայց առանց բջիջների ստուգիչ փորձը կամընտիր լրացում չէ։ Դա այն փորձն է, որը ցույց է տալիս՝ արդյոք ներկանյութը փոխազդում է զոնդի հետ։

Սպինային որսում և թթվածնի սպառում․ ինքնություն և հոսք

Մինչ ֆլուորեսցենտ զոնդերը ցույց են տալիս, որ օքսիդացվող ինչ-որ բան է հայտնվել, սպինային թակարդներով էլեկտրոնային սպինային ռեզոնանսն ավելի մոտ է պատասխանում այն հարցին, թե դա ինչ էր։ Մեթիլեն կապույտի ֆոտոքիմիայի դասական հետազոտությունում կիրառվել է ESR՝ ներկանյութից, ասկորբատից և լույսից առաջացող ասկորբատային ռադիկալը հայտնաբերելու համար։ Այնուհետև թթվածնի սպառման փորձերով ցույց է տրվել պերօքսիդի առաջացումը, իսկ սպինային որսման փորձերով՝ երկաթով կատալիզվող հիդրօքսիլային ռադիկալի առաջացումը։ Յուրաքանչյուր տեխնիկա պատասխանել է այն հարցին, որին մյուսները չէին կարող․ ESR-ը որոշել է ռադիկալի ինքնությունը, թթվածնի սպառումը՝ ռեակցիայի հոսքը՝ անկախ որևէ ֆլուորեսցենտ զոնդից, իսկ դրանց համակցությունը ցույց է տվել, որ նույն լուսավորված համակարգում գործում են և՛ սինգլետային թթվածնի, և՛ ռադիկալային ուղիները։

1984 թվականի այդ արդյունքը մինչ օրս հնչում է որպես նախազգուշացում։ Լուսավորման և վերականգնող նյութի առկայության դեպքում ներկանյութն առաջացրել է պերօքսիդ, իսկ երկաթի առկայության դեպքում համակարգն արտադրել է հիդրօքսիլային ռադիկալը՝ այս շարքի ամենառեակտիվ մասնիկը։ Հեղինակները դա կապել են աչքում առկա ասկորբատի հետ և կասկածի տակ դրել ակնաբուժական կիրառման նկատմամբ անփույթ մոտեցումը։ Ժամանակակից ընթերցողները պետք է ուշադրություն դարձնեն պայմաններին՝ լույս, վերականգնիչ և երկաթ։ Դրանցից որևէ մեկը հեռացնելիս ուղին թուլանում կամ անհետանում է։

Թթվածնային էլեկտրոդների արժեքն այլ է։ Կլարկի տիպի էլեկտրոդը չափում է թթվածնի զուտ սպառումը՝ հաստատելով, որ ներկանյութով պայմանավորված ռեդօքս գործընթացները սպառում են մոլեկուլային թթվածին, և տալիս է կինետիկ տվյալներ, որոնք ֆլուորեսցենցիայի որևէ արտեֆակտ չի կարող կեղծել։ Այն չի նույնականացնում արտադրանքը։ Պերօքսիդի, սուպերօքսիդի և ջրի առաջացումը, ինչպես նաև սինգլետային թթվածնի քայքայումը՝ բոլորը սպառում են թթվածին։ Առանց ինքնության հոսքը նույնքան թերի է, որքան առանց հոսքի ինքնությունը։ Ահա թե ինչու հիմնավոր աշխատանքներում էլեկտրոդը զուգակցվում է պերօքսիդի տրամաչափված անալիզի կամ թակարդի հետ։

Ինչու են հակաօքսիդանտային արդյունքները հակասում

Եթե երեք տեսակի ցուցմունքները դիտարկենք կողք կողքի, մեթիլեն կապույտի մասին գրականության թվացյալ հակասությունները կբացատրվեն մեթոդների տարբերություններով և երեք կենսաբանական փաստերով։

Նախ՝ ներկանյութը և՛ էլեկտրոնների փոխադրիչ է, և՛ պերօքսիդի աղբյուր։ Էլեկտրոնները շնչառական այն տեղամասերից շեղելով, որտեղ թթվածինն այլապես կվերածվեր սուպերօքսիդի, այն կարող է նվազեցնել ROS-ի մի տեսակը, մինչդեռ դրա վերականգնված ձևն ուղղակիորեն վերականգնում է թթվածինը մինչև պերօքսիդ՝ ավելացնելով մեկ այլ տեսակը։ Ուստի միտոքոնդրիալ ռեդօքս քիմիան և դրա շրջանցող դերն ուսումնասիրող լաբորատորիան պետք է ակնկալի զոնդից կախված պատասխաններ․ նույն կյուվետում սուպերօքսիդի նկատմամբ զգայուն ցուցմունքը նվազում է, իսկ պերօքսիդի ցուցմունքը՝ աճում։

Երկրորդ՝ ցածր դոզաներով պերօքսիդը ազդանշան է, ոչ թե միայն վնաս։ Մկների ուղեղի միտոքոնդրիաների հետազոտությունը, որը հաջորդել է ավելի վաղ աշխատանքին, հայտնաբերել է պերօքսիդի առաջացում ընդամենը հիսուն նանոմոլար ներկանյութից՝ առանց միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի վնասումների թերապևտիկ մակարդակներում։ Նախնական մշակման դեպքում նաև դիտվել է պաշտպանություն ռոտենոնով հարուցված վնասումներից։ Միայն հարյուր միկրոմոլարի դեպքում՝ թերապևտիկ տիրույթից շատ բարձր, ներկանյութը վնասել է ԴՆԹ-ի ընտրված հատվածներ, իսկ կարմիր լույսի և քսան միկրոմոլար ներկանյութի համակցությունն առաջացրել է սինգլետային թթվածին, որը վնասել է բոլոր փորձարկված հատվածները։ Առաջարկվող մեխանիզմը հորմետիկ է․ պերօքսիդի մեղմ առաջացումն ակտիվացնում է Nrf2-ի հետ կապված հակաօքսիդանտային պաշտպանությունը և միտոքոնդրիալ կենսագոյացումը, ուստի կարճաժամկետ պրոօքսիդանտային ցուցմունքը նախորդում է ավելի երկարաժամկետ հակաօքսիդանտային արդյունքին։ Մեկ ժամ անց և մեկ օր անց ընթերցված անալիզները կարող են չհամընկնել, քանի որ դրանց միջև կենսաբանական գործընթացները փոխվել են։

Երրորդ՝ լույսը որոշում է նույնիսկ այն, թե որ մոլեկուլն է առկա։ Լուսավորումը դեմեթիլացնում է ներկանյութը՝ այն փոխակերպելով Azure B-ի և հարակից արտադրանքների, իսկ անոթի վերևում գտնվող մանրադիտակի լամպն արդեն բավարար է այն լուսազգայունացնելու համար։ Մթության և լուսավորման պայմաններում կատարվող փորձերը տարբեր փորձեր են, և ցանկացած արձանագրության լուսավորման ու ներկանյութի հետ աշխատանքի ստուգիչ փորձերի բաժինը պետք է հենց այդպես վերաբերվի դրանց։

Ստուգիչ փորձերի նվազագույն հավաքածու և ցանկացած պնդում մեկնաբանելու եղանակը

Ստորև բերված համեմատությունն այս հոդվածի համար կազմված սկզբնական տեղեկատու նյութն է։ Մեթիլեն կապույտի ROS-ի որևէ արդյունք ընդունելուց առաջ ստուգեք, թե հեղինակները որ տողն են լրացրել և որը՝ բաց թողել։

Սրանից բխում է մեկնաբանման գործնական կանոն։ Պերօքսիդազով, տրամաչափված և կատալազով ստուգված Amplex-ը պերօքսիդի մասին ապացույց է։ DCFDA-ն զոնդի ոչ սպեցիֆիկ օքսիդացման մասին ապացույց է և ոչ ավելին։ Ռադիկալների կլանիչներով ստուգիչ փորձերով սպինային որսումը ռադիկալի ինքնության մասին ապացույց է։ Թթվածնի սպառումը հոսքի մասին ապացույց է։ Նախադասությունը, որը պնդում է ավելին, քան իր անալիզը կարող է հիմնավորել, որքան էլ վստահ գրված լինի, վերաբերում է զոնդին, ոչ թե ներկանյութին։ Դոզայից կախվածության և հորմետիկ տիրույթի, միտոքոնդրիալ էլեկտրոնային հոսքի, ներկված նմուշներում անալիզի խանգարումների և մանրադիտակային լուսավորման արտեֆակտների վերաբերյալ հարակից քննարկումները լրացնում են այս կետերից յուրաքանչյուրը, և դրանցից յուրաքանչյուրը մնում է ուժի մեջ, երբ իր տեղապահ հղումը փոխարինվում է։