Մեթիլենային կապույտը և աուտոֆագիան. AMPK, mTOR և նեյրոնային փորձեր

Պատկերացրեք՝ բջջային փորձ եք իրականացնում, ավելացնում եք մեթիլենային կապույտ և տեսնում, որ բլոտի վրա LC3-II կոչվող սպիտակուցի շերտն ավելի մուգ է դառնում։ Գայթակղիչ է հայտարարել, որ միացությունը «ուժեղացնում է աուտոֆագիան», և անցնել առաջ։ Այդ մեկնաբանությունը վաղաժամ է։ LC3-II-ի ավելի մուգ շերտը կարող է նշանակել, որ բջիջն ավելի շատ մաքրող բշտիկներ է ստեղծում, կամ որ բշտիկները կուտակվում են, քանի որ հեռացման փուլը խցանված է։ Այս երկու մեկնաբանությունները հակառակ ուղղություններ են մատնանշում, իսկ մեթիլենային կապույտի վերաբերյալ նեյրոնային հետազոտությունների գրականության մեջ կան երկու տեսակի ապացույցների օրինակներ։ Այս հոդվածում հերթով դիտարկվում է, թե յուրաքանչյուր փորձարկմամբ իրականում ինչ է չափվել։

Մակրոաուտոֆագիան՝ այստեղ ուսումնասիրվող ձևը, բջջի բաղադրիչների զանգվածային վերամշակման գործընթացն է։ Ֆագոֆոր կոչվող թաղանթային պարկը աճում է մաշված սպիտակուցների և օրգանելների շուրջ, փակվում՝ դառնալով աուտոֆագոսոմ, միաձուլվում լիզոսոմի հետ, իսկ դրա պարունակությունը քայքայվում և ազատվում է կրկնակի օգտագործման համար։ Նեյրոնները կախված են այս գործընթացից, քանի որ չեն բաժանվում և չեն կարող բաժանման միջոցով նվազեցնել վնասված բաղադրիչների բաժինը։ Երբ վերամշակումը կանգ է առնում, թափոնները կուտակվում են։ Երբ այն ընթանում է, բջիջը սթրեսի պայմաններում վերականգնում է իր կառուցանյութերը։

Ի՞նչ ցույց տվեց հիպոկամպի բջիջներով մեկ փորձը

Մակածման հիմնական հետազոտությունում օգտագործվել են մկների հիպոկամպի HT22 բջիջներ, որոնք 24 ժամ շիճուկից զրկվելու հետևանքով սթրեսի են ենթարկվել։ Այս պայմանը վերացնում է աճի գործոններն ու տրոֆիկ ազդանշանները և հարուցում թե՛ ապոպտոզ, թե՛ աուտոֆագիա։ Հետազոտողները հայտնել են, որ մեթիլենային կապույտը դոզայից կախված կերպով նվազեցրել է բջիջների մահը, և որ այս պաշտպանությունն ուղեկցվել է մակրոաուտոֆագիայի նշաններով։

Մարկերների փոփոխությունների պատկերը հստակ էր։ Մեթիլենային կապույտի մոտ 20 nM կոնցենտրացիայից սկսած՝ LC3B-ի ցրված ներկումը վերաբաշխվել է շուրջկորիզային կետային կուտակումների, իսկ LC3-I-ի և LC3-II-ի ամենաուժեղ արձագանքը դիտվել է մոտ 1 μM-ի դեպքում։ Թե՛ LC3B-I-ը, թե՛ LC3B-II-ը բարձրացել են դոզայից և ժամանակից կախված կերպով։ Կարևորն այն է, որ խումբը չի սահմանափակվել LC3-ի ստատիկ բլոտով։ Նրանք ավելացրել են 10 μM քլորոքին, որն արգելափակում է լիզոսոմային մաքրումը, և մեթիլենային կապույտով մշակված բջիջներում հայտնաբերել են LC3-II-ի ավելի բարձր մակարդակ ու կայունացած p62։ Այս պատկերը վկայում է լիզոսոմներից կախված շրջանառության, այլ ոչ թե պարզապես կուտակման օգտին։ Նրանք նաև ցույց են տվել, որ քլորոքինը մասամբ հակադարձել է հակաապոպտոտիկ ազդեցությունը, ինչը տվյալ մոդելում պաշտպանությունը կապում է աուտոֆագիայի և լիզոսոմային ուղու հետ։

Ազդանշանման արդյունքն ամենից հաճախ սխալ մեջբերվող մասն է։ AMPK ազդանշանումը, որը գնահատվել է ֆոսֆորիլացված AMPK-ի և դրա ներքևում գործող թիրախի՝ ֆոսֆորիլացված ACC-ի միջոցով, 12 և 24 ժամ անց աճել է դոզայից կախված կերպով։ AMPK-ի արգելակիչ Compound C-ն, որը կիրառվել է 20 μM կոնցենտրացիայով վերջին 4 ժամվա ընթացքում, նվազեցրել է թե՛ ACC-ի ֆոսֆորիլացումը, թե՛ LC3-ի ակտիվացումը։ Ի հակադրություն՝ ֆոսֆորիլացված mTOR-ի հայտնաբերելի ճնշում չի դիտվել։ Այսպիսով, սթրեսի ենթարկված հիպոկամպի բջիջներում հայտնաբերվել է AMPK-ի հետ կապված մակածում՝ ըստ երևույթին mTOR-ից անկախ ուղով։ Նույն պատկերը դիտվել է կենդանի մկների մոտ, որոնց մեթիլենային կապույտով մշակումը մակրոաուտոֆագիայի մարկերներ է մակածել գլխուղեղի կեղևում և հիպոկամպում։

Մակածումը դեռ ավարտված հոսք չէ

Այստեղ հասկացությունների տարբերակումը հատկապես կարևոր է։ Մակածումը նշանակում է, որ գործընթացի սկզբնական մեխանիզմներն ավելի շատ աուտոֆագոսոմներ են ստեղծում։ Հոսքը նշանակում է, որ պարունակությունն անցնում է ամբողջ ուղին՝ մեկուսացում, հասունացում, լիզոսոմի հետ միաձուլում, քայքայում, վերամշակում։ LC3-II-ի յուրաքանչյուր բարձրացում վկայում է միայն մակածման մասին, մինչև հոսքի փորձարկումը հաստատի ճանապարհի մնացած մասը։

Հոսքի ստանդարտ փորձարկման ժամանակ LC3-II-ը չափվում է լիզոսոմների կարճատև արգելափակման առկայությամբ և բացակայությամբ՝ օգտագործելով, օրինակ, բաֆիլոմիցին A1 կամ քլորոքին։ Եթե մշակումը իսկապես արագացնում է առաջացումը, ապա քայքայման արգելափակումը պետք է LC3-II-ի մակարդակն էլ ավելի բարձրացնի։ Տանդեմային mCherry-GFP-LC3 ռեպորտերը տալիս է գնահատման երկրորդ հնարավորություն. կառուցվածքները լիզոսոմի հետ միաձուլվելուց առաջ լուսարձակում են դեղին, իսկ թթվային միջավայրում GFP ազդանշանի մարման հետևանքով՝ միայն կարմիր։ Ուստի միայն կարմիր կետային կուտակումների ավելացումը վկայում է թթվային աուտոլիզոսոմների փուլ անցնելու օգտին։ p62 սպիտակուցի նվազումը կարող է հաստատել պարունակության շրջանառությունը, սակայն պետք է հաշվի առնել, որ p62-ի տրանսկրիպցիան ինքնին արձագանքում է սթրեսին և պետք է ստուգվի մՌՆԹ-ի մակարդակում։

Ստորև բերված ստուգաթերթը այս գրականության մեջ օգտագործվող յուրաքանչյուր փորձարկման համար ցույց է տալիս, թե այն ինչ է չափում և ինչ չի կարող ինքնուրույն ապացուցել։ Ընթերցողները կարող են այն կիրառել մակրոաուտոֆագիայի վերաբերյալ ցանկացած հետագա պնդման նկատմամբ, այդ թվում՝ ծոմապահության և երկարակեցության փաստարկների, որոնք հիմնվում են այս մարկերների վրա։

Ուշադրություն դարձրեք ձևակերպման մի թակարդի, որից պաշտպանում է աղյուսակը։ Ֆոսֆորիլացված ACC-ն ֆերմենտային առումով արգելակված ձևն է։ Դրա բարձրացումը ցույց է տալիս AMPK-ի ելքային ազդանշանը, ոչ թե ACC-ի ակտիվացումը։

«Մակրոաուտոֆագիայի արգելակումը վերացրեց նեյրոպաշտպանությունը» արտահայտությունը պահանջում է նույն ճշգրտությունը։ HT22 մոդելում դա նշանակում է, որ աուտոֆագիայի և լիզոսոմային ուղու խանգարումը վերացրել է շիճուկից զրկման պայմաններում մեթիլենային կապույտի տված գոյատևման առավելությունը։ Դա հաստատում է աուտոֆագիայի անհրաժեշտ կամ նպաստող դերը տվյալ բջջային մշակույթում։ Այն չի հաստատում, որ աուտոֆագիան միացության միակ պաշտպանական մեխանիզմն է, չի ապացուցում, որ քլորոքինը գործում է բացառապես աուտոֆագիայի միջոցով, իսկ պատճառահետևանքային պնդումն ամրապնդելու համար անհրաժեշտ կլիներ ATG5-ի, ATG7-ի կամ ULK1-ի գենետիկական խաթարում։

Երկու ուղի դեպի նույն մեխանիզմը

Պարզեցված սխեման օգնում է։ Էներգետիկ սթրեսը բարձրացնում է AMPK-ի ակտիվությունը, AMPK-ն ակտիվացնում է ULK1 համալիրը, և աուտոֆագիան սկսվում է։ Աճի գործոններն ու սննդանյութերը բարձրացնում են mTORC1-ի ակտիվությունը, mTORC1-ն արգելակում է ULK1-ը, և աուտոֆագիան մնում է անջատված։ ULK1-ից ներքև Beclin-1 և VPS34 համալիրը նախաձեռնում է ֆագոֆորի ձևավորումը, LC3-I-ը լիպիդացվում է՝ դառնալով LC3-II, աուտոֆագոսոմը փակվում է, միաձուլվում լիզոսոմի հետ, իսկ պարունակությունը քայքայվում է՝ p62-ի շրջանառության հետ միասին։

Սխեման այս քարտեզի վրա տեղադրում է մեթիլենային կապույտի վերաբերյալ յուրաքանչյուր արդյունք՝ հիպոկամպի արդյունքը AMPK ճյուղի կողքին, իսկ նախորդող բջիջների արդյունքը՝ mTOR ճյուղի կողքին։

Այս մոտեցումը լուծում է Xie-ի երկրորդ հետազոտության հետ թվացյալ անհամապատասխանությունը։ Առնետի բազմացող նյարդային նախորդող բջիջներում առանձին փորձով հայտնաբերվել է, որ 5 μM մեթիլենային կապույտն արգելակել է բազմացումը և նպաստել հանգստի վիճակին. Ki67-դրական բջիջների քանակը նվազել է 1-ին և 3-րդ օրերին, մինչդեռ նեյրոնային ուղղությամբ արդեն որոշված տարբերակումը մնացել է անփոփոխ։ Այնտեղ մեխանիզմն ընթացել է mTOR ազդանշանման ճնշման միջոցով՝ ընդհանուր mTOR-ի և ֆոսֆորիլացված mTOR-ի նվազումով, p70S6K-ի և 4EBP1-ի արտահայտման նվազմամբ, ինչպես նաև E1, B1, D1 և D2 ցիկլինների նվազեցված կարգավորմամբ։ Գերակշռող ֆենոտիպը նախորդող բջիջների հանգստի վիճակն էր, որը հեղինակները կապել են բջջային ծերացման ուշացման, այլ ոչ թե սթրեսի ենթարկված հիպոկամպի բջիջների փրկության հետ։

Երկու հոդվածների միջև հակասություն չկա։ AMPK-ն և mTOR-ը համատեքստի նկատմամբ զգայուն ինտեգրատորներ են, ոչ թե անփոփոխ անջատիչներ։ Սթրեսի ենթարկված, նեյրոնանման բջիջը կարող է ներգրավել AMPK-ն առանց mTOR-ի չափելի արգելակման, մինչդեռ միտոգենով խթանվող նախորդող բջիջը կարող է նույն միացությանն արձագանքել՝ դանդաղեցնելով mTOR-ից կախված աճի մեխանիզմները։ Բջջի տեսակը, սթրեսի համատեքստը, կոնցենտրացիան և ժամանակային կետը որոշում են, թե որ ճյուղն է գերակշռում։ Սա նաև բացատրում է, թե ինչու մեթիլենային կապույտի միտոքոնդրիալ էներգետիկ և օքսիդավերականգնողական ազդեցությունները պետք է դիտարկել նույն պատկերի շրջանակում։ Ինչպես նկարագրվում է նեյրոպաշտպանության մեխանիզմների ակնարկում, միացությունը գործում է որպես էլեկտրոնների այլընտրանքային փոխադրիչ, ներգրավում է հակաօքսիդանտային և հակաապոպտոտիկ ազդանշանումը, արգելակում է MAO-ն ու NOS-ը և կենսագոյացման ու աուտոֆագիայի միջոցով կապվում է միտոքոնդրիալ նորացման հետ։ Աուտոֆագիան բազմազան ազդեցությունների պատկերի մեկ ճյուղն է, ոչ թե ամբողջ պատմությունը։

Ի՞նչ չեն ցույց տալիս փորձերը

Շիճուկից զրկումը բջջային մշակույթում մոդելավորում է տրոֆիկ և նյութափոխանակային սթրեսը։ Այն չի մոդելավորում ամբողջ օրգանիզմի ծոմապահությունը. գլյուկոզան, ամինաթթուներն ու աղերը մնում են հիմնական միջավայրում, և սնվելու վարք գոյություն չունի։ Բջջային մշակույթի 20 nM-ից մինչև 5 μM կոնցենտրացիաները հնարավոր չէ թվաբանական հաշվարկով վերածել մարդկային դոզաների, քանի որ ներծծումը, սպիտակուցների հետ կապումը, օքսիդավերականգնողական վիճակը, նյութափոխանակությունը, հյուսվածքներում կուտակումը և ազդեցության տևողությունը տարբեր են։

Մարդկանց մասնակցությամբ որևէ փորձարկում չի նախագծվել՝ հիվանդների մոտ մեթիլենային կապույտով մակածված աուտոֆագիկ հոսքը ցույց տալու համար։ Մեխանիստական ապացույցները դեռ սահմանափակվում են բջջային, օրգանիզմից դուրս և կենդանիների վրա կատարված աշխատանքներով, իսկ ակնարկներում կլինիկական կիրառման անցման ապացույցները շարունակում են բնութագրվել որպես նախնական։ Այսպիսով, այս հետազոտությունները չեն ցույց տալիս, որ մեթիլենային կապույտը վերարտադրում է ծոմապահությունը, աուտոֆագիայի միջոցով երկարացնում է մարդու կյանքը կամ ապահովում է մարդու ուղեղում աուտոֆագիկ հոսքի ավարտը։ Ծոմապահությունը նմանակելու և երկարակեցության մասին պնդումները պահանջում են իրենց սեփական կլինիկական ապացույցները, իսկ մարդկանց մոտ այլ ցուցումներով մեթիլենային կապույտի փորձարկումները զուտ կապակցության ուժով չեն դառնում աուտոֆագիայի փորձարկումներ։ Սննդանյութերի պակասով պայմանավորված սթրեսի և երկարակեցության մոդելների հետազոտությունները պետք է կարդալ՝ պահպանելով այս սահմանը։

Հաջորդ հոդվածը կարդալիս հերթով կիրառեք ստուգաթերթը։ Նախ հարցրեք՝ որ ճյուղն է փոխվել՝ AMPK-ն, mTOR-ը, թե ոչ մեկը։ Հետո հարցրեք՝ արդյոք LC3-ի արդյունքն ուղեկցվել է հոսքի փորձարկմամբ, թե ներկայացվել է առանձին։ Այնուհետև ստուգեք՝ արդյոք ուղու արգելափակումը վերացրել է օգուտը, և ինչ մեթոդով։ Բոլոր երեք հարցերին պատասխանող հետազոտությունը հիմնավորել է ուժեղ մեխանիստական պնդում։ Միայն առաջինին պատասխանողը ցույց է տվել թույլատրող ազդանշան, իսկ ուղու մնացած մասը դեռ քարտեզագրված չէ։