Հոդված
Նոր մեթիլենային կապույտը և ռետիկուլոցիտների ներկումը. առանձին ներկանյութ և կենդանի բջիջների մեթոդ
Ուսանողը պատրաստվում է հաշվել ռետիկուլոցիտները, պատվիրում է մեթիլենային կապույտ, խառնում այն արյան հետ և գրեթե ոչինչ չի տեսնում։ Համակուրսեցին օգտագործում է նոր մեթիլենային կապույտ պիտակով շիշ և էրիթրոցիտների մի մասի ներսում ստանում հստակ կապույտ թելիկներ։ Առաջին ուսանողը ենթադրում է, որ երկրորդ շշի պարունակությունն ավելի թարմ է կամ ավելի խիտ։ Ո՛չ մեկը, ո՛չ մյուսը։ Այն այլ մոլեկուլ է պարունակում։
Այս ոլորտում շփոթության մեծ մասի հիմքում հենց այս հասկացական սխալն է։ Անվանումը հուշում է, թե նոր մեթիլենային կապույտը մեթիլենային կապույտի բարելավված խմբաքանակ է։ Քիմիան այլ բան է ասում։ Նոր մեթիլենային կապույտ N-ը առանձին ֆենոթիազինային ներկանյութ է՝ իր սեփական Colour Index համարով, փոխարինիչների դասավորությամբ և արյունաբանության մեջ ստանդարտացված դերով։ Երբ այս տարբերությունը պարզ է, մեթոդի մնացած կողմերը՝ ինչու բջիջները ներկման պահին պետք է կենդանի լինեն, ինչն է համարվում ռետիկուլոցիտ, ինչ տեղ ունեն Հայնցի մարմնիկները և երբ է կիրառվում բրիլիանտ կրեզիլային կապույտը, դառնում են հասկանալի։
Կարճ պատասխանը
Նոր մեթիլենային կապույտ N-ը՝ արյունաբանական ռեագենտը, սովորաբար նույնականացվում է որպես Basic Blue 24՝ նոր մեթիլենային կապույտի PubChem գրառման մեջ, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, բանաձևը՝ C18H22ClN3S։ Սովորական մեթիլենային կապույտը մեթիլթիոնինիումի քլորիդն է՝ Basic Blue 9, ըստ իր PubChem գրառման, C.I. 52015, CAS 61-73-4, բանաձևը՝ C16H18ClN3S։ Կառուցվածքային առումով նոր մեթիլենային կապույտն ունի օղակին միացած երկու մեթիլային խումբ և էթիլամինային կողմնային խմբեր այն դիրքերում, որտեղ մեթիլենային կապույտն ունի դիմեթիլամինային խմբեր։ Այդ տարբերությունը փոխում է ներկման հատկությունները։ Արյունաբանական ձեռնարկները սովորական մեթիլենային կապույտը նկարագրում են որպես ռետիկուլոցիտների համեմատաբար թույլ ներկանյութ, իսկ նոր մեթիլենային կապույտը՝ որպես ավելի ինտենսիվ և համաչափ ներկող նյութ։ Այս համեմատությունն ամփոփված է նոր մեթիլենային կապույտի մասին ScienceDirect թեմատիկ էջում։
Այո՛, նոր մեթիլենային կապույտը սուպրավիտալ ներկանյութ է։ Սուպրավիտալ ներկումը կենդանի բջիջների ներկումն է մարմնից դուրս բերելուց հետո և ֆիքսումից առաջ, ինչպես սահմանված է սուպրավիտալ ներկման սկզբունքների NCBI ակնարկում։ Թե՛ նոր մեթիլենային կապույտը, թե՛ բրիլիանտ կրեզիլային կապույտը պատկանում են այս խմբին, իսկ ռետիկուլոցիտների վերաբերյալ CLSI ստանդարտը նոր մեթիլենային կապույտը հստակ դիտարկում է որպես սուպրավիտալ ներկանյութ։ Ուսանողները երբեմն սա դասում են ֆիքսված քսուքների Ռոմանովսկու ներկման հետ նույն խմբում։ Այդ պատկերացումը այստեղ չի գործում։ Եթե նախ ֆիքսեք, մեթոդը կդադարի աշխատել։
Նման անվանումներով ներկանյութերին հետևող ընթերցողների համար մեթիլային կապույտի և մեթիլենային կապույտի համեմատությունը անդրադառնում է մեկ այլ, ավելի լայն շփոթության՝ անիոնային տրիարիլմեթանային ներկանյութի և կատիոնային ֆենոթիազինների ընտանիքի միջև։ Լաբորատոր ներկման ակնարկը սուպրավիտալ աշխատանքը ներկայացնում է ֆիքսված քսուքների մեթոդների կողքին, իսկ արյան բջիջների ձևաբանության ուղեցույցը ցույց է տալիս, թե ռետիկուլոցիտների գնահատումն ինչ տեղ ունի ավելի լայն տարբերակված հաշվարկում։
| Ռեագենտ | Քիմիական ինքնություն | C.I. / CAS | Դերը ռետիկուլոցիտների հետ աշխատանքում |
|---|---|---|---|
| Նոր մեթիլենային կապույտ N | Էթիլամինային խմբերով, օղակում դիմեթիլացված ֆենոթիազին | C.I. 52030 (Basic Blue 24); CAS 1934-16-3՝ քլորիդի համար | Ձեռքով կատարվող ստանդարտացված սուպրավիտալ ներկման նյութ, նախընտրելի համեմատական միջոց |
| Սովորական մեթիլենային կապույտ | Բիս(դիմեթիլամինո) ֆենոթիազին (մեթիլթիոնինիումի քլորիդ) | C.I. 52015 (Basic Blue 9); CAS 61-73-4 | Ռետիկուլոցիտների թույլ ներկանյութ, փոխարինող չէ |
| Բրիլիանտ կրեզիլային կապույտ | Օքսազինային ներկանյութ, բաղադրությունը տարբեր է ըստ մատակարարի | C.I. 51010; CAS 81029-05-2 կամ 10127-36-3՝ կախված աղային ձևից | Ընդունելի սուպրավիտալ ներկանյութ, պակաս համաչափ, ներդաշնակեցված համեմատական միջոց չէ |
Մի զգուշացում կատալոգների վերաբերյալ. գոյություն ունի նոր մեթիլենային կապույտի առանձին՝ ցինկի քլորիդի հետ կրկնակի աղային ձև՝ CAS 6586-05-6 համարով։ Ուստի մեթոդների բաժնում պետք է նշվեն աղային ձևը և մատակարարը, ոչ միայն տարածված անվանումը։
Ինչ է իրականում անում սուպրավիտալ ներկումը
Ռետիկուլոցիտը երիտասարդ էրիթրոցիտ է, որը կորցրել է կորիզը, բայց պահպանում է մնացորդային ռիբոսոմային ՌՆԹ։ Չներկված թաց պատրաստուկում այդ ՌՆԹ-ն անտեսանելի է։ Սուպրավիտալ ներկանյութը ներթափանցում է կենդանի բջիջ և այդ ՌՆԹ-ն նստեցնում կամ միավորում է կապույտ հատիկների ու թելիկների մեջ՝ առաջացնելով յուղային իմերսիայի տակ տեսանելի ցանցաթելային նյութը։ Հետևաբար ցանցը ներկման արդյունք է, ոչ թե նախապես ձևավորված կմախք, որը սպասում է գունավորմանը։ Ահա թե ինչու ընթացակարգի փոփոխականները՝ ներկանյութի խտությունը, բուֆերը, արյան և ներկանյութի հարաբերակցությունը, ջերմաստիճանը և ժամանակը, նույնքան կարևոր են, որքան ներկանյութի անվանումը։
Գործնական հետևանքը գործողությունների խիստ հերթականությունն է. նախ հակամակարդիչով մշակված արյունը խառնել ներկանյութի հետ, ինկուբացնել, ապա պատրաստել քսուքներ և հետազոտել դրանք չֆիքսված ու առանց հակադրման լրացուցիչ ներկման։ Ներկումից առաջ ֆիքսումը կամ թույլ թելիկները քողարկող լրացուցիչ ներկումը վերացնում են այն տեղեկությունը, որի վրա հիմնվում է հաշվարկը։
Նոր մեթիլենային կապույտով ռետիկուլոցիտների ներկման գործնական ընթացակարգ
Միասնական համընդհանուր բաղադրություն չկա, ուստի նշեք օգտագործվածը։ Փաստագրված երեք տարբերակ ցույց է տալիս կիրառվող պայմանների շրջանակը։
Բրեխերի տիպի դասական ընթացակարգում օգտագործվում է մոտ 0.5 տոկոս նոր մեթիլենային կապույտ՝ կալիումի օքսալատով, որը հավասար ծավալներով խառնվում է լավ խառնված, EDTA-ով մշակված արյան հետ և ինկուբացվում սենյակային ջերմաստիճանում մոտ 10-ից 15 րոպե։ Մեղմ կրկնակի խառնումից հետո պատրաստվում են բարակ սեպաձև քսուքներ, չորացվում օդում և չֆիքսված վիճակում հետազոտվում 100x յուղային իմերսիոն օբյեկտիվով։ Ռետիկուլոցիտների հաշվարկի NCBI ընթացակարգը նկարագրում է այս աշխատանքային ընթացքը և դրա հետ կիրառվող հաշվարկի շրջանակը։
Դեյսիի և Լյուիսի տարբերակում օգտագործվում է 1.0 տոկոս նոր մեթիլենային կապույտ՝ ցիտրատային աղային լուծույթում, որը խառնվում է արյան 2-ից 4 ծավալի հետ և քսուք պատրաստելուց առաջ պահվում 37 C-ում՝ 15-ից 20 րոպե։ CLSI H44 ընթացակարգի ներդաշնակեցման վերջերս իրականացված տարբերակում օգտագործվել է ավելի նոսր՝ 0.1 տոկոս լուծույթ՝ pH 7.4 ունեցող ֆոսֆատային բուֆերային աղային լուծույթում, 20 C-ում 10 րոպե ինկուբացմամբ և առանց ֆիքսման, ինչպես հաղորդվում է NMB-ի ներդաշնակեցման 2026 թվականի ուսումնասիրությունում։
Հաշվարկի կանոնները նույնն են բոլոր տարբերակների համար։ Բջիջը հաշվառեք որպես ռետիկուլոցիտ, երբ այն պարունակում է կապույտ ներկված առնվազն երկու առանձին հատիկ կամ թելիկի հատված. այս չափանիշը բացառում է ներկանյութի մեկուսացված նստվածքը։ Առօրյա աշխատանքում հաշվեք առնվազն 1,000 էրիթրոցիտ և ռետիկուլոցիտները ներկայացրեք տոկոսով։ Ցածր տոկոսների դեպքում վիճակագրությունը պահանջում է ավելի շատ բջիջներ։ CLSI H44 մեթոդաբանության ակնարկում նշվում է, որ մոտ 1 տոկոս ռետիկուլոցիտների դեպքում հաշվարկի տատանումը 5 տոկոսի հասցնելու համար անհրաժեշտ է մոտ 4,400 բջիջ, ըստ De Gruyter-ում հրապարակված CLSI H44 ակնարկի։ Միլլերի օկուլյար սկավառակը գործնական է դարձնում մեծ թվով բջիջների հաշվարկը։ Զտեք ներկանյութը կամ օգտագործեք թարմ պատրաստված լուծույթ, քանի որ նստվածքը նմանակում է հատիկավոր ներառուկները։
Հայնցի մարմնիկները նույն պատրաստուկում
Նույն սուպրավիտալ քսուքը կարող է նաև ցույց տալ Հայնցի մարմնիկները, որոնք օքսիդացված և բնափոխված հեմոգլոբինի կուտակումներ են, ոչ թե մնացորդային ՌՆԹ։ Նոր մեթիլենային կապույտով պատրաստուկներում դրանք երևում են որպես կլոր մարմնիկներ՝ հաճախ մեկական և թաղանթի մոտ, որոնք ցանցաթելային նյութից ավելի բաց կապույտ են ներկվում։ Դրանք վատ են պահպանվում ֆիքսման և լրացուցիչ ներկման ընթացքում, ուստի հետազոտեք չֆիքսված քսուքը։ Վերջերս հրապարակված ընթացակարգում 20 միկրոլիտր EDTA-ով մշակված արյունը խառնվել է 20 միկրոլիտր 1 տոկոս նոր մեթիլենային կապույտի հետ և ինկուբացվել 15 րոպե, ապա 250 էրիթրոցիտների շրջանում քանակապես գնահատվել են Հայնցի մարմնիկներ պարունակող բջիջները, ինչպես նկարագրված է այդ ընթացակարգը ներկայացնող PMC ուսումնասիրությունում։
Երկու տարբերակում օգնում է խուսափել սխալ մեկնաբանություններից։ Նախ՝ մեթիլային մանուշակագույնը և բյուրեղային մանուշակագույնը Հայնցի մարմնիկները ներկում են ավելի ինտենսիվ, քան նոր մեթիլենային կապույտը, ինչպես նշված է Հայնցի մարմնիկների մասին ScienceDirect թեմատիկ էջում։ Նոր մեթիլենային կապույտը հարմար ընտրություն է, երբ ռետիկուլոցիտներն ու Հայնցի մարմնիկները գնահատվում են միասին, բայց Հայնցի մարմնիկների համար նախատեսված ամենաուժեղ ներկանյութը չէ։ Երկրորդ՝ ալֆա-թալասեմիայի կրողության դեպքում HbH ներառուկները սուպրավիտալ ներկումից հետո բջջի ամբողջ տարածքով առաջացնում են բազմաթիվ մանր կետեր, մինչդեռ դասական Հայնցի մարմնիկներն ավելի քիչ են, ավելի խոշոր և հաճախ կապված են թաղանթին։ Երրորդ նմանակողը ներկանյութի նստվածքն է. այն գտնվում է բջիջների կիզակետային հարթությունից դուրս և տարբեր է տարբեր տեսադաշտերում։
Բրիլիանտ կրեզիլային կապույտը՝ նոր մեթիլենային կապույտի համեմատ
Երկու ներկանյութերն էլ ռետիկուլոցիտների սուպրավիտալ ներկանյութեր են, սակայն ստանդարտացումը նախապատվություն է տալիս դրանցից մեկին։ Ռետիկուլոցիտների CLSI H44-A2 մեթոդը, որը մշակվել է Արյունաբանության ստանդարտացման միջազգային խորհրդի հետ համատեղ և ներկայացված է CLSI H44 ստանդարտի էջում, EDTA-ով մշակված արյան ներկումը նոր մեթիլենային կապույտով սահմանում է որպես ձեռքով կատարվող համեմատական մեթոդ։ Դասական արյունաբանական ուսուցումը համակարծիք է տեսքի հարցում. նոր մեթիլենային կապույտը թելիկները ներկում է ավելի ինտենսիվ և համաչափ, մինչդեռ բրիլիանտ կրեզիլային կապույտի դեպքում խմբաքանակների և նմուշների միջև տարբերություններն ավելի մեծ են։
Այդ կարգավիճակը ճշգրտման կարիք ունի։ Անալիզատորների գնահատման ICSH ուղեցույցը ընդունում է նոր մեթիլենային կապույտով ձեռքով կատարվող մանրադիտակային հետազոտությունը որպես հղումային համեմատության մոտեցում, բայց այն բնութագրում է որպես սուբյեկտիվ և համեմատաբար ոչ ճշգրիտ՝ նախապատվություն տալով հոսքային ցիտոմետրիայի հղումային ընթացակարգերին, երբ դրանք հասանելի են։ 100 նմուշի 2022 թվականի համեմատական ուսումնասիրությունում օգտագործված անալիզատորի նկատմամբ ավելի փոքր համակարգային շեղում է հայտնաբերվել բրիլիանտ կրեզիլային կապույտի դեպքում, քան նոր մեթիլենային կապույտի, ինչպես հաղորդվում է ներկման մեթոդների PMC համեմատական ուսումնասիրությունում։ Ուսանողների համար հիմնավորված ամփոփումը հետևյալն է. օգտագործեք նոր մեթիլենային կապույտը որպես ձեռքով կատարվող ստանդարտացված համեմատական մեթոդ, տեղում կիրառվող բրիլիանտ կրեզիլային կապույտի ցանկացած մեթոդ ստուգեք դրա կամ ավտոմատացված մեթոդի նկատմամբ և երկու դեպքում էլ ձեռքով կատարվող մանրադիտակային հետազոտությունից ակնկալեք արդյունքների ավելի լայն ցրվածություն։ Ստանդարտացման ավելի վաղ գրականությունը նաև առաջարկում էր մաքրված Azure B-ն՝ որպես քիմիապես ավելի մաքուր այլընտրանք, քանի որ առևտրային ներկանյութերի խմբաքանակները տարբեր էին, ինչպես նշված է Azure B-ի վերաբերյալ Մարշալի ուսումնասիրությունում։ Սա բացատրում է, թե ինչու ռեագենտի մաքրության դասը դեռ քննարկվում է մեթոդների նկարագրություններում։
Ինչպես խուսափել տարածված սխալներից
Չստացված պատրաստուկների մեծ մասը պայմանավորված է չորս սխալով։ Նոր մեթիլենային կապույտ N-ի փոխարեն սովորական մեթիլենային կապույտ պատվիրելը թույլ ներկում է տալիս քիմիական տարբերության, ոչ թե տեխնիկայի պատճառով։ Գնահատումից առաջ ֆիքսումը կամ լրացուցիչ ներկումը վերացնում են սուպրավիտալ ազդանշանը։ Ներկանյութի նստվածքը որպես հատիկներ հաշվելը ուռճացնում է արդյունքը, ինչը կանխում են երկու հատիկի կանոնը և զտված ներկանյութը։ Ռետիկուլոցիտների ցածր տոկոսների դեպքում չափազանց քիչ բջիջներ հաշվելը տալիս է ճշգրիտ թվացող թիվ՝ վստահության լայն սահմաններով։ Յուրաքանչյուր սխալ նույն դրսևորումն ունի. մանրադիտակով հետազոտողը մեղադրում է մանրադիտակին այն բանի համար, ինչը որոշվել է ռեագենտի կիրառման փուլում։