Մեթիլենային կապույտը և ազոտի օքսիդը. NOS, cGMP և անոթային ազդանշանում

Հարցը պարզ է հնչում. արդյո՞ք մեթիլենային կապույտը արգելակում է ազոտի օքսիդը։ Լաբորատորիայում այն բաժանվում է չորս առանձին հարցերի, որոնցից յուրաքանչյուրն ունի իր փորձարարական ստուգումը։ Դրանց շփոթումն է հիմնական պատճառը, որ մեթիլենային կապույտի և ազոտի օքսիդի մասին գրվածքները հնչում են վստահ, բայց անորոշ։

Ազոտի օքսիդի ազդանշանը պատկերացրեք որպես չորս օղակից կազմված շղթա։ Գենը տրանսկրիպցիայի է ենթարկվում՝ ազոտի օքսիդի սինթազի արտադրության համար։ Ֆերմենտը արգինինը փոխակերպում է ազոտի օքսիդի։ Գազը դիֆուզիայի միջոցով հասնում է իր թիրախին՝ նախքան որևէ այլ նյութի հետ ռեակցիայի մեջ մտնելը։ Լուծելի գուանիլատ ցիկլազը ճանաչում է այն և արտադրում ցիկլիկ GMP։ Հրապարակված հետազոտությունները ցույց են տալիս մեթիլենային կապույտի ազդեցությունները յուրաքանչյուր օղակում, բայց ապացույցները ստացվել են տարբեր փորձարարական համակարգերում, տարբեր կոնցենտրացիաներով և տարբեր իզոֆորմների համար։ Մի օղակում ստացված արդյունքը չի ապացուցում ազդեցություն մյուսում։

Դասական շղթան՝ պարզ շարադրանքով

Արյունատար անոթի պատում ստանդարտ հաջորդականությունն այսպիսին է։ Խթանն ազդում է էնդոթելային բջջի վրա։ Էնդոթելային ազոտի օքսիդի սինթազը, որը կոչվում է eNOS կամ NOS3, արտադրում է ազոտի օքսիդի փոքր իմպուլս։ Գազը դիֆուզիայի միջոցով անցնում է հարևան հարթ մկանային բջիջ, կապվում լուծելի գուանիլատ ցիկլազի վերականգնված երկաթ պարունակող հեմին և արագացնում GTP-ի փոխակերպումը ցիկլիկ GMP-ի։ Ցիկլիկ GMP-ն ակտիվացնում է պրոտեինկինազ G-ն, կալցիումի կարգավորումը փոխվում է, և մկանը թուլանում է։

Կա նաև երկրորդ շղթա, որը պետք է դիտարկել առանձին։ Վարակման կամ ցիտոկինների ազդեցության ժամանակ բջիջներում տրանսկրիպցիայի է ենթարկվում մեկ այլ ֆերմենտի՝ ինդուցվող ազոտի օքսիդի սինթազի կամ iNOS-ի գենը։ Այն կոչվում է նաև NOS2։ Այս ֆերմենտն ապահովում է ազոտի օքսիդի ավելի մեծ և երկարատև հոսքեր, քան eNOS-ը։ Երրորդ իզոֆորմը՝ նեյրոնային NOS-ը կամ nNOS-ը, պատկանում է ևս մեկ այլ համատեքստի։ Երբ հոդվածում նշվում է ազոտի օքսիդի սինթազը՝ առանց իզոֆորմը հստակեցնելու, կանգ առեք և ստուգեք, թե որն է չափվել։ Մեթիլենային կապույտի միջոցով էլեկտրոնների փոխանցման ակնարկը նույն միտքն ընդգծում է օքսիդավերականգնման թիրախների համար ընդհանրապես. փոխանցող օղակն ինքնուրույն ոչինչ չի անում, և յուրաքանչյուր ծայրում գտնվող գործընկերն է որոշում արդյունքը։

Չափված ցիկլիկ GMP-ն նույնպես համակցված ցուցանիշ է, ոչ թե ֆերմենտի ակտիվության ուղղակի չափում։ Դրա մակարդակն արտացոլում է ցիկլազի միջոցով սինթեզի և ֆոսֆոդիէսթերազների միջոցով քայքայման տարբերությունը, հատկապես՝ անոթների հարթ մկաններում առկա PDE5-ի։ Հետևաբար ցիկլիկ GMP-ի նվազումը նշանակում է, որ ընկալիչին ավելի քիչ ազդանշան է հասել։ Այն ինքնին չի մատնանշում, թե որ օղակն է խափանվել։

Օղակ 1. ավելի քիչ iNOS ֆերմենտ է արտադրվում

Բակտերիալ լիպոպոլիսախարիդով, ինտերֆերոն գամմայով կամ երկուսով էլ խթանված մկան մակրոֆագներում մեթիլենային կապույտը կանխել է iNOS սպիտակուցի ակնկալվող աճը և ուժեղ ճնշել iNOS-ի տեղեկատվական ՌՆԹ-ն՝ մակրոֆագների տրանսկրիպցիայի փորձերում։ Տեղեկատվական առումով կարևոր է այն, ինչը չի փոխվել։ I kappa B alpha արգելակիչի քայքայումը, NF kappa B-ի և STAT1-ի ֆոսֆորիլացումը և այդ գործոնների տեղափոխումը կորիզ հիմնականում պահպանվել են։ Նվազել է դրանց կապումը ԴՆԹ-ին, ինչը հաստատվել է քրոմատինի իմունոպրեսիպիտացիայով՝ ցույց տալով iNOS-ի պրոմոտորում դրանց զբաղեցրած տեղերի նվազում։

Սա գենային կարգավորման ազդեցություն է, որը նախորդում է ֆերմենտի քանակի փոփոխությանը, ոչ թե արդեն գոյություն ունեցող ֆերմենտի անմիջական արգելակում։ Այն վերաբերում է բորբոքային ազդանշանմանը, որտեղ տրանսկրիպցիոն գործոնները պետք է կապվեն պրոմոտորին՝ մինչև սպիտակուցի առաջացումը։ Այն ուղղակիորեն ոչինչ չի ասում հանգստի վիճակում գտնվող անոթի կոնստիտուտիվ eNOS-ի մասին և պետք է նկարագրվի հենց այդ սահմաններում։

Օղակ 2. առկա NOS ֆերմենտն ավելի դանդաղ է գործում

Առնետների հետազոտությունն ուսումնասիրել է մեկ այլ մակարդակ։ Գիտակից արու առնետներին ներերակային տրվել է լիպոպոլիսախարիդ, իսկ երեք ժամ անց՝ կամ ֆիզիոլոգիական լուծույթ, կամ մեթիլենային կապույտ՝ 3 mg մեկ kg-ի հաշվով ներերակային։ Այնուհետև հիպոթալամուսի միջային բազալ հատվածում ազոտի օքսիդի սինթազի ակտիվությունը չափվել է նշակիր արգինինի՝ ցիտրուլինի փոխակերպմամբ՝ հիպոթալամուսում NOS-ի ակտիվության ուսումնասիրությունում։ Միայն սթրեսն ու ֆիզիոլոգիական լուծույթը հարուցել են կալցիումից անկախ որոշակի ակտիվություն, իսկ լիպոպոլիսախարիդն այն բարձրացրել է մինչև վերահսկիչ մակարդակի մոտ տասնապատիկը։ Մեթիլենային կապույտը վերացրել է երկու հարուցված բաղադրիչներն էլ։ Կալցիումից կախված կոնստիտուտիվ ակտիվությունն այդ հյուսվածքում, այդ դեղաչափի և ժամանակային կետի դեպքում չի փոխվել։

Այս արդյունքն ընկալեք ճիշտ այնպես, ինչպես այն շարադրված է. այդ պայմաններում ճնշվել է չափված iNOS-տիպի ակտիվությունը։ Սա գենի էքսպրեսիայի չափում չէ և չի ապացուցում iNOS-ի նկատմամբ մշտական ընտրողականություն՝ eNOS-ի կամ nNOS-ի համեմատ։ Մաքրված ֆերմենտների ուսումնասիրությունն ավելի է ընդգծում զգուշավորության անհրաժեշտությունը։ Մաքրված ազոտի օքսիդի սինթազի ուղղակի փորձերում մեթիլենային կապույտը լիովին արգելակել է ցիտրուլինի առաջացումը 30 միկրոմոլար կոնցենտրացիայում։ Կիսաարգելակման կոնցենտրացիան մոտ 5.3 միկրոմոլար էր՝ առանց սուպերօքսիդ դիսմուտազի, և 9.2 միկրոմոլար՝ դրա առկայությամբ, ինչպես հաղորդվել է մաքրված NOS-ի և գուանիլատ ցիկլազի համեմատությունում։ Մաքրված nNOS-ի առանձին ուսումնասիրությունը մատնանշել է ֆերմենտին կապված հեմի օքսիդացման մասնակցությունը։ Գործնական եզրակացությունն այն է, որ մեկուսացված համակարգերում NOS-ի ուղղակի արգելակումն իրական է, բայց հիպոթալամուսի արդյունքը չի կարելի տարածել ընդհանուր պնդման վրա, թե մեթիլենային կապույտն ամենուր անփոփոխ է թողնում բոլոր կոնստիտուտիվ NOS-երը։

Օղակ 3. ազոտի օքսիդը կորչում է մինչև տեղ հասնելը

Ամենահստակ ապացույցը, որ ցիկլիկ GMP-ի նվազումը կարող է բացատրվել ոչ միայն ֆերմենտի արգելակմամբ, ստացվել է ճագարի թոքային զարկերակի հարթ մկանային բջիջների կուլտուրաներում։ Փորձի կառուցվածքն ամբողջությամբ շրջանցել է էնդոգեն NOS-ը՝ անմիջապես ավելացնելով ազոտի օքսիդի դոնորներ, ապա ստուգել՝ արդյոք մեթիլենային կապույտը շարունակում է ճնշել ցիկլիկ GMP-ի պատասխանը անոթային հարթ մկաններում սուպերօքսիդի ուսումնասիրությունում։

Փորձարկվել են երեք դոնորներ՝ 1-ից 100 միկրոմոլար կոնցենտրացիաներով. S-նիտրոզո-L-ցիստեին, նատրիումի նիտրոպրուսիդ և MPANO կոչվող կայուն դեամինացված անալոգ։ Բոլորն էլ բարձրացրել են ցիկլիկ GMP-ն մոտավորապես 1.5-ից 12 անգամ։ Մեթիլենային կապույտը՝ 10 միկրոմոլար կոնցենտրացիայում, առաջին երկուսի պատասխանը ճնշել է 51-ից 100 տոկոսով, իսկ MPANO-ի պատասխանը թողել անփոփոխ։ Եթե մեթիլենային կապույտը պարզապես արգելակեր ցիկլազի կատալիտիկ կենտրոնը, դոնորների նկատմամբ այդ ընտրողականությունը դժվար կլիներ բացատրել, քանի որ երեքն էլ ի վերջո ազդում են նույն հաջորդող ֆերմենտի վրա։

Այնուհետև երեք վերահսկիչ փորձ մեխանիզմը կապել են սուպերօքսիդի հետ։ Նախ՝ քսանտինի և քսանտին օքսիդազի միջոցով արտաբջջային սուպերօքսիդի առաջացումը վերարտադրել է նույն պատկերը. CYSNO-ի և նիտրոպրուսիդի ազդեցությունն արգելակվել է, իսկ MPANO-ինը՝ պահպանվել։ Երկրորդ՝ մեթիլենային կապույտը հարթ մկանային բջիջներում առաջացրել է դեղաչափից և ժամանակից կախված սուպերօքսիդի արտադրություն, որը չափվել է ցիտոքրոմ c-ի վերականգնմամբ։ Երրորդ՝ սուպերօքսիդ դիսմուտազը լիովին կանխել է արգելակումը, իսկ կատալազը՝ ոչ։ Սա մատնանշում է սուպերօքսիդը, ոչ թե ջրածնի պերօքսիդը, որպես այդ փորձարարական համակարգում անմիջական ազդեցություն ունեցող մասնիկ։

Արժե նկարագրել նաև փորձի համատեղ կուլտուրայի տարբերակը, քանի որ այն ցույց է տալիս ազդեցության տարածական տեղակայումը։ Ծածկապակիների վրա գտնվող էնդոթելային բջիջները կարճ ժամանակ համատեղ աճեցվել են հարթ մկանային բջիջների հետ, և բազալ պայմաններում արտազատվող էնդոթելային գործոնը հարթ մկանների ցիկլիկ GMP-ն բարձրացրել է երեքից ութ անգամ։ Երկու բջջային բաժանմունքներից ցանկացածի նախնական մշակումը մեթիլենային կապույտով նվազեցրել է այդ ազդանշանը, իսկ սուպերօքսիդ դիսմուտազը մասամբ հակազդել է էնդոթելային բջիջների նախնական մշակման ազդեցությանը։ Այլ կերպ ասած՝ մեթիլենային կապույտը պարտադիր չէ, որ ընդհանրապես գործի ազդանշանն ընկալող հարթ մկանային բջջի ներսում։ Այն կարող է նվազեցնել ազդանշանը՝ փոխանցման ընթացքում հեռացնելով հաղորդիչը։ Մեթիլենային կապույտի հետազոտությունները կարդալու ուղեցույցը սա ներկայացնում է որպես ընդհանուր կանոն. նախ նշեք այն բաժանմունքը, որտեղ կատարվել է միջամտությունը, և միայն հետո՝ մոլեկուլային թիրախը։

Սա NOS-ի արգելակում անվանելը սխալ կլիներ։ Դոնորների աշխատանքի համար սինթազի փուլը չէր պահանջվում, բայց ազդանշանը, միևնույն է, նվազել էր։

Օղակ 4. ընկալիչն ինքն է ավելի թույլ արձագանքում

Լուծելի գուանիլատ ցիկլազի վրա ուղղակի ազդեցություններ գոյություն ունեն, բայց կոնցենտրացիաները կարևոր են։ Վերևում մեջբերված մաքրված ֆերմենտների համեմատությունում ազոտի օքսիդով խթանված ցիկլազի կիսաարգելակման համար պահանջվել է մեթիլենային կապույտի մոտ 60 միկրոմոլար կոնցենտրացիա՝ NOS-ի մոտ 5-ից 9 միկրոմոլար կիսաարգելակման համեմատ, իսկ նույնիսկ 1 միլիմոլարը հանգեցրել է միայն մասնակի առավելագույն արգելակման։ Սա մոտավորապես վեցից տասնմեկ անգամ տարբերություն է։ Ուստի ցածր միկրոմոլար կոնցենտրացիաներով բջջային փորձը, որում ցիկլիկ GMP-ն նվազում է, միայն այդ ցուցանիշի հիման վրա չի կարելի անվանել ցիկլազի ընտրողական արգելակում։

Ավելի ուշ օքսիդավերականգնման ուսումնասիրությունն ավելացրել է զգուշավորության երկրորդ պատճառը. մեթիլենային կապույտն ապաակտիվացրել է ազոտի օքսիդով ակտիվացված ցիկլազը մի մեխանիզմով, որը տարբերվում է հեմի երկաթի՝ օդով պարզ օքսիդացումից։ Այսպիսով՝ ընկալիչի աշխատանքը կարող է խաթարվել, բայց քիմիական մեխանիզմը դեռ վերջնականապես պարզված չէ, իսկ կոնցենտրացիաների տարբերությունը նշանակում է, որ ցածր միկրոմոլար ազդեցությունների դեպքում նախ պետք է բացառել սուպերօքսիդի և NOS-ի ազդեցությունները։ Այստեղ է տեղին նաև ֆոսֆոդիէսթերազի վերահսկումը։ Եթե քայքայումը չի չափվել կամ արգելակվել, ցիկլիկ GMP-ի կուտակման նվազումը համատեղելի է թե՛ սինթեզի նվազման, թե՛ ավելի արագ քայքայման, թե՛ երկուսի հետ միասին։

Ինչու սա չի հանգում արյան ճնշման մասին մեկ պնդման

Յուրաքանչյուր օղակ հաստատվել է տարբեր համակարգում։ Մակրոֆագների տրանսկրիպցիան հիպոթալամուսի ֆերմենտային ակտիվությունը չէ։ Լիպոպոլիսախարիդից հետո հիպոթալամուսի ակտիվությունը հանգստի վիճակում էնդոթելային տոնուսը չէ։ Համատեղ կուլտուրայում բազալ պայմաններում արտազատվող էնդոթելային գործոնը ագոնիստով խթանված անոթալայնացումը չէ։ Կուլտուրայում աճեցված թոքային զարկերակային բջիջները՝ մեթիլենային կապույտի 10 միկրոմոլար կոնցենտրացիայում, մարդու արյան շրջանառությունը չեն։ Այս ամենը միավորելով այնպիսի պնդման մեջ, թե մեթիլենային կապույտը բարձրացնում է արյան ճնշումը՝ արգելակելով ազոտի օքսիդը, կորցնում ենք հենց այն տարբերությունները, որոնք վերահսկիչ փորձերը նախատեսված էին պահպանելու համար։

Երեք ստուգում օգնում են նկարագրությունը ճշգրիտ պահել։ Նախ՝ նշեք իզոֆորմը. eNOS՝ հանգստի վիճակում անոթային տոնուսի համար, iNOS՝ հարուցված բորբոքային հոսքի համար, nNOS՝ նեյրոնային և մաքրված ֆերմենտների որոշ փորձարարական համատեքստերի համար։ Երկրորդ՝ նշեք ազոտի օքսիդի ազդանշանի աղբյուրը՝ էնդոգեն սինթեզ, բազալ էնդոթելային արտազատում կամ կոնկրետ դոնոր, օրինակ՝ CYSNO, նիտրոպրուսիդ կամ MPANO, քանի որ կայուն դոնորը դիմակայել է մեթիլենային կապույտի ազդեցությանը, իսկ անկայունները՝ ոչ։ Երրորդ՝ նշեք կոնցենտրացիան և ազդեցության վերացման ստուգումը. սուպերօքսիդ դիսմուտազով ազդեցության վերացումը մատնանշում է սուպերօքսիդի մասնակցությունը, կատալազի անարդյունավետությունը տվյալ փորձարարական համակարգում խոսում է ջրածնի պերօքսիդի մասնակցության դեմ, քսանտին օքսիդազով ազդեցության վերարտադրումը ցույց է տալիս մեխանիզմի բավարար լինելը, իսկ մաքրված ֆերմենտների փորձերը տարանջատում են կատալիզի վրա ուղղակի ազդեցությունները փոխանցման ընթացքում կորուստներից։

Համառոտ ամփոփումն այսպիսին է։ Մեթիլենային կապույտն ավելի ճիշտ է դիտարկել որպես ազոտի օքսիդից ցիկլիկ GMP տանող ազդանշանային շղթայի մի քանի կետերում միջամտող նյութ, ոչ թե որպես ցիկլազի ընտրողական արգելակիչ։ Կախված փորձարարական համակարգից և կոնցենտրացիայից՝ այն կարող է նվազեցնել iNOS-ի տրանսկրիպցիոն գործոնների կապումը, ուղղակիորեն արգելակել NOS ֆերմենտները, սուպերօքսիդի առաջացման միջոցով նվազեցնել ազոտի օքսիդի հասանելիությունը և խաթարել ազոտի օքսիդով ակտիվացված ցիկլազի աշխատանքը։ Ցիկլիկ GMP ազդանշանման դերը անոթային ուսումնասիրություններում և բջջային փորձերում օգտագործվող ազոտի օքսիդի դոնորների համեմատությունը յուրաքանչյուրը ավելի մանրամասն անդրադառնում են այդ ճյուղերից մեկին, իսկ օքսիդավերականգնման ազդեցությունները ֆերմենտային ազդեցություններից տարանջատելու մեթոդները բացատրում են, թե ինչու են այս գրականության մեջ այդքան հաճախ հանդիպում սուպերօքսիդ դիսմուտազի, կատալազի և կայուն դոնորի համակցված վերահսկիչ փորձերը։

Մեթիլենային կապույտից հետո ցիկլիկ GMP-ի ցածր արժեքը ցույց է տալիս, որ շղթան խափանվել է։ Միայն վերահսկիչ փորձերն են ասում, թե որ օղակն է կոտրվել։