Մեթիլենային կապույտը, Nrf2-ը և միտոքոնդրիային բիոգենեզը․ ինչ է չափվել, և ինչն է դեռ ենթադրություն

Մեթիլենային կապույտի մասին նյութերում հաճախ հանդիպում է մի նախադասություն․ այն ակտիվացնում է Nrf2-ը և ստեղծում նոր միտոքոնդրիումներ։ Նախադասությունը կարդացվում է որպես մեկ պնդում, բայց պարունակում է երկու տարբեր հասկացություն, որոնք ուսումնասիրվել են տարբեր համակարգերում՝ տարբեր տեսակի ապացույցներով։ Առաջինը ազդանշանային ուղի է՝ զգայուն համակարգ, որը միացնում է պաշտպանական գեները։ Երկրորդը կառուցման ծրագիր է, որով բջիջն ավելացնում է իր միտոքոնդրիային ապարատը։ Ազդանշանը կարող է գործարկել կառուցումը, բայց ցույց տալը, որ ազդանշանն ակտիվացել է, նույնը չէ, ինչ ցույց տալը, որ շենքը կառուցվել է, իսկ շինանյութի ավելացումը ցույց տալը նույնը չէ, ինչ ավելի լավ էներգամատակարարումը ցույց տալը։ Այս հոդվածն այդ երեքը դիտարկում է առանձին։

Nrf2 հասկացությունը․ սենսոր, ոչ թե վահան

Nrf2-ը (էրիթրոիդ 2 գործոնին առնչվող կորիզային գործոն 2) տրանսկրիպցիոն գործոն է՝ սպիտակուց, որի գործը գեները միացնելն է։ Հանգստի պայմաններում այն ցիտոպլազմայում պահում է Keap1 կոչվող սենսորային սպիտակուցը, որն այն փոխանցում է բջջի հեռացման ապարատին՝ շարունակական քայքայման համար։ Երբ օքսիդանտները կամ էլեկտրոֆիլները փոփոխում են Keap1-ի ռեակտիվ ցիստեինները, հեռացումը դադարում է։ Նոր առաջացած Nrf2-ը կուտակվում է, անցնում կորիզ, զուգակցվում փոքր Maf սպիտակուցների հետ և կապվում ԴՆԹ-ի հաջորդականություններին, որոնք կոչվում են հակաօքսիդանտային պատասխանի տարրեր։ Այդ կապումը միացնում է պաշտպանական գեների մի ամբողջ խումբ։

Այս ուղու կանոնական ցուցիչները որոշակի են։ NQO1-ը (NAD(P)H քինոն դեհիդրոգենազ 1) և TrxR1-ը (թիոռեդոքսին ռեդուկտազ 1) Nrf2-ի ամենահուսալի թիրախային գեներից են։ HO-1-ը (հեմ օքսիգենազ-1) ուժեղ ինդուկցվող է, բայց արձագանքում է նաև այլ կարգավորիչների։ SOD-ի և կատալազի նման ֆերմենտները հակաօքսիդանտային ապարատի մաս են, սակայն դրանց մակարդակները վերահսկում են բազմաթիվ տրանսկրիպցիոն գործոններ, ուստի SOD-ի աճն ինքնին չի ապացուցում, որ պատճառը Nrf2-ն էր։ Ազդանշանային իրադարձությանը ամենամոտ ապացույցներն են կորիզում Nrf2-ի կուտակումը, ARE ռեպորտերի ակտիվացումը կամ կանոնական թիրախների ինդուկցիան, որը վերանում է Nrf2-ը հեռացնելիս։ Մնացած ամեն ինչ՝ օքսիդանտների ավելի ցածր մակարդակները, սթրեսի պայմաններում ավելի լավ գոյատևումը, գլուտաթիոնի ավելացումը, հետագա ազդեցություն է, որը կարող են առաջացնել բազմաթիվ ուղիներ։

Այս պատմության մեջ մեթիլենային կապույտի մասին ամենավաղ արդյունքը համապատասխանում է այդ սանդղակի՝ ազդանշանին ավելի մոտ հատվածին։ Նանոմոլար կոնցենտրացիաներով մեթիլենային կապույտի ազդեցությանը ենթարկված ֆիբրոբլաստներում դիտվել են բջջային ծերացման ուշացում, IV համալիրի պարունակության ավելացում, թթվածնի սպառման աճ և 2-րդ փուլի TrxR1 ու NQO1 ֆերմենտների ինդուկցիա, ինչպես նշված է հետազոտությունում, որն առաջինը մեթիլենային կապույտը կապեց միտոքոնդրիային գործունեության ուժեղացման և բջջային ծերացման ուշացման հետ։ TrxR1-ը և NQO1-ը հենց այն կանոնական Nrf2 թիրախներն են, որոնք ուշադիր ընթերցողը ցանկանում է տեսնել։ Սակայն հետազոտությունը չի ցույց տվել բուն ազդանշանային իրադարձությունը․ չկար կորիզային Nrf2-ի չափում, ARE ռեպորտեր կամ Nrf2-ի գենային անջատմամբ վերահսկիչ փորձ։ Ուստի բարեխիղճ մեկնաբանությունն այն է, որ այս համակարգում մեթիլենային կապույտն ինդուկցում է Nrf2-ի հայտնի թիրախային գեները, ինչը համահունչ է Nrf2-ի ակտիվացմանը, բայց չի առանձնացնում Nrf2-ը որպես պատճառ։ Թիրախային գենի ինդուկցիան անջատիչից մեկ քայլ ներքև է։

Բիոգենեզ հասկացությունը․ երեք ստուգակետ ունեցող ծրագիր

Միտոքոնդրիային բիոգենեզն այն ծրագիրն է, որով բջիջն ավելացնում է իր միտոքոնդրիային կարողությունը։ Դասագրքային նկարագրությամբ դրա հիերարխիան անցնում է երեք ստուգակետով։ Նախ՝ PGC-1alpha կոակտիվատորը միացնում է ծրագիրը։ Երկրորդ՝ կորիզային տրանսկրիպցիոն գործոնները (շփոթեցնող է, որ դրանցից մեկը կոչվում է NRF1՝ կորիզային շնչառական գործոն 1, որը Nrf2-ից տարբեր սպիտակուց է) խթանում են միտոքոնդրիային գեների էքսպրեսիան, ներառյալ TFAM-ը, որը պահպանում և կրկնապատկում է միտոքոնդրիային ԴՆԹ-ն։ Երրորդ՝ արդյունքում բջիջն ունենում է ավելի շատ միտոքոնդրիային գենոմներ և ավելի մեծ շնչառական ապարատ, ինչը չափելի է mtDNA-ի պատճենների թվով, ցիտրատ սինթազի ակտիվությամբ կամ շնչառական համալիրների քանակով ու ակտիվությամբ։

Յուրաքանչյուր ստուգակետ թույլ է տալիս նախորդից ավելի թույլ կամ ավելի ուժեղ պնդում անել։ PGC-1alpha-ի կամ TFAM-ի տեղեկատվական ՌՆԹ-ի ավելացումը ցույց է տալիս, որ ծրագրի գործարկման պահանջ է տրվել, ոչ թե որ այն ավարտվել է։ Ավելի շատ mtDNA-ն կամ IV համալիրի սպիտակուցը ցույց են տալիս նյութի ավելացում, բայց վերակազմավորված միտոքոնդրիումները նույնպես կարող են նույն պատկերը տալ։ Ավելի լավ շնչառությունը՝ թթվածնի ավելի մեծ սպառումը կամ համալիրի ավելի բարձր ակտիվությունը, ցույց է տալիս գործառույթի փոփոխություն, բայց գործառույթը կարող է բարելավվել առանց որևէ նոր միտոքոնդրիումի։ Բիոգենեզի մասին ուժեղ պնդումը համադրում է բոլոր երեքը՝ կարգավորիչը, պարունակությունը և գործառույթը։

Ֆիբրոբլաստների հետագա հետազոտությունն անցել է այդ շղթայի մեծ մասով։ 100 նանոմոլար մեթիլենային կապույտով մշակված մարդու IMR90 բջիջներում NAD-ի և NADH-ի հարաբերակցությունը ժամանակավորապես աճել է 15 րոպեի ընթացքում և մեկ օրվա ընթացքում վերադարձել ելակետային մակարդակին։ Այդ անցողիկ էներգետիկ ազդանշանին հաջորդել է էներգետիկ սենսոր AMPK-ի անցողիկ ֆոսֆորիլացումը, ապա՝ PGC-1alpha-ի և SURF1-ի ինդուկցիան․ վերջինս գործող IV համալիրի հավաքման համար անհրաժեշտ սպիտակուց է։ IV համալիրի ակտիվությունը մոտավորապես կրկնապատկվել է, բջջային օքսիդանտները նվազել են մոտ 28 տոկոսով, իսկ տելոմերներն ավելի դանդաղ են կարճացել։ Ամբողջ հաջորդականությունը ներկայացված է մեթիլենային կապույտի օքսիդավերականգնման ակտիվությունը AMPK-ի և միտոքոնդրիային բիոգենեզի հետ կապող հոդվածում։

Այդ հոդվածի երկու մանրամասներ արժանի են ուշադրության, քանի որ հենց նման մանրամասներն են սովորաբար դուրս մնում։ Նախ՝ ակտիվացման բնույթն ավելի կարևոր էր, քան դրա առկայությունը․ մեթիլենային կապույտն AMPK-ը միացրել է անցողիկ կերպով, մինչդեռ համեմատության համար օգտագործված AICAR դեղամիջոցը՝ տևականորեն, և անցողիկ ակտիվացնողը բջջային ծերացումն ուշացրել է մոտ ութ անգամ ավելի արդյունավետ։ Հետևաբար «մեթիլենային կապույտն ակտիվացնում է AMPK-ը» ձևակերպմամբ պնդումը թերի է․ էականն այն է, որ այն AMPK-ը ակտիվացնում է անցողիկ կերպով, իսկ համեմատությունը հուշում է, որ տևական ակտիվացումը նույն արդյունքը չի տալիս։ Երկրորդ՝ մեթիլենային կապույտը չի փոխել բջջային ցիկլը, ինչը բացառում է ամենապարզ այլընտրանքային բացատրությունը՝ բջիջները պարզապես ավելի դանդաղ են բաժանվել և դրա շնորհիվ ավելի երիտասարդ տեսք ունեցել։

Մկների ճյուղը․ վարքագիծ, գենոմներ և միտումնավոր պարադոքսային գործարկիչ

Բջջային կուլտուրաներով աշխատանքը կենդանիների վրա ընդլայնել է միջին տարիքի մկներ ուսումնասիրող մի խումբ։ Մեթիլենային կապույտի՝ բերանով ընդունման 60 օրից հետո այն ստացած մկներն ավելի լավ են պահպանել իրենց ֆիզիկական դիմացկունությունն ու հետազոտական վարքագիծը և դրսևորել են ավելի քիչ անհանգստության նման վարքագիծ, քան նյութը չստացած տարեց մկները։ Ուղեղի հյուսվածքում այն գեների էքսպրեսիան, որոնք ճնշվել էին ծերացման հետևանքով՝ NRF1, TFAM, SOD2 և IV համալիրի COX1 ենթամիավոր, վերականգնվել է դեպի հասուն տարիքի մակարդակները, իսկ mtDNA-ի պատճենների թիվն աճել է։ Այդ արդյունքները՝ վարքագիծը, կարգավորիչը և գենոմների քանակը միասին, ներկայացված են մեթիլենային կապույտի և ուղեղի միտոքոնդրիային բիոգենեզի մասին միջին տարիքի մկների հետազոտությունում։

Հետաքրքիր մասը ենթադրվող գործարկիչն է, քանի որ այն հակասում է այն պարզ պատմությանը, թե մեթիլենային կապույտը հակաօքսիդանտ է։ Նյութը ստացած մկների ուղեղի միտոքոնդրիումներում դիտվել է թթվածնի ռեակտիվ ձևերի, մասնավորապես՝ ջրածնի պերօքսիդի, ավելի մեծ առաջացում։ Հեղինակների ենթադրությունն այսպիսին է․ պերօքսիդի մեղմ ազդանշանն է ակտիվացնում Nrf2 ուղին, որն այնուհետև գործարկում է բիոգենեզի ծրագիրը։ Այս մոդելում մեթիլենային կապույտը գործարկման փուլում պրոօքսիդանտ է, իսկ արդյունքի փուլում՝ հակաօքսիդանտ։ Դեղաբաններն այս օրինաչափությունն անվանում են հորմեզիս, երբ փոքր սթրեսը առաջացնում է իրենից ավելի մեծ պաշտպանական պատասխան։ Թե արդյոք պերօքսիդի այդ աճն իսկապես առաջացնում է Nrf2-ի ակտիվացում, ուղղակիորեն չի ստուգվել․ դա ենթադրվող կամուրջն է, ոչ թե չափված կապը։

Նույն խմբի զուգահեռ հետազոտությունը փորձության է ենթարկել այդ ենթադրության անվտանգության կողմը։ Մեկուսացված ուղեղային միտոքոնդրիումներում մեթիլենային կապույտը բարձրացրել է ջրածնի պերօքսիդի արտադրությունը նույնիսկ 50 նանոմոլար կոնցենտրացիայի դեպքում, սակայն թերապևտիկ կոնցենտրացիաները միտոքոնդրիային ԴՆԹ-ի հայտնաբերելի վնաս չեն առաջացրել։ Միայն 100 միկրոմոլար կոնցենտրացիայի դեպքում՝ թերապևտիկ մակարդակներից շատ բարձր, mtDNA-ի որոշ հատվածներում վնաս է դիտվել, իսկ 20 միկրոմոլար ներկանյութի և կարմիր լույսի համակցությունը առաջացրել է սինգլետային թթվածին, որը լայնորեն վնասել է mtDNA-ն։ Սա ներկանյութի հայտնի լուսազգայունացնող վարքագիծն է, այլ ոչ թե դրա դեղաբանական ազդեցությունը մթության պայմաններում։ Նախնական մշակումը նույնիսկ պաշտպանել է միջին ուղեղի փորային հատվածի միտոքոնդրիումները ռոտենոնով առաջացած mtDNA-ի վնասումներից։ Դոզա–պատասխան կապը և գենոտոքսիկության վերահսկիչ փորձերը մանրամասն ներկայացված են մեթիլենային կապույտի՝ առանց գենոտոքսիկության պերօքսիդի արտադրության մասին հետազոտությունում։

Չափվածը և ենթադրվածը․ ինչպես կարդալ սխեման

Ստորև բերված ուղու սխեման պատրաստվել է այս հոդվածի համար՝ հստակ պահելու այն տարբերակումը, որն արվում է տեքստում։ Հոծ եզրագծով վանդակները մեթիլենային կապույտի վերաբերյալ գրականության մեջ ուղղակի փորձարարական աջակցություն ունեցող քայլերն են․ օքսիդավերականգնման ցիկլավորումը, որը փոխում է NAD/NADH հարաբերակցությունը, AMPK-ի անցողիկ ֆոսֆորիլացումը, PGC-1alpha-ի և SURF1-ի ինդուկցիան, IV համալիրի ակտիվության աճը, NQO1-ի և TrxR1-ի ինդուկցիան, մկան ուղեղում բիոգենեզի գեների էքսպրեսիայի և mtDNA-ի պատճենների թվի վերականգնումը, ինչպես նաև թերապևտիկ դոզաներով պերօքսիդի աճը՝ առանց mtDNA-ի վնասման։ Կետագծային եզրագծով վանդակները ենթադրվող կապերն են․ Keap1-ի կողմից պերօքսիդի ազդանշանի ընկալումը, Nrf2-ի կորիզային կուտակումը, որը խթանում է պաշտպանական գեները, և Nrf2-ի ակտիվացումից դեպի բիոգենեզի ծրագիր տանող պատճառահետևանքային սլաքը։ Այդ կետագծային քայլերը հավանական են, համահունչ են տվյալներին և համապատասխանում են դասագրքային կենսաբանությանը, բայց այս հոդվածներում դրանք չեն չափվել այն վերահսկիչ փորձերով ու ցուցիչներով՝ կորիզային Nrf2, ARE ռեպորտերներ, Nrf2-ի գենային անջատում, որոնք թույլ կտային դրանք ներկայացնել հոծ եզրագծով վանդակներում։

Երբ սխեման ձեր առջև է, տեսանելի են դառնում երեք շփոթություններ։ Նախ՝ NRF1-ը և Nrf2-ը գրեթե նույնական անուններով տարբեր սպիտակուցներ են․ մկների հետազոտությունում չափվել է կորիզային շնչառական գործոն 1-ը՝ բիոգենեզի կարգավորիչը, ոչ թե հակաօքսիդանտային տրանսկրիպցիոն գործոնը, և դրանք նույնացնելը ամբողջ սխեման հանգեցնում է մեկ հանգույցի։ Երկրորդ՝ գեների էքսպրեսիան պատմության սկիզբն է, ոչ թե ավարտը․ TFAM-ի կամ COX1-ի տեղեկատվական ՌՆԹ-ների վերականգնումը վկայում է բիոգենեզի գործարկման պահանջի մասին, մինչդեռ mtDNA-ի պատճենների թիվը և IV համալիրի ակտիվությունը ապացույցներ են, որ պահանջը կատարվել է։ Երրորդ՝ հակաօքսիդանտային արդյունքը չի ապացուցում Nrf2 ուղու մասնակցությունը․ ֆիբրոբլաստներում օքսիդանտների 28 տոկոս նվազումը և մկների մոտ ռոտենոնից պաշտպանությունն իրական հետագա ազդեցություններ են, բայց դրանց հանգեցնում են մի քանի ուղիներ։

Ինչը կետագծային վանդակը կդարձներ հոծ

Բացակայող փորձերը ստանդարտ են։ Մեթիլենային կապույտի ազդեցությունից հետո կորիզային Nrf2 սպիտակուցի չափումը՝ AMPK-ի անցողիկ ազդանշանին համապատասխան ժամանակային ընթացքով, կստուգեր՝ արդյոք երկու ճյուղերն իսկապես ակտիվանում են միասին, ինչպես պնդում է համաժամանակյա ակտիվացման վարկածը։ ARE-ով կառավարվող ռեպորտերը կհաստատեր տրանսկրիպցիոն ակտիվությունը՝ այն թիրախային գեներից եզրակացնելու փոխարեն։ Nrf2-ի էքսպրեսիան նվազեցնելու կամ գենն անջատելու պայմաններում բիոգենեզի ցուցիչների կրկնակի չափումն ուղղակիորեն կստուգեր պատճառահետևանքային սլաքը․ եթե IV համալիրի ինդուկցիան և mtDNA-ի աճը պահպանվեն առանց Nrf2-ի, ապա կամուրջը սխալ է, և ազդեցությունն ապահովում է միայն AMPK ճյուղը։ Կենդանիների դեպքում տևական դոզավորման հետազոտությունը՝ նույն երեք ստուգակետերով՝ կարգավորիչ, պարունակություն, գործառույթ, կստուգեր՝ արդյոք ծրագիրը մնում է միացված, թե հարմարվում է։ Մինչ այդ էներգետիկ և պաշտպանական ուղիների համաժամանակյա ակտիվացումը մնում է այն, ինչ անվանել են դրա հեղինակները՝ հնարավոր առանցքային գործոն, ոչ թե հաստատված մեխանիզմ։

Ավելի լայն դեղաբանական թեմաներից եկող ընթերցողներին կարող է հետաքրքրել հարակից համատեքստը․ ինչպես է մեթիլենային կապույտը էլեկտրոններ տեղափոխում միտոքոնդրիային մակարդակում, ինչ այլ ազդեցություններ ունի միտոքոնդրիումների և բջջային էներգետիկայի վրա, ինչ տեղ ունեն բջջային ծերացման մասին արդյունքները ծերացման հետազոտություններում, ինչպես են բիոգենեզի մասին պնդումները առնչվում ճանաչողական կարողություններին, և անվտանգության ինչ տվյալներ են սահմաններ դնում դոզավորման ցանկացած քննարկման համար։ Դրանցից յուրաքանչյուրը առանձին հասկացություն է՝ իր սեփական ապացույցներով, և յուրաքանչյուրն արժանի է չափվածն ու ենթադրվածը տարանջատող այն նույն մոտեցմանը, որն այս հոդվածը կիրառեց Nrf2-ի նկատմամբ։