Մեթիլենային կապույտով պարզ ներկումը և ըստ Գրամի ներկումը. ինչ կարող է ապացուցել յուրաքանչյուր մեթոդը

Ուսանողը E. coli պիտակով կուլտուրայից քսուք է պատրաստում, մեկ րոպեով ծածկում այն մեթիլենային կապույտով, ողողում և դիտում յուղային իմերսիայի օբյեկտիվով։ Տեսադաշտը ծածկված է կապույտ ցուպիկներով։ Լաբորատոր հաշվետվության մեջ գրված է. «Գրամ-բացասական ցուպիկներ՝ նույնականացված որպես E. coli»։ Դիտարկումը ճիշտ է։ Սակայն այդ պատրաստուկը նման եզրակացության հիմք չի տալիս։

Սխալը հասկացութային է, ոչ թե տեխնիկական։ Ուսանողը պարզ ներկման հետ վարվել է այնպես, կարծես այն տարբերակիչ փորձ լիներ։ Պարզ ներկումն ու ըստ Գրամի ներկումը պատասխանում են տարբեր հարցերի, քանի որ հիմնված են ներկման տարբեր սկզբունքների վրա։ Մեկը հարցնում է՝ ինչ ձև ունեն առկա բջիջները։ Մյուսը՝ ինչպես է բջջապատն իրեն պահում փորձարկման պայմաններում։ Եթե դրանք շփոթեք, ճիշտ ներկված պատրաստուկը կհանգեցնի չհիմնավորված հաշվետվության։

Այս համեմատությունը հստակ տարանջատում է երկու մեթոդները, ցույց տալիս, թե յուրաքանչյուր արդյունք ինչ պնդման հիմք է տալիս, և պատասխանում ուսանողների ամենահաճախ տրվող երկու հարցերին. կարելի՞ է մեթիլենային կապույտն օգտագործել ըստ Գրամի ներկման մեջ, և ի՞նչ է իրականում ցույց տալիս E. coli-ի ներկումը մեթիլենային կապույտով։

Կարճ պատասխանը

Մեթիլենային կապույտով պարզ ներկումը բոլոր ներկվող բջիջներին տալիս է նույն կապույտ գույնը, ուստի բացահայտում է ձևաբանությունը՝ ցուպիկներ, գնդեր, պարույրներ, և դասավորությունը՝ առանձին, զույգերով, շղթաներով, բայց ոչինչ չի ասում ըստ Գրամի պատկանելության մասին։ Ըստ Գրամի ներկումն ավելացնում է յոդ, գունազրկման փուլ և հակադրական ներկ, ուստի բակտերիաները բաժանում է գրամ-դրականների՝ մանուշակագույն, և գրամ-բացասականների՝ վարդագույն կամ կարմիր, ըստ այն բանի, թե ինչպես են դրանց թաղանթապատերը պահպանում ներկը։ Մեթիլենային կապույտից հետո կապույտ ցուպիկները նշանակում են՝ «առկա են ցուպիկաձև բջիջներ»։ Ըստ Գրամի ներկման ամբողջ հաջորդականությունից հետո վարդագույն ցուպիկները նշանակում են՝ «առկա են գրամ-բացասական ցուպիկներ»։ Երկրորդ պնդումն ավելի հիմնավոր է, քանի որ ընթացակարգը ներառել է լրացուցիչ փորձ։

Մեկ ներկանյութով բակտերիաների ներկման մեթոդների ավելի լայն խմբին, որին վերաբերում է այս հոդվածը, ծանոթանալու համար տես մանրադիտակային ներկման ատլասը։

Պարզ ներկում. մեկ ներկանյութ, մեկ հարց

Մեթիլենային կապույտը հիմնային՝ կատիոնային ներկանյութ է։ Դրա գունավոր իոնը կրում է դրական լիցք և կապվում բջջի բացասական լիցքավորված կառուցվածքների, այդ թվում՝ նուկլեինաթթուների և մակերեսային թթվային խմբերի հետ, ինչի շնորհիվ բջիջները բաց ֆոնի վրա երևում են կապույտ։ OpenStax-ը դրական ներկման այս սկզբունքը նկարագրում է ներկմանը նվիրված գլխում։ Ներկանյութի կատիոնն ինքնին փոքր, հարթ ֆենոթիազինային իոն է, որը մանրամասն ներկայացված է մեթիլենային կապույտի քիմիական տեղեկատուում․ քլորիդ հակաիոնը գույն չի հաղորդում։

Ստանդարտ ուսումնական ընթացակարգը միտումնավոր պարզ է. պատրաստել բարակ քսուք, չորացնել օդում, ֆիքսել ջերմությամբ, մոտ մեկ րոպեով ծածկել մոտ 1% մեթիլենային կապույտի ջրային լուծույթով, զգուշորեն ողողել ջրով, չորացնել՝ ներծծող թղթով թեթև հպվելով, և դիտել յուղային իմերսիայով։ LibreTexts-ի ուսումնական ընթացակարգը տալիս է հենց այս՝ 1% լուծույթով մեկ րոպեանոց տարբերակը՝ նշելով, որ որոշ լաբորատորիաներ երկարացնում են ժամանակը։ Ոչ ներկն ամրացնող նյութ, ոչ գունազրկիչ, ոչ երկրորդ ներկանյութ։ Հենց դրանց բացակայությունն է էական։ Երբ կա միայն մեկ ներկանյութ և չկա ընտրողական հեռացում, ներկանյութը կապող յուրաքանչյուր բջիջ ստանում է նույն գույնը։

E. coli-ի դեպքում սպասվող տեսադաշտը կապույտ ցուպիկներն են՝ բացիլները, առանձին, զույգերով կամ փոքր խմբերով։ Կապույտ գույնը գալիս է ներկանյութից։ Ցուպիկաձևությունը՝ օրգանիզմից։ Սակայն այդ համադրությունը չի նույնականացնում օրգանիզմը, քանի որ բազմաթիվ տեսակներ ցուպիկաձև են, և շատ ցուպիկներ պարզ ներկման ժամանակ կապույտ են ներկվում։ ATCC-ն իր մանրէաբանական կուլտուրաների ուղեցույցում հստակ նշում է, որ այս մեթոդը սահմանափակվում է միայն ձևաբանությամբ։ Ճիշտ հաշվետվությունը ձևակերպվում է այսպես. «Դիտվել են կապույտ բացիլներ»։ Ձևից և դասավորությունից դուրս ցանկացած պնդում լրացուցիչ ապացույց է պահանջում։

Ըստ Գրամի ներկում. չորս ռեագենտ, վարքագծի մեկ փորձ

Ըստ Գրամի ներկումը տարբերակիչ ներկում է։ Այն բոլոր բջիջները ենթարկում է նույն հաջորդականությանը և ցույց տալիս, թե որ բջիջներն են պահպանում առաջին ներկանյութը, իսկ որոնք՝ կորցնում այն։ Մանրէաբանության ամերիկյան ընկերության՝ ըստ Գրամի ներկման ընթացակարգերը սահմանում են ստանդարտ չորս փուլերի հերթականությունը. բյուրեղային մանուշակագույն՝ հիմնական ներկանյութ, Գրամի յոդ՝ ներկն ամրացնող նյութ, սպիրտ կամ ացետոն-սպիրտ՝ գունազրկիչ, ապա սաֆրանին՝ հակադրական ներկ։

Ստանդարտ ուսումնական մոդելը այս տարբերությունը բացատրում է բջջի թաղանթապատի կառուցվածքով։ Գրամ-դրական բջիջներն ունեն հաստ պեպտիդոգլիկանային պատ, որը սպիրտով լվացման ժամանակ ջրազրկվում է և պահպանում բյուրեղային մանուշակագույնի ու յոդի համալիրը։ Գրամ-բացասական բջիջներն ունեն բարակ պեպտիդոգլիկանային շերտ և լիպիդներով հարուստ արտաքին թաղանթ, որը գունազրկիչը խախտում է, ուստի համալիրը լվացվում ու հեռանում է, իսկ բջիջներն այնուհետև կլանում են սաֆրանինը։ NCBI Bookshelf-ի՝ ըստ Գրամի ներկման ակնարկը ներկայացնում է բջջապատի վրա հիմնված այս բացատրությունը։ Մասնագետները հավելում են, որ ամբողջ ֆիզիկաքիմիական գործընթացն ավելի բարդ է, քան միայն պատի հաստությունը, սակայն լաբորատոր մեկնաբանման համար վարքագծային կանոնը մնում է ուժի մեջ. մանուշակագույնը նշանակում է՝ պահպանել է, վարդագույնը՝ կորցրել է, ապա հակադրական ներկով ներկվել։

Պատկերազարդ վահանակներ։ Մեթոդների համեմատության համար ոճավորված նկարներ են, ոչ թե տեսախցիկով արված մանրադիտակային լուսանկարներ։ Գույները պարզեցված են՝ տրամաբանությունը սովորեցնելու համար. մեկ գույն՝ պարզ ներկման դեպքում, երկու գույն՝ ըստ Գրամի գունազրկումից հետո։

Կարելի՞ է մեթիլենային կապույտն օգտագործել ըստ Գրամի ներկման մեջ

Այս հարցն ունի երկու մեկնաբանություն, որոնք տարբեր պատասխաններ են պահանջում։

Առաջին մեկնաբանությունը. կարո՞ղ է մեթիլենային կապույտով մեկանգամյա ծածկումը փոխարինել ըստ Գրամի ներկման ամբողջ հաջորդականությանը։ Ոչ։ Առանց յոդի, գունազրկիչի և հակադրական ներկի տարբերակիչ փուլ չկա, հետևաբար ըստ Գրամի պատկանելությունը չի փորձարկվում։ Միայն մեթիլենային կապույտից հետո կապույտ տեսադաշտը պարզ ներկման արդյունք է, նույնիսկ եթե սրվակը դրված է Գրամի ռեագենտների կողքին։ Մի գրանցեք այն որպես ըստ Գրամի ներկման արդյունք։

Երկրորդ մեկնաբանությունը. կարո՞ղ է մեթիլենային կապույտը փոխարինել սաֆրանինին որպես հակադրական ներկ 4-րդ փուլում։ Գործառութային առումով այն կարող է ներկել գունազրկված բջիջները, և դասագրքային վարժությունը նման փոխարինումից հետո կանխատեսում է մանուշակագույն գրամ-դրական և կապույտ գրամ-բացասական բջիջներ։ Տրամաբանությունը հիմնավոր է, քանի որ ճիշտ գունազրկված գրամ-բացասական բջիջները գրեթե անգույն են և կկլանեն մեկ այլ կատիոնային ներկանյութ։ Բայց սա ստանդարտ ընթացակարգը չէ։ ASM-ի ընթացակարգերը նախատեսում են սաֆրանին, իսկ որոշ տարբերակներում՝ ընդունված այլընտրանքներ, օրինակ՝ հիմնային ֆուքսին, բայց ոչ մեթիլենային կապույտ։ Կա նաև գործնական թերություն. կապույտը մանուշակագույնից տարբերակելն ավելի դժվար է, քան վարդագույնը մանուշակագույնից, հատկապես սկսնակների համար և հատկապես մաշված մանրադիտակային լամպերի լույսի տակ։ Ուսումնական աշխատանքի և կարևոր ցանկացած արդյունքի համար օգտագործեք ձեր ընթացակարգում նշված հակադրական ներկը՝ սովորաբար սաֆրանինը, իսկ մեթիլենային կապույտով հակադրական ներկումը դիտարկեք որպես ցուցադրական տարբերակ, ոչ թե համարժեք ստանդարտ։

Այն հարակից հարցը, թե ինչպես է մեթիլենային կապույտը համեմատվում մեկ ներկանյութով այլ տարբերակների հետ, քննարկվում է բակտերիաների պարզ ներկումների համեմատության մեջ։

Ինչ է ապացուցում E. coli-ի ներկումը մեթիլենային կապույտով, և ինչ չի ապացուցում

E. coli-ն գրամ-բացասական ցուպիկ է, սակայն այդ նախադասությունը միավորում է մի քանի մեթոդներով ստացված փաստեր. ձևաբանությունը՝ մանրադիտակային դիտումից, Գրամի ռեակցիան՝ ըստ Գրամի ներկումից, նույնականացումը՝ կուլտուրայի ուսումնասիրությունից և կենսաքիմիական կամ մոլեկուլային փորձարկումներից։ Մեթիլենային կապույտով ներկված քսուքը տալիս է միայն առաջին մասը։ Այն հաստատում է, որ ներկված նմուշում առկա են ցուպիկաձև բջիջներ, և ցույց է տալիս դրանց դասավորությունը։ Այն չի հաստատում Գրամի ռեակցիան, քանի որ գունազրկման փորձ չի կատարվել։ Այն չի նույնականացնում տեսակը, քանի որ այս լուծունակությամբ բազմաթիվ տեսակների ցուպիկները նման տեսք ունեն։

Հենց այստեղ հաշվետվություններում առաջանում է կանխատեսելի սխալը։ Հեղինակը նախնական գիտելիքը՝ «այս կուլտուրան ենթադրաբար E. coli է, իսկ E. coli-ն գրամ-բացասական է», ներմուծում է դիտարկման տողում, և թվում է, թե պատրաստուկը հաստատում է այն, ինչ իրականում ենթադրվել էր։ Ավելի հստակ հաշվետվությունը տարանջատում է այս մակարդակները. «Մեթիլենային կապույտով պարզ ներկում. դիտվել են կապույտ բացիլներ․ միայն ձևաբանություն, ըստ Գրամի պատկանելությունը չի փորձարկվել»։ Այնուհետև, եթե ըստ Գրամի ներկումը ճիշտ է կատարվել՝ ստուգիչ նմուշներով. «Ըստ Գրամի ներկում. վարդագույն ցուպիկներ, ինչը համապատասխանում է գրամ-բացասական լինելուն»։ Տեսակի նույնականացումը կատարվում է ավելի ուշ՝ նույնականացման գործընթացով, ոչ թե միայն գույնով։

Մեկնաբանման գործնական ուղեցույց

Լաբորատոր աշխատասեղանի մոտ կիրառեք այս որոշման կանոնը։ Եթե բոլոր բջիջները մեկ գույն ունեն, և ընթացակարգում օգտագործվել է մեկ ներկանյութ՝ առանց գունազրկիչի, դուք կատարել եք պարզ ներկում։ Նշեք ձևը, չափի գնահատականը և դասավորությունը։ Դրանով սահմանափակվեք։ Եթե ընթացակարգում օգտագործվել են բյուրեղային մանուշակագույն, յոդ, գունազրկիչ և հակադրական ներկ՝ հայտնի դրական ու բացասական ստուգիչ նմուշների հետ, դուք կատարել եք ըստ Գրամի ներկում։ Նշեք գույնն ու ձևաբանությունը. մանուշակագույն կոկեր՝ շղթաներով, վարդագույն ցուպիկներ և այլն։

Շփոթության մեծ մասը պայմանավորված է երեք սխալով։ Առաջինը՝ կապույտ ցուպիկները մեկնաբանել որպես E. coli-ի հաստատում։ Երկրորդը՝ մեթիլենային կապույտով ներկված պատրաստուկը գրանցել լաբորատոր մատյանում «Ըստ Գրամի ներկում» վերնագրի տակ, ինչը հետագա ընթերցողները սխալ կմեկնաբանեն։ Երրորդը՝ առանց պատշաճ ուշադրության փոխարինել հակադրական ներկերը, ապա տարբեր լաբորատորիաների գույները համեմատել այնպես, կարծես գունային պատկերը նույնը լիներ։ Բոլոր սխալների լուծումը նույնն է. անվանեք իրականում կիրառված մեթոդը և պնդեք միայն այն, ինչ այդ մեթոդը ստուգում է։

Պարզ ներկումն իր տեղն ունի հենց այն պատճառով, որ սահմանափակ պնդումների հիմք է տալիս։ Այն արագ է, հանդուրժում է կատարման փոքր շեղումները և բավարար է, երբ հարցը ձևաբանությունն է. արդյո՞ք ինչ-որ բան կա, և ի՞նչ ձև ունի։ Երբ հարցը դասակարգումն է, կատարեք տարբերակիչ փորձը։ Կապույտ պատրաստուկը ցույց է տալիս, թե ինչ տեսք ունեն բջիջները։ Մանուշակագույն կամ վարդագույն պատրաստուկը ցույց է տալիս, թե ինչպես են իրենց պահում դրանց պատերը։ Պատրաստուկներից ոչ մեկը, առանձին վերցրած, չի որոշում տեսակը։