Մեթիլեն կապույտի միտոքոնդրիալ ազդեցությունների չափումը. թթվածին, ATP և թաղանթային պոտենցիալ

Ենթադրենք՝ լաբորատորիայում մեթիլեն կապույտ են ավելացնում շնչառության խանգարում ունեցող միտոքոնդրիումներին և նկատում թթվածնի սպառման աճ։ Բնական է գրել, որ ներկանյութը վերականգնել է միտոքոնդրիալ գործառույթը։ Այդ պնդումը կարող է սխալ լինել։ Թթվածնի հոսքը, ATP-ի սինթեզը և թաղանթային պոտենցիալը երեք տարբեր հասկացություններ են։ Դրանք նույն օրգանելին են առնչվում այնպես, ինչպես պահուստավորումը, համաժամեցումը և համատեղ հասանելիությունը՝ նույն ամպային պանակին. փոխկապակցված են, բայց գործում են տարբեր կանոններով։ Մեկը մյուսի հետ շփոթելու դեպքում մեկնաբանությունը սխալ կլինի, նույնիսկ եթե բոլոր չափումները տեխնիկապես ճիշտ են։

Մեթիլեն կապույտը մեծացնում է նման շփոթության հավանականությունը, քանի որ մասնակցում է այն համակարգի աշխատանքին, որը չափվում է։ Այն օքսիդավերականգնման ցիկլերի մեջ մտնող նյութ է, որն էլեկտրոններ է ընդունում շղթայի վերին հատվածում և փոխանցում ստորին հատվածում, լիպոֆիլ կատիոն է, որը կուտակվում է էներգիայով ապահովված միտոքոնդրիումներում, և վառ կապույտ միացություն է, որը լույս է կլանում ու արձակում տարածված զոնդերի հետ նույն սպեկտրային տիրույթներում։ Միայն մեկ ցուցանիշը չի կարող արտացոլել այդ ամենը։ Բուդապեշտի միտոքոնդրիալ ուսումնասիրություններում կիրառված հուսալի մոտեցումն է չափել թթվածնի հոսքը, ATP-ի սինթեզի արագությունը, թաղանթային պոտենցիալը և ջրածնի պերօքսիդի արտազատումը՝ յուրաքանչյուր փուլում ներառելով ներկանյութին հատուկ ստուգիչ փորձեր։

Ռեսպիրոմետրիան չափում է թթվածնի հոսքը, ոչ թե էներգիայի արտադրությունը

Բարձր լուծաչափով ռեսպիրոմետրիան՝ թե՛ Oroboros Oxygraph-ով, թե՛ Seahorse արտաբջջային հոսքի վերլուծիչով, հայտնում է մեկ բան՝ որքան արագ է վերականգնվում թթվածինը։ Այն չի հայտնում, թե յուրաքանչյուր էլեկտրոնի հաշվով քանի պրոտոն է մղվել, որքան գրադիենտ է պահպանվել կամ արդյոք ATP սինթազն օգտագործել է այն։

Տերմինաբանությունը կարևոր է։ Մեկուսացված միտոքոնդրիումներում սուբստրատն առանց ADP-ի ապահովում է արտահոսքային շնչառություն, սուբստրատը՝ հագեցնող քանակով ADP-ի հետ, ցույց է տալիս օքսիդատիվ ֆոսֆորիլացման կարողությունը, իսկ ապազուգակցիչի տիտրումը՝ էլեկտրոնների փոխանցման առավելագույն կարողությունը։ Անխաթար բջիջներում Seahorse-ի համապատասխան ցուցանիշներն են բազալ շնչառությունը, օլիգոմիցինի նկատմամբ զգայուն՝ ATP-ի հետ կապված շնչառությունը, պրոտոնային արտահոսքը, FCCP-ով որոշվող առավելագույն շնչառությունը և ռոտենոնի ու անտիմիցինի նկատմամբ կայուն ոչ միտոքոնդրիալ թթվածնի սպառումը։ Seahorse-ի արդյունքները «Վիճակ 3» և «Վիճակ 4» անվանելը դրանց վերագրում է ճշգրտություն, որը տվյալ փորձարարական պատրաստուկը չի ապահովում, ինչպես հստակ ցույց է տալիս Agilent Mito Stress Test-ի շրջանակը։

Մեթիլեն կապույտը խախտում է «ավելի շատ թթվածին՝ ավելի շատ էներգիա» ինտուիտիվ կապը։ Ծովախոզուկի ուղեղի մեկուսացված միտոքոնդրիումներում 100 nM-ից 1 uM ներկանյութն ավելացրել է հանգստի վիճակում թթվածնի սպառումը գլուտամատ և մալատ, սուկցինատ ու ալֆա-գլիցերոֆոսֆատ սուբստրատների առկայությամբ։ Ալֆա-գլիցերոֆոսֆատի դեպքում աճը մոտ 64 տոկոս էր, սակայն առողջ միտոքոնդրիումներում ADP-ով խթանված շնչառությունը գրեթե չի փոխվել՝ ըստ ուղեղի մեկուսացված միտոքոնդրիումների ուսումնասիրության։ Քանի որ արտահոսքն աճել է, իսկ ADP-ով խթանված հոսքը մնացել է անփոփոխ, հաշվարկված շնչառական վերահսկման հարաբերակցությունը նվազում է։ Այդ նվազումը չի նշանակում, որ ներկանյութը վնասել է միտոքոնդրիումները։ Դա նշանակում է, որ ներկանյութը բնականոն շնչառությանը հավելել է թթվածին սպառող օքսիդավերականգնման ցիկլ։ Մեթիլեն կապույտի թթվածնի սպառման չափումը, որը հայտնում է միայն աճը, չափել է իրական քիմիական գործընթաց, բայց ոչինչ չի ասել էներգիայի պահպանման մասին։

Վերականգնման փորձերը նույն անհամապատասխանությունն են ցույց տալիս ավելի մեծ մասշտաբով։ I համալիրի արգելափակման դեպքում թթվածնի հոսքը վերականգնվել է մոտ երեք անգամ, մինչդեռ ATP-ի սինթեզը՝ ընդամենը մոտ 1.5 անգամ։ Ավելի շատ թթվածին է հասել էլեկտրոդին, բայց դրա ավելի փոքր մասն է ծառայել ATP-ի արտադրությանը։ Օքսիդատիվ ֆոսֆորիլացման բարելավման մասին ցանկացած պնդում պետք է ներառի նաև ATP-ի տվյալները՝ ցանկալի է արտահայտված ATP-ի և թթվածնի հարաբերակցությամբ՝ նշելով հայտարարի հաշվարկման ընդունված ձևը։

ATP-ի չափման մեթոդները չափում են սինթեզի արագությունը, որը պարունակության չափումը չի կարող փոխարինել

ATP-ի չափումը պատասխանում է այլ հարցի՝ որքան ATP է առաջանում ժամանակի միավորի ընթացքում։ Կինետիկ չափումը՝ լինի րոպեների ընթացքում գրանցվող լուսատտիկի լյուցիֆերազի լուսարձակումը, թե հեքսոկինազի և գլյուկոզա-6-ֆոսֆատ դեհիդրոգենազի զուգակցված փորձը՝ 340 nm-ում չափմամբ, տալիս է արագություն։ Մեկ վերջնակետում ընդհանուր ATP-ի չափումը տալիս է պարունակությունը, որն արտացոլում է սինթեզի և սպառման տարբերությունը և ինքնին քիչ բան է ասում օքսիդատիվ ֆոսֆորիլացման մասին։

Բուդապեշտի խումբը կիրառել է զուգակցված ֆերմենտային մեթոդ՝ ճնշելով ադենիլատկինազի ակտիվությունը, և պարզել, որ 1-ից 2 uM մեթիլեն կապույտը ռոտենոնով և անտիմիցինով մշակված միտոքոնդրիումներում չափավոր, բայց վիճակագրորեն նշանակալի կերպով բարձրացրել է ATP-ի արտադրությունը։ Սա իրական վերականգնում է, բայց մասնակի։ TEGDMA-ի թունավորության ուսումնասիրությունը այլ մոդելում հանգել է նույն բնույթի արդյունքի. 5 mM ատամնաբուժական մոնոմեր TEGDMA-ն I համալիրի հետ կապված շնչառությունը մոտ 286-ից իջեցրել է մինչև 28 հոսքի միավոր, իսկ 2 uM ներկանյութը այն վերականգնել է մինչև մոտ 86։

Գունավոր օքսիդավերականգնող միացության դեպքում երկու ստուգիչ փորձ պարտադիր են։ Նախ՝ կիրառեք օլիգոմիցին՝ պարզելու, թե չափված ATP-ի սինթեզի որ մասն է կախված ATP սինթազից։ Երկրորդ՝ անցկացրեք հայտնի քանակի ATP-ի հավելման վերականգնման անբջիջ ստուգում՝ ամբողջական ռեագենտի և օգտագործված ներկանյութի ճշգրիտ կոնցենտրացիաների առկայությամբ՝ առնվազն 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM և 2 uM։ Ներկանյութը կարող է կլանել արձակվող լույսը, արգելակել ազդանշան տվող ֆերմենտը կամ փոխել ռեագենտի օքսիդավերականգնման քիմիան։ Լյուցիֆերազային չափումների ընդհանուր ուղեցույցը հենց այս տեսակի միջամտությունների համար խորհուրդ է տալիս կենսաքիմիական հակաստուգումներ։ Մի՛ ենթադրեք, թե 1 uM-ի դեպքում արտեֆակտներ չկան միայն այն պատճառով, որ լուսարձակման մարումը սովորաբար ավելի ուժեղ է բարձր կոնցենտրացիաների դեպքում։

Թաղանթային պոտենցիալի զոնդերը չափում են ներկանյութի բաշխումը, ոչ թե հոսքը

Սաֆրանին O-ն, TMRM-ն ու TMRE-ն, ռոդամին 123-ը և JC-1-ը թաղանթով անցնող կատիոններ են։ Դրանք էլեկտրաքիմիական հավասարակշռության համաձայն կուտակվում են բացասական լիցքավորված մատրիքսում, ուստի ընդհանուր ֆլուորեսցենցիան անուղղակիորեն արտացոլում է պոտենցիալը՝ զոնդի տեղաբաշխման միջոցով։ Դրանցից ոչ մեկը չի չափում ATP-ն կամ էլեկտրոնների հոսքը։

Յուրաքանչյուր զոնդ ունի իր համար առավել հարմար փորձարարական պատրաստուկը։ Սաֆրանին O-ն հարմար է մեկուսացված միտոքոնդրիումների և թափանցելի դարձված բջիջների համար՝ սովորաբար մոտ 2 uM կոնցենտրացիայով, մոտ 495 nm գրգռմամբ և մոտ 585 nm արձակմամբ։ Այն աշխատում է մարման ռեժիմում, որտեղ զոնդի կլանումը փոխում է ընդհանուր ֆլուորեսցենցիան։ TMRM-ն ու TMRE-ն հարմար են անխաթար բջիջների համար՝ ցածր նանոմոլային ներբեռնմամբ և առանց մարման ռեժիմում, որտեղ ապաբևեռացումը ազատում է ներկանյութը, և միտոքոնդրիալ ֆլուորեսցենցիան նվազում է։ Բարձր ներբեռնման դեպքում ազդանշանի ուղղությունը կարող է շրջվել ինքնամարման պատճառով։ JC-1-ը տալիս է հարմար կանաչի և կարմիրի հարաբերակցություն, բայց կախված է ներբեռնումից և միտոքոնդրիալ զանգվածից, ուստի քանակական աշխատանքում զիջում է խնամքով վերահսկվող TMRM-ին։ Այս փոխզիջումներն ամփոփված են լայնորեն կիրառվող միտոքոնդրիալ թաղանթային պոտենցիալի զոնդերի ակնարկում։

Մեթիլեն կապույտը հենց աշխատանքային կոնցենտրացիաներում առաջացնում է օպտիկական միջամտություն։ Նրա կլանման տիրույթները՝ մոտ 600-ից 665 nm, համընկնում են զոնդերի կարմիր արձակման հետ, ուստի ներքին ֆիլտրի ազդեցությունները, մարումը և գրգռող լույսի կլանումը բոլորն էլ հավանական են։ Ներկանյութը նաև երկրորդ լիպոֆիլ կատիոն է, որի սեփական բաշխումը փոխվում է չափվող պոտենցիալից կախված։ Պաշտպանությունը լրացուցիչ անկախ չափումների և դատարկ նմուշների համադրությունն է՝ միայն զոնդ, միայն ներկանյութ, զոնդ՝ ներկանյութի յուրաքանչյուր կոնցենտրացիայի հետ, FCCP-ով լրիվ ապաբևեռացում՝ որպես զրոյական հղում, և ցանկալի է՝ օպտիկապես տարբեր երկրորդ զոնդ։ III համալիրի շրջանցման ուսումնասիրությունը նման նախադեպ է ստեղծել՝ անտիմիցինով և միքսոթիազոլով արգելակումից հետո թաղանթային պոտենցիալի վերականգնումը կրկնելով թե՛ սաֆրանին O-ով, թե՛ TMRM-ով և ստանալով նույն որակական վերականգնումը։ Մեկ օպտիկական ցուցիչը հուշում է։ Երկու անկախ ցուցիչները՝ ապացույց։

Երեք պատրաստուկ, երեք տարբեր հարց

Մեկուսացված միտոքոնդրիումները, թափանցելի դարձված բջիջները և անխաթար բջիջները նույն չափման մեթոդի փոխարինելի զգայունության կարգավորումներ չեն։ Դրանք տարբեր մոտեցումներ են՝ տարբեր աշխատանքային սկզբունքներով։

Մեկուսացված միտոքոնդրիումները պահպանում են էլեկտրոնների փոխադրման շղթան, ներքին թաղանթը և մատրիքսի մեխանիզմները՝ հեռացնելով պլազմային թաղանթը, ցիտոզոլը և ցանցային կառուցվածքը։ Այդ հեռացումն էլ հենց նպատակն է. սուբստրատները, ADP-ն, արգելակիչները և ներկանյութի կոնցենտրացիաները սահմանվում են ճշգրիտ, ինչը թույլ է տալիս որոշել ուղին։ Դրա գինը բնական սուբստրատային մատակարարման, ազդանշանման և պահանջարկի կորուստն է։

Թափանցելի դարձված բջիջներում միտոքոնդրիումները պահպանում են իրենց բջջային կառուցվածքի մեծ մասը, մինչդեռ արտաքինից ավելացված սուբստրատներն ու ADP-ն անցնում են բացված պլազմային թաղանթով։ Դրանք ճիշտ գործիք են բջջային միջավայրում սուբստրատային ուղու խանգարումը տեղորոշելու համար։ Չափազանց մեծ թափանցելիությունը վնասում է արտաքին թաղանթը, իսկ ցիտոզոլային կարգավորիչ բաղադրիչները լվացվում ու հեռանում են։

Անխաթար բջիջները պահպանում են ամեն ինչ՝ պլազմային թաղանթի պատնեշը, ցիտոզոլային վերականգնիչները, ներծին սուբստրատների փոխադրումը, միտոքոնդրիալ ցանցը և ATP-ի պահանջարկը։ Դրանք ամենամոտն են ֆիզիոլոգիային և ամենահեռուն՝ մեխանիզմի հստակեցմանը, քանի որ ներկանյութի կլանումը, վերականգնումը և մեկուսացված կուտակումը միասին որոշում են միտոքոնդրիումների վրա դրա արդյունավետ ազդեցությունը։

TEGDMA-ի ուսումնասիրությունը նպատակային կիրառել է բոլոր երեք մակարդակները. ուղեղի մեկուսացված միտոքոնդրիումները՝ ներկանյութով օքսիդացման և պոտենցիալի վերականգնումը ստուգելու համար, ատամի պուլպայի թափանցելի դարձված ցողունային բջիջները՝ հիմնականում խանգարումը I համալիրի հետ կապված սուբստրատների օքսիդացման մակարդակում տեղորոշելու համար, և անխաթար ցողունային բջիջները՝ ճնշված թթվածնի սպառման վրա 2 uM ներկանյութի ֆիզիոլոգիական ընդհանուր ազդեցությունը գնահատելու համար։ Տարբեր պատրաստուկներում միտոքոնդրիալ ցուցանիշները համեմատող ընթերցողների համար մեթիլեն կապույտի՝ շնչառական շղթայով էլեկտրոններ փոխանցելու մասին ուղեկցող բացատրական հոդվածը ներկայացնում է ուղու հիմքերը, իսկ մեթիլեն կապույտի շնչառական ուսումնասիրությունները մեկնաբանելու ուղեցույցը բացատրում է կոնցենտրացիաների և արգելակիչների ընտրության տրամաբանությունը։

Օքսիդավերականգնման ակտիվություն ունեցող ներկանյութի պահանջած ստուգիչ փորձերը

Օքսիդավերականգնման ցիկլերի մեջ մտնող նյութը սովորական արգելակիչից ավելի երկար ստուգիչ փորձերի ցանկ է պահանջում, քանի որ միայն ներկանյութի քիմիական ռեակցիաները կարող են նմանակել կենսաբանական գործընթացները։

Ռեսպիրոմետրիայի համար օգտագործեք միայն բուֆեր պարունակող խցիկ՝ ցուցմունքի շեղումը ստուգելու համար, բուֆեր և ներկանյութ պարունակող խցիկ՝ առանց կենսաբանական նյութի, ներկանյութ՝ չափման ընթացքում առկա ցանկացած արտաբջջային վերականգնիչի հետ, և վերջում ռոտենոն ու անտիմիցին՝ անխաթար բջիջներում ոչ միտոքոնդրիալ թթվածնի սպառումը որոշելու համար։ Նկատի ունեցեք, որ վերականգնված ներկանյութը կրկին օքսիդանում է՝ էլեկտրոններ փոխանցելով թթվածնին և առաջացնելով ջրածնի պերօքսիդ։ Հետևաբար միայն ներկանյութ պարունակող դատարկ նմուշը՝ առանց էլեկտրոնի դոնորի, թերագնահատում է անբջիջ թթվածնի սպառումը, որը ի հայտ է գալիս NADH-ի կամ NADPH-ի առկայության դեպքում։

Ջրածնի պերօքսիդի համար ոչ ընտրողական DCFDA ներկանյութերի փոխարեն նախընտրեք կալիբրացված Amplex UltraRed՝ ծովաբողկի պերօքսիդազի հետ, ստուգեք արդյունքը կատալազով և փորձարկեք լուսավորությունից կախվածությունը, քանի որ ներկանյութը լուսազգայունացուցիչ է։ Ուղեղի միտոքոնդրիումների ուսումնասիրությունը պարզել է, որ ընդամենը 100 nM ներկանյութի դեպքում պերօքսիդային բեռը աճել է ավելի քան չորս անգամ, իսկ դրա հեռացումը դանդաղել է։ Պերօքսիդն առաջացել է անմիջապես վերականգնված ներկանյութից՝ առանց սուպերօքսիդային միջանկյալ նյութի։ Զոնդի ընտրության և լուսային ստուգումների մանրամասները ներկայացված են ներկանյութերով փորձերում թթվածնի ռեակտիվ ձևերի չափման մասին ուղեկցող հոդվածում, իսկ ավելի լայն հարցը՝ երբ է պերօքսիդը գործում որպես ազդանշան, և երբ՝ որպես բեռ, քննարկվում է բջջային օքսիդավերականգնման հավասարակշռության և հակաօքսիդանտային պնդումների հետ միասին։

Ուղիների վերաբերյալ պնդումները ստուգելու համար փորձարկեք III համալիրի արգելակիչների երկու տեղամասերն էլ՝ անտիմիցին A-ն Qi տեղամասում և միքսոթիազոլը Qo տեղամասում, ինչպես նաև III համալիրից հետո կիրառեք ցիանիդ՝ IV համալիրի վերջնական արգելակման համար։ Մկների ուղեղի ավելի վաղ ուսումնասիրությունը հայտնել էր, որ ներկանյութը վերականգնում է ռոտենոնով, բայց ոչ անտիմիցինով արգելափակված շնչառությունը։ Մինչդեռ երեք տեսակների ընդգրկմամբ ավելի ուշ ուսումնասիրությունը հայտնաբերել է մասնակի վերականգնում երկու արգելակիչների դեպքում էլ և ցիտոքրոմ c-ի ուղղակի վերականգնման ապացույցներ։ Շրջանցումը դիտարկեք որպես նոր տվյալների հետ համատեղելի, ոչ թե վերջնականապես հաստատված մեխանիզմ, քանի որ ներկանյութի կոնցենտրացիան, արգելակիչի տեղամասը, սուբստրատային վիճակը և ներկանյութի բաշխումը փոխում են դիտարկվող ուղին։

Չափման մեթոդների ընտրության մատրիցա

Այս աղյուսակն օգտագործեք՝ հարցից ելնելով չափումն ընտրելու համար, ոչ թե հակառակը։

Նվազագույն համոզիչ պնդման համար ներկանյութի նույն կոնցենտրացիաները՝ 100 nM, 300 nM, 1 uM և 2 uM, պետք է կիրառվեն թթվածնի հոսքի չափումներում՝ արտահոսքի, ADP-ի, օլիգոմիցինի և ապազուգակցիչի պայմաններում, ATP-ի սինթեզի արագության չափման, ցանկալի է երկու զոնդով թաղանթային պոտենցիալի չափման և կալիբրացված պերօքսիդի արտազատման չափման ժամանակ՝ կատալազային և անբջիջ ստուգիչ փորձերով։ Ներկայացրեք փոխկապակցված ամբողջությունը՝ թթվածնի հոսք, ATP-ի սինթեզի արագություն, ATP-ի և թթվածնի հարաբերակցություն, պոտենցիալ և պերօքսիդ։ Այդ թվերից յուրաքանչյուրը միայնակ մի չափում է, որը դեռ իմաստավորման կարիք ունի։